第六章 微生物的生長與環(huán)境條件13

1、第六章第六章 微生物的生長微生物的生長 第一節(jié)第一節(jié) 微生物的個(gè)體與群體生長和繁殖微生物的個(gè)體與群體生長和繁殖 一一 微生物的個(gè)體生長與繁殖微生物的個(gè)體生長與繁殖二二 微生物的群體生長規(guī)律微生物的群體生長規(guī)律 生長就是細(xì)胞物質(zhì)有規(guī)律、不可逆增加，導(dǎo)生長就是細(xì)胞物質(zhì)有規(guī)律、不可逆增加，導(dǎo)致細(xì)胞致細(xì)胞體積體積擴(kuò)大的生物學(xué)過程。擴(kuò)大的生物學(xué)過程。生長生長是一個(gè)逐步發(fā)生的是一個(gè)逐步發(fā)生的量變量變過程過程;繁殖繁殖是一個(gè)產(chǎn)生新的生命個(gè)體的是一個(gè)產(chǎn)生新的生命個(gè)體的質(zhì)變質(zhì)變過程。過程。這種從量變到質(zhì)變的過程又稱為這種從量變到質(zhì)變的過程又稱為發(fā)育發(fā)育 在在高等生物高等生物里里生長和繁殖生長和繁殖這兩個(gè)過程可以

2、這兩個(gè)過程可以明顯分開明顯分開，但在低等特別是在，但在低等特別是在單細(xì)胞的生物單細(xì)胞的生物里，里，由于由于，這兩個(gè)，這兩個(gè)過程是過程是緊密聯(lián)系又很難劃分緊密聯(lián)系又很難劃分的過程。的過程。在微生物學(xué)中提到的在微生物學(xué)中提到的“生長生長”，一般均指，一般均指群群體生長體生長，這一點(diǎn)與研究大生物時(shí)有所不同。，這一點(diǎn)與研究大生物時(shí)有所不同。群體中個(gè)體數(shù)目的增加?？梢杂弥亓?、群體中個(gè)體數(shù)目的增加。可以用重量、體積、密度或濃度來衡量。體積、密度或濃度來衡量。個(gè)體生長個(gè)體生長微生物細(xì)胞個(gè)體吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行新微生物細(xì)胞個(gè)體吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行新陳代謝，原生質(zhì)與細(xì)胞組分的增加。陳代謝，原生質(zhì)與細(xì)胞組分的增加。群

3、體生長群體生長群體生長群體生長 = 個(gè)體生長個(gè)體生長 + 個(gè)體繁殖個(gè)體繁殖 群體生長的實(shí)質(zhì)是包含著個(gè)體細(xì)胞生長與繁群體生長的實(shí)質(zhì)是包含著個(gè)體細(xì)胞生長與繁殖交替進(jìn)行的過程。殖交替進(jìn)行的過程。一一 微生物的個(gè)體生長與繁殖微生物的個(gè)體生長與繁殖一、細(xì)菌細(xì)胞的生長一、細(xì)菌細(xì)胞的生長 細(xì)菌細(xì)胞的生長是指一個(gè)新生的細(xì)胞長大以細(xì)菌細(xì)胞的生長是指一個(gè)新生的細(xì)胞長大以及最后分裂為兩個(gè)子細(xì)胞的過程及最后分裂為兩個(gè)子細(xì)胞的過程( (二分分裂二分分裂) )。 生長周期內(nèi)主要的階段有：生長周期內(nèi)主要的階段有：染色體染色體DNADNA的復(fù)的復(fù)制和分離，制和分離，細(xì)胞壁細(xì)胞壁擴(kuò)增和細(xì)菌的擴(kuò)增和細(xì)菌的分裂分裂。細(xì)菌的生長與繁

4、殖實(shí)際是一次細(xì)胞分裂細(xì)菌的生長與繁殖實(shí)際是一次細(xì)胞分裂隔膜完全形隔膜完全形成成子細(xì)胞分離子細(xì)胞分離DNA分配和分配和隔膜開始形隔膜開始形成成 當(dāng)細(xì)菌的各種細(xì)胞當(dāng)細(xì)菌的各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)制完成之后就進(jìn)結(jié)構(gòu)復(fù)制完成之后就進(jìn)入分裂時(shí)期，此時(shí)在細(xì)入分裂時(shí)期，此時(shí)在細(xì)菌長軸的中間位置，通菌長軸的中間位置，通過細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷并伴隨過細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷并伴隨新合成的肽聚糖插入，新合成的肽聚糖插入，導(dǎo)致橫隔壁向心生長，導(dǎo)致橫隔壁向心生長，最后在中心匯合，完成最后在中心匯合，完成一次分裂，通常情況下，一次分裂，通常情況下，將一個(gè)細(xì)胞分裂成兩個(gè)將一個(gè)細(xì)胞分裂成兩個(gè)大小相等的子細(xì)胞。大小相等的子細(xì)胞。 酵母菌主要的繁殖方式是酵

5、母菌主要的繁殖方式是出芽出芽，酵母菌，酵母菌細(xì)胞的生長細(xì)胞的生長芽細(xì)胞的生長。芽細(xì)胞的生長。 酵母菌的酵母菌的細(xì)胞周期細(xì)胞周期是兩次細(xì)胞分裂之間是兩次細(xì)胞分裂之間的時(shí)間，這個(gè)周期分為的時(shí)間，這個(gè)周期分為4個(gè)時(shí)期：個(gè)時(shí)期：第一間隔期第一間隔期G G1 1DNADNA合成期合成期S S第二間隔期第二間隔期G G2 2有絲分裂期有絲分裂期MM二、酵母細(xì)胞的生長二、酵母細(xì)胞的生長 細(xì)胞分裂期細(xì)胞分裂期M 間隔期間隔期G1DNA合成期合成期S第二間隔期第二間隔期G2核膜上的紡錘體斑通過復(fù)制由一個(gè)變?yōu)閮珊四ど系募忓N體斑通過復(fù)制由一個(gè)變?yōu)閮蓚€(gè)，個(gè)，DNA開始復(fù)制，芽體出現(xiàn)。開始復(fù)制，芽體出現(xiàn)。 紡錘體斑產(chǎn)生

6、約紡錘體斑產(chǎn)生約15根微管，其中一個(gè)紡錘根微管，其中一個(gè)紡錘體斑沿核膜移動(dòng)體斑沿核膜移動(dòng)180度，從而使兩個(gè)紡錘度，從而使兩個(gè)紡錘體斑通過直線形的微管連在一起。體斑通過直線形的微管連在一起。 芽體增大，細(xì)胞核移到母細(xì)胞與芽體交界芽體增大，細(xì)胞核移到母細(xì)胞與芽體交界處，微管延長。處，微管延長。 細(xì)胞核有絲分裂，其中一個(gè)核進(jìn)入芽體，細(xì)胞核有絲分裂，其中一個(gè)核進(jìn)入芽體，芽體子細(xì)胞與母細(xì)胞之間的壁開始合成，芽體子細(xì)胞與母細(xì)胞之間的壁開始合成，隨后子細(xì)胞與母細(xì)胞分離，或暫時(shí)不分離隨后子細(xì)胞與母細(xì)胞分離，或暫時(shí)不分離（如假絲酵母屬）繼續(xù)出芽。（如假絲酵母屬）繼續(xù)出芽。 絲狀真菌的生長：從絲狀真菌的生長：從

7、孢子孢子萌發(fā)開始萌發(fā)開始，以其菌絲以其菌絲頂端延長頂端延長的方式進(jìn)行。當(dāng)菌絲伸的方式進(jìn)行。當(dāng)菌絲伸長到一定程度后就會(huì)出現(xiàn)分支。長到一定程度后就會(huì)出現(xiàn)分支。 霉菌菌絲的延伸過程：霉菌菌絲的延伸過程：“菌絲尖端生長的泡囊假設(shè)菌絲尖端生長的泡囊假設(shè)” 頂端生長需要高爾基體、頂端生長需要高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器參與。在菌絲內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器參與。在菌絲的亞頂端區(qū)富含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖的亞頂端區(qū)富含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體等細(xì)胞器。體等細(xì)胞器。 細(xì)胞膜脂肪和蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞膜脂肪和蛋白質(zhì)在亞頂端區(qū)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成后，通頂端區(qū)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成后，通過小泡囊轉(zhuǎn)移到高爾基體的近過小泡囊轉(zhuǎn)移到高爾基體的近側(cè)潴泡中，由高爾基體轉(zhuǎn)向遠(yuǎn)側(cè)潴泡

8、中，由高爾基體轉(zhuǎn)向遠(yuǎn)側(cè)時(shí)，成熟而分泌泡囊。側(cè)時(shí)，成熟而分泌泡囊。 分泌的泡囊從亞頂端區(qū)移分泌的泡囊從亞頂端區(qū)移向頂端，泡囊與細(xì)胞膜融合形向頂端，泡囊與細(xì)胞膜融合形成細(xì)胞膜。同時(shí)釋放出細(xì)胞壁成細(xì)胞膜。同時(shí)釋放出細(xì)胞壁分解酶與合成酶，分解酶使壁分解酶與合成酶，分解酶使壁組份間的鍵斷裂，合成酶催化組份間的鍵斷裂，合成酶催化合成新壁成分，并將其轉(zhuǎn)移到合成新壁成分，并將其轉(zhuǎn)移到壁區(qū)形成新壁。壁區(qū)形成新壁。 二二 微生物的群體生長規(guī)律微生物的群體生長規(guī)律一、單細(xì)胞微生物的生長曲線一、單細(xì)胞微生物的生長曲線 將少量細(xì)菌純培養(yǎng)物接種到一恒定容積的將少量細(xì)菌純培養(yǎng)物接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，并保持一定

9、的溫度、新鮮液體培養(yǎng)基中，并保持一定的溫度、pHpH和和溶解氧量，之后定時(shí)取樣測定其細(xì)菌含量。以溶解氧量，之后定時(shí)取樣測定其細(xì)菌含量。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以，以細(xì)胞數(shù)目的對數(shù)或生長細(xì)胞數(shù)目的對數(shù)或生長速度為縱坐標(biāo)作圖速度為縱坐標(biāo)作圖，所得的曲線，就是，所得的曲線，就是單細(xì)胞單細(xì)胞微生物的生長曲線微生物的生長曲線。反映了細(xì)菌在新環(huán)境中生。反映了細(xì)菌在新環(huán)境中生長繁殖至衰老死亡全過程的動(dòng)態(tài)變化情況。長繁殖至衰老死亡全過程的動(dòng)態(tài)變化情況。 一般可把典型生長曲線粗分為一般可把典型生長曲線粗分為延滯期延滯期、指數(shù)期指數(shù)期、穩(wěn)定期穩(wěn)定期和和衰亡期衰亡期4個(gè)時(shí)期。個(gè)時(shí)期。 延滯期（延滯期（）

10、指數(shù)期（指數(shù)期（）穩(wěn)定期（穩(wěn)定期（）衰亡期（衰亡期（） 延滯期延滯期指數(shù)期指數(shù)期穩(wěn)定期穩(wěn)定期衰亡期衰亡期1.1.延滯期延滯期將少量菌種接入新鮮培養(yǎng)基后，在開始一段時(shí)間內(nèi)菌數(shù)將少量菌種接入新鮮培養(yǎng)基后，在開始一段時(shí)間內(nèi)菌數(shù)不立即增加，或增加很少，生長速度接近于零的一段時(shí)不立即增加，或增加很少，生長速度接近于零的一段時(shí)期。也稱遲緩期、適應(yīng)期。期。也稱遲緩期、適應(yīng)期。微生物接種到一個(gè)新的環(huán)境，暫時(shí)缺乏分解和催微生物接種到一個(gè)新的環(huán)境，暫時(shí)缺乏分解和催化有關(guān)底物的酶，或是缺乏充足的中間代謝產(chǎn)物化有關(guān)底物的酶，或是缺乏充足的中間代謝產(chǎn)物等。為等。為適應(yīng)新的環(huán)境適應(yīng)新的環(huán)境，產(chǎn)生誘導(dǎo)酶或合成中間代，產(chǎn)生誘

11、導(dǎo)酶或合成中間代謝產(chǎn)物，就需要一段適應(yīng)期。謝產(chǎn)物，就需要一段適應(yīng)期。產(chǎn)生原因產(chǎn)生原因細(xì)胞數(shù)目雖然沒有增加，但細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞數(shù)目雖然沒有增加，但細(xì)胞內(nèi)代謝代謝十分活躍十分活躍延滯期的特點(diǎn)延滯期的特點(diǎn)生長速率接近于零；生長速率接近于零；細(xì)胞形態(tài)變大或增長，一般來說該期細(xì)胞形態(tài)變大或增長，一般來說該期細(xì)胞體積最大；細(xì)胞體積最大；細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)的RNA尤其是尤其是rRNA含量增高；含量增高；合成代謝活躍，核糖體、酶類和合成代謝活躍，核糖體、酶類和ATP的合成加速，易產(chǎn)的合成加速，易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶；生誘導(dǎo)酶；對外界不良條件反應(yīng)敏感。對外界不良條件反應(yīng)敏感。 通過遺傳學(xué)方法改變菌種的遺傳特性使遲緩期縮短；通過遺傳

12、學(xué)方法改變菌種的遺傳特性使遲緩期縮短； 利用對數(shù)生長期的細(xì)胞作為利用對數(shù)生長期的細(xì)胞作為“種子種子”； 盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組成不要相差太大；盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組成不要相差太大； 適當(dāng)擴(kuò)大接種量等方式縮短遲緩期，克服不良影響。適當(dāng)擴(kuò)大接種量等方式縮短遲緩期，克服不良影響。縮短延滯期的措施縮短延滯期的措施繁殖速度較快的菌種的延滯期一般較短！繁殖速度較快的菌種的延滯期一般較短！接種量增大可縮短甚至消除延滯期！接種量增大可縮短甚至消除延滯期！接種后培養(yǎng)基成分變化不大時(shí)延滯期較短！接種后培養(yǎng)基成分變化不大時(shí)延滯期較短！利用對數(shù)生長期的細(xì)胞作為種子！利用對數(shù)生長期的細(xì)胞作為種子！ 在在

13、細(xì)胞處于細(xì)胞處于活躍生長活躍生長中，只是中，只是分裂遲緩分裂遲緩。在此階段后期，少數(shù)細(xì)胞開始分裂，曲線略有上升。在此階段后期，少數(shù)細(xì)胞開始分裂，曲線略有上升。2 2. .對數(shù)生長期對數(shù)生長期又稱指數(shù)生長期，指生長曲線中緊接著延滯期的一段又稱指數(shù)生長期，指生長曲線中緊接著延滯期的一段細(xì)胞數(shù)以細(xì)胞數(shù)以幾何級數(shù)增長幾何級數(shù)增長的時(shí)期。的時(shí)期。 l生長速率常數(shù)生長速率常數(shù)R最大，細(xì)胞分裂時(shí)間最短；最大，細(xì)胞分裂時(shí)間最短； l細(xì)胞平衡生長，菌體內(nèi)各成分均勻；細(xì)胞平衡生長，菌體內(nèi)各成分均勻； l代謝旺盛；代謝旺盛； l對理化因素敏感；對理化因素敏感； l細(xì)胞數(shù)以幾何級數(shù)增長。細(xì)胞數(shù)以幾何級數(shù)增長。對數(shù)生長

14、期的特點(diǎn)對數(shù)生長期的特點(diǎn)延滯期延滯期指數(shù)期指數(shù)期穩(wěn)定期穩(wěn)定期衰亡期衰亡期 代時(shí)反映細(xì)菌的生長速率代時(shí)反映細(xì)菌的生長速率。 代時(shí)短，生長速率快。代時(shí)短，生長速率快。 不同種微生物，代時(shí)的變化很大。不同種微生物，代時(shí)的變化很大。 多數(shù)為多數(shù)為13 h，有些，有些 10 min；另一些幾小時(shí)到幾天。；另一些幾小時(shí)到幾天。 同一種微生物，在不同生長條件下其代時(shí)不同。同一種微生物，在不同生長條件下其代時(shí)不同。 在一定條件下，每一種微生物的代時(shí)是恒定的，在一定條件下，每一種微生物的代時(shí)是恒定的， 因此它是微生物菌種的一個(gè)重要特征。因此它是微生物菌種的一個(gè)重要特征。代時(shí)代時(shí)又稱世代時(shí)間或增代時(shí)間，指細(xì)胞每分

15、裂一次所需的時(shí)間又稱世代時(shí)間或增代時(shí)間，指細(xì)胞每分裂一次所需的時(shí)間生長速率常數(shù)生長速率常數(shù)（R）即每小時(shí)的分裂次數(shù)即每小時(shí)的分裂次數(shù)（1 1）菌種）菌種（2 2）營養(yǎng)成分）營養(yǎng)成分影響微生物代時(shí)長短的因素：影響微生物代時(shí)長短的因素：（3 3）營養(yǎng)物濃度）營養(yǎng)物濃度（4 4）培養(yǎng)溫度）培養(yǎng)溫度不同菌種的代時(shí)差別極大 菌名菌名培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)溫度代時(shí)代時(shí) E. coli（大腸桿菌）（大腸桿菌）肉湯肉湯 3717min E. coli牛奶牛奶 3712.5Enterobacter aerogenes（產(chǎn)氣腸細(xì)菌）（產(chǎn)氣腸細(xì)菌）肉湯或牛奶肉湯或牛奶 371618E. aerogenes 組合組

16、合 372944 B. Cereus（蠟狀芽孢桿菌）（蠟狀芽孢桿菌）肉湯肉湯3018 B. thermophilus（嗜熱芽孢桿菌）（嗜熱芽孢桿菌）肉湯肉湯5518.3 Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳桿菌）（嗜酸乳桿菌） 牛奶牛奶376687 Streptococcus lactis（乳酸鏈球菌）（乳酸鏈球菌）牛奶牛奶3726 S. lactis乳糖肉湯乳糖肉湯3748 Salmonella typhi（傷寒沙門氏菌）（傷寒沙門氏菌）肉湯肉湯3723.5 Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌）（褐球固氮菌） 葡萄糖葡萄糖2534446Mycob

17、acterium tuberculosis（結(jié)核分枝桿菌）組合（結(jié)核分枝桿菌）組合3779293Nitrobacter agilis（活躍硝化桿菌）（活躍硝化桿菌）組合組合271200 納米細(xì)菌納米細(xì)菌(nanobacteria) 三天才分裂三天才分裂一次；一次； 九十年代初期從地下九十年代初期從地下數(shù)公里發(fā)現(xiàn)的超微型細(xì)菌，數(shù)公里發(fā)現(xiàn)的超微型細(xì)菌，用代謝產(chǎn)生的用代謝產(chǎn)生的CO2作指標(biāo)，作指標(biāo)，計(jì)算出這些超微菌的代謝計(jì)算出這些超微菌的代謝速率僅為地上正常細(xì)菌的速率僅為地上正常細(xì)菌的10-15，有人認(rèn)為它們需要，有人認(rèn)為它們需要100年才能分裂一次。年才能分裂一次。 營養(yǎng)成分：豐富時(shí)，生長快，代時(shí)

18、短 影響生長速度及生長量。凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可影響生長速率和菌體產(chǎn)量的營養(yǎng)物，稱為生長限制因子。 營養(yǎng)物濃度一定范圍內(nèi)，生長速率與營養(yǎng)物濃度呈正比一定范圍內(nèi)，生長速率與營養(yǎng)物濃度呈正比培養(yǎng)溫度 在一定范圍，生長速率與培養(yǎng)溫度呈正相關(guān)在一定范圍，生長速率與培養(yǎng)溫度呈正相關(guān)大腸桿菌大腸桿菌 10 代時(shí)代時(shí)860分，分， 15 代時(shí)代時(shí)120 分，分， 40 代時(shí)代時(shí)17.5分。分。 營養(yǎng)物濃度對微生物生長速度和菌體產(chǎn)量的影響營養(yǎng)物濃度對微生物生長速度和菌體產(chǎn)量的影響時(shí)間時(shí)間8.0 mg/mL6.0 mg/mL4.0 mg/mL2.0 mg/mL只最大收只最大收獲量受影響獲量受影響生長速率和最

19、大收生長速率和最大收獲量受影響獲量受影響細(xì)胞數(shù)或菌體量細(xì)胞數(shù)或菌體量0.2 mg/mL 0.1 mg/mL1.0 mg/mL0.5 mg/mL對數(shù)生長期的應(yīng)用對數(shù)生長期的應(yīng)用 由于此時(shí)期的菌種比較健壯，生產(chǎn)上用作由于此時(shí)期的菌種比較健壯，生產(chǎn)上用作接種接種的最佳菌齡；的最佳菌齡； 發(fā)酵工業(yè)上盡量延長該期，以達(dá)到較高的菌體發(fā)酵工業(yè)上盡量延長該期，以達(dá)到較高的菌體密度密度 食品工業(yè)上盡量使有害微生物不能進(jìn)入此期食品工業(yè)上盡量使有害微生物不能進(jìn)入此期 是生理代謝及遺傳研究或進(jìn)行染色、形態(tài)觀察是生理代謝及遺傳研究或進(jìn)行染色、形態(tài)觀察等的良好材料。等的良好材料。 3 3. .穩(wěn)定期穩(wěn)定期 又稱恒定期或最

20、高生長期。這個(gè)時(shí)期是處于新分又稱恒定期或最高生長期。這個(gè)時(shí)期是處于新分裂增加的細(xì)胞數(shù)與衰亡的細(xì)胞數(shù)相等，或正生長與負(fù)生裂增加的細(xì)胞數(shù)與衰亡的細(xì)胞數(shù)相等，或正生長與負(fù)生長相等的動(dòng)態(tài)平衡之中。該階段培養(yǎng)液中長相等的動(dòng)態(tài)平衡之中。該階段培養(yǎng)液中活細(xì)菌數(shù)最高活細(xì)菌數(shù)最高并維持穩(wěn)定。并維持穩(wěn)定。 營養(yǎng)物尤其是營養(yǎng)物尤其是生長限制因子生長限制因子的耗盡；的耗盡； 營養(yǎng)物的比例失調(diào)，例如營養(yǎng)物的比例失調(diào)，例如CN比值不合適等；比值不合適等； 酸、醇、毒素或酸、醇、毒素或H2O2等有害代謝產(chǎn)物的累積；等有害代謝產(chǎn)物的累積； pH、氧化還原勢等理化條件越來越不適宜等。氧化還原勢等理化條件越來越不適宜等。產(chǎn)生原因

21、產(chǎn)生原因穩(wěn)定期特點(diǎn)穩(wěn)定期特點(diǎn)1. 1. 生長速率常數(shù)生長速率常數(shù)R=0R=0，即新繁殖的細(xì)胞數(shù)與，即新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡相等，菌體產(chǎn)量達(dá)到了最高點(diǎn)；衰亡相等，菌體產(chǎn)量達(dá)到了最高點(diǎn)； 2. 2. 細(xì)胞開始貯存各種儲(chǔ)藏物：如肝糖、異染細(xì)胞開始貯存各種儲(chǔ)藏物：如肝糖、異染顆粒、脂肪粒等；顆粒、脂肪粒等； 3. 3. 芽孢細(xì)菌在此階段形成芽孢；芽孢細(xì)菌在此階段形成芽孢；4. 4. 次級代謝產(chǎn)物開始增多并趨向高峰。次級代謝產(chǎn)物開始增多并趨向高峰。延滯期延滯期指數(shù)期指數(shù)期穩(wěn)定期穩(wěn)定期衰亡期衰亡期延長穩(wěn)定期的措施延長穩(wěn)定期的措施（1 1）補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)（補(bǔ)料）補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)（補(bǔ)料）（2 2）取走代謝產(chǎn)物）取走代

22、謝產(chǎn)物（3 3）調(diào)節(jié)）調(diào)節(jié)pHpH值值（4 4）調(diào)節(jié)溫度）調(diào)節(jié)溫度（5 5）對好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩）對好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩 延長穩(wěn)定生長期延長穩(wěn)定生長期，以獲得更多的菌體物質(zhì)或積，以獲得更多的菌體物質(zhì)或積累更多的代謝產(chǎn)物。累更多的代謝產(chǎn)物。4 4. .衰亡期衰亡期 營養(yǎng)物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物大量積累，營養(yǎng)物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物大量積累，細(xì)菌死亡速率超過新生速率，整個(gè)群體呈現(xiàn)出細(xì)菌死亡速率超過新生速率，整個(gè)群體呈現(xiàn)出負(fù)增長。負(fù)增長。 外界環(huán)境對繼續(xù)生長越來越不利，例如，營養(yǎng)外界環(huán)境對繼續(xù)生長越來越不利，例如，營養(yǎng)物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累等，從而引起物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物的大量

23、積累等，從而引起細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導(dǎo)致菌細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體死亡。體死亡。產(chǎn)生原因產(chǎn)生原因衰亡期的特點(diǎn)衰亡期的特點(diǎn)細(xì)菌代謝活性降低，細(xì)菌衰老并出現(xiàn)自溶，產(chǎn)細(xì)菌代謝活性降低，細(xì)菌衰老并出現(xiàn)自溶，產(chǎn)生或釋放出一些產(chǎn)物，如氨基酸、轉(zhuǎn)化酶、外生或釋放出一些產(chǎn)物，如氨基酸、轉(zhuǎn)化酶、外肽酶或抗生素等。細(xì)胞呈現(xiàn)多種形態(tài)，有時(shí)產(chǎn)肽酶或抗生素等。細(xì)胞呈現(xiàn)多種形態(tài)，有時(shí)產(chǎn)生畸形，細(xì)胞大小懸殊，有些革蘭氏染色反應(yīng)生畸形，細(xì)胞大小懸殊，有些革蘭氏染色反應(yīng)陽性菌變成陰性反應(yīng)等。陽性菌變成陰性反應(yīng)等。該時(shí)期死亡的細(xì)菌以對數(shù)方式增加，但在衰亡期的后期，該時(shí)期死亡的細(xì)菌以對數(shù)方式

24、增加，但在衰亡期的后期，由于部分細(xì)菌產(chǎn)生抗性也會(huì)使細(xì)菌死亡的速率降低。由于部分細(xì)菌產(chǎn)生抗性也會(huì)使細(xì)菌死亡的速率降低。 由于采用活菌計(jì)數(shù)比較麻煩，并要求嚴(yán)格進(jìn)行操作，否由于采用活菌計(jì)數(shù)比較麻煩，并要求嚴(yán)格進(jìn)行操作，否則不易得到準(zhǔn)確的結(jié)果，重復(fù)性也差，因此在實(shí)際工作中多則不易得到準(zhǔn)確的結(jié)果，重復(fù)性也差，因此在實(shí)際工作中多采用分光光度計(jì)測定采用分光光度計(jì)測定ODOD值的方法繪制細(xì)菌的生長曲線。值的方法繪制細(xì)菌的生長曲線。采用分光光度計(jì)測定采用分光光度計(jì)測定ODOD值的方法繪制生長曲線值的方法繪制生長曲線分光光度計(jì)測定分光光度計(jì)測定OD值的方法繪制細(xì)值的方法繪制細(xì)菌的生長曲線菌的生長曲線不能反映衰亡期

25、不能反映衰亡期微生物的二次生長微生物的二次生長 不同的微生物或同一種微生物對不同物質(zhì)的利用不同的微生物或同一種微生物對不同物質(zhì)的利用能力是不同的。能力是不同的。當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)含有速效和遲效碳源當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)含有速效和遲效碳源（或氮源）時(shí)，微生物在生長過程中會(huì)形成（或氮源）時(shí)，微生物在生長過程中會(huì)形成二次生長二次生長現(xiàn)象?，F(xiàn)象。速效碳源（或氮源）：速效碳源（或氮源）：有的物質(zhì)可直接被利用（例如，有的物質(zhì)可直接被利用（例如，葡萄糖或葡萄糖或NH4+等）；等）；遲效碳源（或氮源）：遲效碳源（或氮源）：有的需要經(jīng)過一定的適應(yīng)期后有的需要經(jīng)過一定的適應(yīng)期后才能獲得利用能力（例如，乳糖或才能獲得利用能力（

26、例如，乳糖或NO3-等）。等）。菌絲狀微生物（如放線菌、霉菌等）的生長曲線菌絲狀微生物（如放線菌、霉菌等）的生長曲線與單細(xì)胞微生物存在顯著不同，繁殖不是以幾何，與單細(xì)胞微生物存在顯著不同，繁殖不是以幾何，級數(shù)倍增，一般沒有典型的對數(shù)生長期。級數(shù)倍增，一般沒有典型的對數(shù)生長期。二、絲狀真菌的生長曲線二、絲狀真菌的生長曲線以以培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間為為橫坐標(biāo)橫坐標(biāo)以以菌絲干重菌絲干重為為縱坐標(biāo)縱坐標(biāo)作圖作圖反映反映絲狀微生物群體生長變化規(guī)律絲狀微生物群體生長變化規(guī)律的曲線的曲線生長停滯期生長停滯期迅速生長期迅速生長期衰亡期衰亡期 造成生長停滯的原因：一是孢子萌發(fā)前真正的停滯狀態(tài)，造成生長停滯的原因：一是

27、孢子萌發(fā)前真正的停滯狀態(tài)，另一種是生長已經(jīng)開始但還無法測定。另一種是生長已經(jīng)開始但還無法測定。 菌絲體干重迅速增加，其立方根與時(shí)間呈直線關(guān)系。因?yàn)榫z體干重迅速增加，其立方根與時(shí)間呈直線關(guān)系。因?yàn)樗皇菃渭?xì)胞，繁殖不是以幾何級數(shù)倍增，沒有對數(shù)生長期。它不是單細(xì)胞，繁殖不是以幾何級數(shù)倍增，沒有對數(shù)生長期。生長主要表現(xiàn)在生長主要表現(xiàn)在菌絲尖端的伸長和出現(xiàn)分支、斷裂菌絲尖端的伸長和出現(xiàn)分支、斷裂等，此時(shí)期等，此時(shí)期碳、氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)被迅速利用，菌體呼吸強(qiáng)度達(dá)到高峰，碳、氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)被迅速利用，菌體呼吸強(qiáng)度達(dá)到高峰，有的開始積累代謝產(chǎn)物。有的開始積累代謝產(chǎn)物。3. 衰亡期衰亡期 菌絲體干重下降，

28、一般在短期內(nèi)失重很快，以后變化不菌絲體干重下降，一般在短期內(nèi)失重很快，以后變化不再明顯，大多數(shù)再明顯，大多數(shù)次級代謝產(chǎn)物次級代謝產(chǎn)物在此期合成。大多數(shù)處于衰亡期在此期合成。大多數(shù)處于衰亡期的細(xì)胞都出現(xiàn)大的的細(xì)胞都出現(xiàn)大的空泡空泡。菌體自溶程度因菌種和培養(yǎng)條件而異。菌體自溶程度因菌種和培養(yǎng)條件而異。第二節(jié)第二節(jié) 微生物的生長與測定方法微生物的生長與測定方法一一 微生物的培養(yǎng)方法微生物的培養(yǎng)方法（一）好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)（一）好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)（二）液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)（二）液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)（三）分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)（三）分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)二二 獲得純培養(yǎng)體的方法獲得純培養(yǎng)體的方法三三 微生物生長的測

29、定方法微生物生長的測定方法1. 好氧培養(yǎng)好氧培養(yǎng) 氧對微生物的生命活動(dòng)有極其重要影響。好氧氧對微生物的生命活動(dòng)有極其重要影響。好氧微生物在有氧條件下才能生長，培養(yǎng)時(shí)應(yīng)不斷微生物在有氧條件下才能生長，培養(yǎng)時(shí)應(yīng)不斷供給空氣。供給空氣。 試管斜面試管斜面 、培養(yǎng)皿平板、較大型的克氏扁瓶、培養(yǎng)皿平板、較大型的克氏扁瓶、茄子瓶等茄子瓶等 一一 微生物的培養(yǎng)方法微生物的培養(yǎng)方法（一）好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)（一）好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)2. 厭氧培養(yǎng)厭氧培養(yǎng) 培養(yǎng)厭氧菌除了需要培養(yǎng)厭氧菌除了需要特殊培養(yǎng)裝置特殊培養(yǎng)裝置外，還要外，還要配制配制特殊培養(yǎng)基特殊培養(yǎng)基，既要滿足，既要滿足6種營養(yǎng)要素需種營養(yǎng)要素需求，又要在

30、其中加入求，又要在其中加入還原劑還原劑和和氧化還原電位氧化還原電位的指示劑的指示劑。主要培養(yǎng)方法有：。主要培養(yǎng)方法有：高層瓊脂柱高層瓊脂柱Hungate滾管技術(shù)滾管技術(shù)厭氧罐技術(shù)厭氧罐技術(shù) 將加有還原劑的固體或半固體培養(yǎng)基裝入試管中，以培養(yǎng)相應(yīng)的厭氧菌，在這種培養(yǎng)基中，越是深層，其氧化還原電位越低，因而越有利于厭氧菌的生長。高層瓊脂柱高層瓊脂柱. . 利用除氧銅柱來制備高純氮用以驅(qū)除小環(huán)境中的空氣，使培養(yǎng)基的配制、分裝、滅菌和儲(chǔ)存，以及菌種的接種、培養(yǎng)、觀察、分離、移種和保藏等過程始終處于高度無氧條件下，從而保證了瘤胃微生物和產(chǎn)甲烷菌等嚴(yán)格厭氧菌的存活。用這種方法制作的培養(yǎng)基稱為預(yù)還原無氧滅菌

31、培養(yǎng)基PRAS。 接種融化PRAS瓊脂培養(yǎng)基后用丁基橡膠塞封嚴(yán)平放置冰浴中均勻滾動(dòng)，使含菌培養(yǎng)基布滿在試管內(nèi)表面上，最后長出許多單菌落。Hungate滾管技術(shù)滾管技術(shù) 聚碳酸酯制成的透明罐體，上有一可用螺旋夾夾牢的罐蓋，蓋內(nèi)中央可放置鈀催化劑，罐內(nèi)放一含美藍(lán)的氧化還原指示劑。罐內(nèi)可放置10個(gè)常用培養(yǎng)皿或試管。裝入待培養(yǎng)對象后，密閉罐蓋，抽真空-灌氮-抽真空-灌氮-抽真空-灌混合氣（氮?dú)猓憾趸迹簹錃?80：10：10，體積比）。罐內(nèi)少量剩余氧會(huì)被氫氣在催化劑作用下還原，從而造成很高的無氧狀態(tài)。 美藍(lán)還原為無色 厭氧罐技術(shù)厭氧罐技術(shù)厭氧手套箱1.1.固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)（1 1）斜面培養(yǎng)）斜面培養(yǎng)

32、 用瓊脂等固體培養(yǎng)基在試管中制成斜面，在此面用瓊脂等固體培養(yǎng)基在試管中制成斜面，在此面上對微生物進(jìn)行培養(yǎng)。上對微生物進(jìn)行培養(yǎng)。 形態(tài)觀察、菌種保藏形態(tài)觀察、菌種保藏（2 2）平板培養(yǎng)）平板培養(yǎng)將瓊脂或明膠等凝膠狀固體培養(yǎng)基制成平面狀，然將瓊脂或明膠等凝膠狀固體培養(yǎng)基制成平面狀，然后在此平面上培養(yǎng)微生物或多細(xì)胞生物的細(xì)胞、組后在此平面上培養(yǎng)微生物或多細(xì)胞生物的細(xì)胞、組織或器官，這種培養(yǎng)稱為平板培養(yǎng)。培養(yǎng)皿、克氏織或器官，這種培養(yǎng)稱為平板培養(yǎng)。培養(yǎng)皿、克氏瓶、羅氏瓶、錐形瓶等。觀察菌落形狀，檢測菌落瓶、羅氏瓶、錐形瓶等。觀察菌落形狀，檢測菌落數(shù)目，測定抗生素效價(jià)等數(shù)目，測定抗生素效價(jià)等（二）液體培

33、養(yǎng)和固體培養(yǎng)（二）液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)2.2.液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)（1 1）靜止培養(yǎng)靜止培養(yǎng)： 接種后的液體靜止不動(dòng)。接種后的液體靜止不動(dòng)。（2 2）搖瓶振蕩培養(yǎng)搖瓶振蕩培養(yǎng)：將待測菌株的單菌落接種到三：將待測菌株的單菌落接種到三角瓶培養(yǎng)液中，震蕩培養(yǎng)。通過調(diào)節(jié)震蕩速度調(diào)節(jié)角瓶培養(yǎng)液中，震蕩培養(yǎng)。通過調(diào)節(jié)震蕩速度調(diào)節(jié)供氧量。供氧量。（3 3）發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)： 實(shí)驗(yàn)室較大量的通氣擴(kuò)大培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室較大量的通氣擴(kuò)大培養(yǎng)可采用罐容在可采用罐容在5-30L5-30L的小型發(fā)酵罐，以供給培養(yǎng)所需的小型發(fā)酵罐，以供給培養(yǎng)所需營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，使培養(yǎng)物均勻生長，進(jìn)而大量生營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，使培養(yǎng)物均勻生長，進(jìn)而大量

34、生產(chǎn)微生物細(xì)胞或代謝產(chǎn)物，并可在實(shí)驗(yàn)過程中得到產(chǎn)微生物細(xì)胞或代謝產(chǎn)物，并可在實(shí)驗(yàn)過程中得到必要的數(shù)據(jù)。必要的數(shù)據(jù)。工業(yè)上大型發(fā)酵罐，工業(yè)上大型發(fā)酵罐，3000m3000m3 3, ,計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制，在線計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制，在線監(jiān)測，自動(dòng)收集和分析數(shù)據(jù)。監(jiān)測，自動(dòng)收集和分析數(shù)據(jù)。fermenter分批培養(yǎng)分批培養(yǎng)（batch culture）： 將微生物置于一定容積的定量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基將微生物置于一定容積的定量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基一次性加入，不再補(bǔ)充和更換，最后一次性收獲。一次性加入，不再補(bǔ)充和更換，最后一次性收獲。培養(yǎng)基一培養(yǎng)基一次加入，不予補(bǔ)充，不再更換。次加入，不予補(bǔ)充，不再更換。連

35、續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)（continuous culture）： 在微生物培養(yǎng)的過程中，不斷地供給新鮮的營養(yǎng)物質(zhì)，在微生物培養(yǎng)的過程中，不斷地供給新鮮的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)排除老菌體及代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)的微生物長時(shí)同時(shí)排除老菌體及代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)的微生物長時(shí)間地處于對數(shù)生長期，以利于微生物的增殖速度和代謝活性間地處于對數(shù)生長期，以利于微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。培養(yǎng)過程中不斷地培養(yǎng)過程中不斷地補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)，補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)，和以和以同樣的速率同樣的速率移出培養(yǎng)物移出培養(yǎng)物（三）分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)（三）分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)的基本原理：連續(xù)培養(yǎng)的基本原理：由于對

36、典型生長曲線中穩(wěn)定期到來原因的認(rèn)識(shí)，采由于對典型生長曲線中穩(wěn)定期到來原因的認(rèn)識(shí)，采取相應(yīng)有效措施推遲其來臨，從而發(fā)展出現(xiàn)在的連續(xù)取相應(yīng)有效措施推遲其來臨，從而發(fā)展出現(xiàn)在的連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)。培養(yǎng)技術(shù)。當(dāng)微生物在單批培養(yǎng)方式下生長達(dá)到對數(shù)當(dāng)微生物在單批培養(yǎng)方式下生長達(dá)到對數(shù)期后期時(shí)，一方面以一定的速度期后期時(shí)，一方面以一定的速度流進(jìn)新鮮培養(yǎng)基流進(jìn)新鮮培養(yǎng)基并攪并攪拌，另一方面以溢流方式拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物達(dá)到，使培養(yǎng)物達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，其中的微生物就能動(dòng)態(tài)平衡，其中的微生物就能長期保持對數(shù)期長期保持對數(shù)期的平衡的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率。根據(jù)根據(jù)

37、連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)控控制方式的不同制方式的不同恒濁連續(xù)培養(yǎng)恒濁連續(xù)培養(yǎng)通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基流速，使培養(yǎng)液濁通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基流速，使培養(yǎng)液濁度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法。度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法。恒濁恒濁器器（turbidostat），不斷調(diào)節(jié)流速，不斷調(diào)節(jié)流速而使細(xì)菌培養(yǎng)液而使細(xì)菌培養(yǎng)液濁度濁度保持恒定保持恒定恒化連續(xù)培養(yǎng)恒化連續(xù)培養(yǎng)采用采用恒定流速恒定流速使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)濃度恒使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定而保持細(xì)菌生長速率恒定的方定而保持細(xì)菌生長速率恒定的方法。法。恒化器恒化器（chemostat 或或 bactogen）， 保持恒定的保持恒定的流速流速最簡單的連續(xù)培養(yǎng)裝置包括：最簡單的連續(xù)培養(yǎng)裝置包括：培養(yǎng)室培養(yǎng)室、無

38、菌培養(yǎng)基儲(chǔ)存器無菌培養(yǎng)基儲(chǔ)存器和調(diào)流速的和調(diào)流速的控制系統(tǒng)控制系統(tǒng)。 連續(xù)培養(yǎng)的主要參數(shù)連續(xù)培養(yǎng)的主要參數(shù) 稀釋率稀釋率D （h-1）：即培養(yǎng)基每）：即培養(yǎng)基每小時(shí)流過培養(yǎng)容器的體積數(shù)。小時(shí)流過培養(yǎng)容器的體積數(shù)。D= =培養(yǎng)基的流動(dòng)速率培養(yǎng)基的流動(dòng)速率 培養(yǎng)室的容積培養(yǎng)室的容積FV無菌培養(yǎng)基儲(chǔ)存器無菌培養(yǎng)基儲(chǔ)存器培養(yǎng)室培養(yǎng)室調(diào)節(jié)流速的調(diào)節(jié)流速的控制閥控制閥特點(diǎn)：特點(diǎn)：基質(zhì)過量基質(zhì)過量，微生物始終以最高速率進(jìn)行生長，微生物始終以最高速率進(jìn)行生長，并可在允許范圍內(nèi)控制不同的菌體密度；但并可在允許范圍內(nèi)控制不同的菌體密度；但工藝復(fù)雜，繁瑣。工藝復(fù)雜，繁瑣。應(yīng)用范圍：應(yīng)用范圍： 用于生產(chǎn)大量菌體、生產(chǎn)

39、與菌體生長相用于生產(chǎn)大量菌體、生產(chǎn)與菌體生長相平行的某些代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙醇等。平行的某些代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙醇等。恒濁連續(xù)培養(yǎng)恒濁連續(xù)培養(yǎng) 恒濁器（恒濁器（turbidostat）是一種根據(jù)培養(yǎng)器內(nèi)微生是一種根據(jù)培養(yǎng)器內(nèi)微生物的生長密度，借光電控物的生長密度，借光電控制系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液流速，制系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液流速，以取得菌體密度高、生長以取得菌體密度高、生長速度恒定的微生物細(xì)胞的速度恒定的微生物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)器。連續(xù)培養(yǎng)器。恒濁培養(yǎng)系統(tǒng)恒濁培養(yǎng)系統(tǒng) 1. 盛無菌培養(yǎng)基的儲(chǔ)存器盛無菌培養(yǎng)基的儲(chǔ)存器 2. 控制流速閥控制流速閥 3. 培養(yǎng)室培養(yǎng)室 4. 排出管排出管 5. 光源光源 6. 光電

40、池光電池 7. 排出物排出物 當(dāng)培養(yǎng)室中濁度超過預(yù)期數(shù)值時(shí)，流速加快，濁度降低；當(dāng)培養(yǎng)室中濁度超過預(yù)期數(shù)值時(shí)，流速加快，濁度降低；當(dāng)培養(yǎng)室中濁度低于預(yù)期數(shù)值時(shí)，流速減慢，濁度升高當(dāng)培養(yǎng)室中濁度低于預(yù)期數(shù)值時(shí)，流速減慢，濁度升高特點(diǎn)：特點(diǎn)： 維持營養(yǎng)成分的維持營養(yǎng)成分的亞適量亞適量，控制微生物生長，控制微生物生長速率。菌體生長速率恒定，菌體均一，密度穩(wěn)速率。菌體生長速率恒定，菌體均一，密度穩(wěn)定，產(chǎn)量低于最高菌體產(chǎn)量。定，產(chǎn)量低于最高菌體產(chǎn)量。遺傳學(xué)：突變株分離；遺傳學(xué)：突變株分離；生理學(xué)：不同條件下的代謝變化；生理學(xué)：不同條件下的代謝變化；生態(tài)學(xué)：模擬自然營養(yǎng)條件建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。生態(tài)學(xué)：模擬自然營

41、養(yǎng)條件建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。?yīng)用范圍：應(yīng)用范圍： 恒化連續(xù)培養(yǎng)恒化連續(xù)培養(yǎng) 恒化器（恒化器（chemostat或或bactogen） 是一種設(shè)法使培養(yǎng)液是一種設(shè)法使培養(yǎng)液流速保流速保持不變持不變，并使微生物始終在接近，并使微生物始終在接近其最高生長速率條件下進(jìn)行生長其最高生長速率條件下進(jìn)行生長繁殖繁殖的一種連續(xù)培養(yǎng)裝置。的一種連續(xù)培養(yǎng)裝置。 它通過控制它通過控制某一種營養(yǎng)物某一種營養(yǎng)物的的濃度，使其始終成為濃度，使其始終成為生長限制因生長限制因子子的條件下達(dá)到的，因而可稱為的條件下達(dá)到的，因而可稱為外控制式的連續(xù)培養(yǎng)裝置。外控制式的連續(xù)培養(yǎng)裝置。 恒化培養(yǎng)系統(tǒng)恒化培養(yǎng)系統(tǒng) 1. 盛無菌培養(yǎng)基的儲(chǔ)存器盛

42、無菌培養(yǎng)基的儲(chǔ)存器 2. 控制流速閥控制流速閥 3. 培養(yǎng)室培養(yǎng)室 4. 排出管排出管 7. 排出物排出物 連續(xù)發(fā)酵與單批發(fā)酵相比的優(yōu)點(diǎn)：連續(xù)發(fā)酵與單批發(fā)酵相比的優(yōu)點(diǎn)：（1）高效高效，簡化了裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵，簡化了裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵 罐等單元操作，從而罐等單元操作，從而縮短生產(chǎn)周期，提高設(shè)縮短生產(chǎn)周期，提高設(shè) 備利用率備利用率；（2）自控自控，便于利用各種儀表進(jìn)行自動(dòng)控制；，便于利用各種儀表進(jìn)行自動(dòng)控制；（3）產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定；（4）節(jié)約節(jié)約，節(jié)省大量動(dòng)力、人力、水和蒸汽，節(jié)省大量動(dòng)力、人力、水和蒸汽， 且且 使水、汽、電的負(fù)荷均衡合理。使水、汽、電的負(fù)荷均衡合理。連

43、續(xù)培養(yǎng)應(yīng)用于生產(chǎn)就稱為連續(xù)發(fā)酵連續(xù)培養(yǎng)應(yīng)用于生產(chǎn)就稱為連續(xù)發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵與單批發(fā)酵相比的缺點(diǎn)：連續(xù)發(fā)酵與單批發(fā)酵相比的缺點(diǎn)：（1）菌種易于退化；）菌種易于退化；（2）易于遭到雜菌污染；）易于遭到雜菌污染；（3）營養(yǎng)物利用率低于單批培養(yǎng)。）營養(yǎng)物利用率低于單批培養(yǎng)。 所以，連續(xù)發(fā)酵的生產(chǎn)時(shí)間受以上因素限制，所以，連續(xù)發(fā)酵的生產(chǎn)時(shí)間受以上因素限制，一般只能維持?jǐn)?shù)月至一般只能維持?jǐn)?shù)月至 1年。年。二二 獲得純培養(yǎng)體的方法獲得純培養(yǎng)體的方法 在自然界中哪怕是在自然界中哪怕是1 1克土壤或一滴污水，都克土壤或一滴污水，都常常生長著多種微生物，而他們總是混雜在一起常常生長著多種微生物，而他們總是混雜在一起生

44、活著。要想研究或利用其中的一種微生物，首生活著。要想研究或利用其中的一種微生物，首先必須將其從混雜的微生物類群中分離出來，進(jìn)先必須將其從混雜的微生物類群中分離出來，進(jìn)而得到只含該微生物的純培養(yǎng)。而得到只含該微生物的純培養(yǎng)。 所謂所謂純培養(yǎng)純培養(yǎng)，就是指從一個(gè)細(xì)胞或一群相同，就是指從一個(gè)細(xì)胞或一群相同的細(xì)胞繁殖得到后代。的細(xì)胞繁殖得到后代。純培養(yǎng)技術(shù)是進(jìn)行微生物學(xué)研究的重要方法純培養(yǎng)技術(shù)是進(jìn)行微生物學(xué)研究的重要方法微生物純培養(yǎng)的獲得微生物純培養(yǎng)的獲得 平皿劃線分離法平皿劃線分離法 稀釋平皿分離法稀釋平皿分離法 單細(xì)胞挑取法單細(xì)胞挑取法 （二）利用選擇性培養(yǎng)基分離法（二）利用選擇性培養(yǎng)基分離法 （

45、一）稀釋分離法（一）稀釋分離法 1. 稀釋平皿分離法稀釋平皿分離法 2.2.平皿劃線分離法平皿劃線分離法 用接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料，在用接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進(jìn)行平行劃線、扇形劃線或其他形式的無菌平板表面進(jìn)行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線連續(xù)劃線 ，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。 3. 單細(xì)胞挑取法單細(xì)胞挑取法 采取顯微分離法從混雜群體中采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單直接分離單個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞或或單個(gè)個(gè)體單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)

46、。進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。 在顯微鏡下使用單孢子分離器進(jìn)行機(jī)械操在顯微鏡下使用單孢子分離器進(jìn)行機(jī)械操作，挑取單孢子或單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。也可以采作，挑取單孢子或單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。也可以采用特制的毛細(xì)管在載玻片的瓊脂涂層上選取單用特制的毛細(xì)管在載玻片的瓊脂涂層上選取單孢子并切割下來，然后移到合適的培養(yǎng)基進(jìn)行孢子并切割下來，然后移到合適的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)。 4 4.選擇性培養(yǎng)基分離法選擇性培養(yǎng)基分離法 各種微生物對不同的化學(xué)試劑、染料、抗生各種微生物對不同的化學(xué)試劑、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用這些特性可配制素等具有不同的抵抗能力，利用這些特性可配制適合某種微生物而限制其它微生物生長的選擇培

47、適合某種微生物而限制其它微生物生長的選擇培養(yǎng)基，用它來培養(yǎng)微生物以獲得純培養(yǎng)。養(yǎng)基，用它來培養(yǎng)微生物以獲得純培養(yǎng)。 v 高溫下培養(yǎng)：高溫下培養(yǎng)： 分離嗜熱細(xì)菌；分離嗜熱細(xì)菌；v 培養(yǎng)基中不含培養(yǎng)基中不含N N： 分離固氮菌；分離固氮菌；v 培養(yǎng)基加抗生素培養(yǎng)基加抗生素：分離抗性菌；分離抗性菌；v 無氧環(huán)境下：無氧環(huán)境下： 分離厭氧菌。分離厭氧菌。微生物純培養(yǎng)分離方法的比較微生物純培養(yǎng)分離方法的比較分離方法分離方法應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍平皿劃線法平皿劃線法方法簡便，多用于分離細(xì)菌方法簡便，多用于分離細(xì)菌稀釋倒平皿法稀釋倒平皿法既可定性，又可定量，用途廣泛既可定性，又可定量，用途廣泛單細(xì)胞挑取法單細(xì)胞挑

48、取法局限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究局限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究利用選擇培養(yǎng)基法利用選擇培養(yǎng)基法適用于分離某些生理類型較特殊適用于分離某些生理類型較特殊的微生物的微生物個(gè)體計(jì)數(shù)個(gè)體計(jì)數(shù)群體重量測定群體重量測定群體生理指標(biāo)測定群體生理指標(biāo)測定評價(jià)培養(yǎng)條件、營養(yǎng)物質(zhì)等對微生物生長的影響；評價(jià)培養(yǎng)條件、營養(yǎng)物質(zhì)等對微生物生長的影響；評價(jià)不同的抗菌物質(zhì)對微生物產(chǎn)生抑制評價(jià)不同的抗菌物質(zhì)對微生物產(chǎn)生抑制( (或殺死或殺死) )作作用的效果；用的效果；客觀地反映微生物生長的規(guī)律。客觀地反映微生物生長的規(guī)律。三三 微生物生長的測定方法微生物生長的測定方法單細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)菌和酵母菌單細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)菌和酵母菌放線菌和霉菌等

49、絲狀生長的微生物放線菌和霉菌等絲狀生長的微生物計(jì)算其孢子數(shù)計(jì)算其孢子數(shù)計(jì)算各個(gè)體的數(shù)目計(jì)算各個(gè)體的數(shù)目一、計(jì)數(shù)法一、計(jì)數(shù)法1. 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法顯微鏡直接計(jì)數(shù)法2. 比濁法比濁法（一）細(xì)胞總數(shù)的測定（一）細(xì)胞總數(shù)的測定1. 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法顯微鏡直接計(jì)數(shù)法采用特殊的采用特殊的計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)板（血球計(jì)數(shù)板血球計(jì)數(shù)板或或細(xì)菌計(jì)數(shù)器細(xì)菌計(jì)數(shù)器），），在普通光學(xué)或相差在普通光學(xué)或相差顯微鏡顯微鏡下直接觀察并記錄一定下直接觀察并記錄一定體積中的平均細(xì)胞數(shù)。體積中的平均細(xì)胞數(shù)。僅適用于細(xì)菌、酵母等單細(xì)胞的微生物類群僅適用于細(xì)菌、酵母等單細(xì)胞的微生物類群血球計(jì)數(shù)板基本原理：血球計(jì)數(shù)板基本原理： 將將0.1 mm

50、3( (1/10 000 mL) )的薄層空間劃分為的薄層空間劃分為400小小格，從中均勻分布地選取格，從中均勻分布地選取80或或100小格，計(jì)數(shù)其中的小格，計(jì)數(shù)其中的細(xì)胞數(shù)目，換算成單位體積中的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞數(shù)目，換算成單位體積中的細(xì)胞數(shù)。血球計(jì)數(shù)板血球計(jì)數(shù)板 適用于個(gè)體較大細(xì)胞或顆粒，如血細(xì)胞、適用于個(gè)體較大細(xì)胞或顆粒，如血細(xì)胞、酵母菌和霉菌的孢子等酵母菌和霉菌的孢子等, 不適用于細(xì)菌等個(gè)體較小細(xì)胞。不適用于細(xì)菌等個(gè)體較小細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞太小，可用細(xì)菌細(xì)胞太小，可用Peteroff-Hauser計(jì)菌器和計(jì)菌器和Hawksley計(jì)菌器計(jì)菌器（可以使用油鏡，因此可以直接計(jì)數(shù)細(xì)菌）。（可以使用油鏡，

51、因此可以直接計(jì)數(shù)細(xì)菌）。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌；不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；不適于對運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對高的菌體濃度；需要相對高的菌體濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察。個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：快速，準(zhǔn)確，快速，準(zhǔn)確，對酵母菌可同時(shí)測定出芽率。對酵母菌可同時(shí)測定出芽率。改進(jìn)：改進(jìn)： 染色后活菌計(jì)數(shù)法染色后活菌計(jì)數(shù)法 采用特定的染色技術(shù)進(jìn)行活菌染色，然后用光學(xué)顯采用特定的染色技術(shù)進(jìn)行活菌染色，然后用光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)的方法。可分別對活菌和死菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。微鏡計(jì)數(shù)的方法?？煞謩e對活菌和死菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)菌經(jīng)細(xì)菌經(jīng)吖吖啶橙啶橙染色后，在紫外光顯微鏡下可觀察：

52、染色后，在紫外光顯微鏡下可觀察：活細(xì)胞活細(xì)胞橙色熒光橙色熒光死細(xì)胞死細(xì)胞綠色熒光綠色熒光酵母細(xì)胞采用酵母細(xì)胞采用美藍(lán)染色美藍(lán)染色酵母活細(xì)胞酵母活細(xì)胞無色；無色；酵母死細(xì)胞酵母死細(xì)胞藍(lán)色。藍(lán)色。 將已知顆粒濃度的樣品（例如血液）與待測將已知顆粒濃度的樣品（例如血液）與待測細(xì)胞濃度的樣品混勻后在顯微鏡下根據(jù)二者之間細(xì)胞濃度的樣品混勻后在顯微鏡下根據(jù)二者之間的比例直接推算待測微生物細(xì)胞濃度。的比例直接推算待測微生物細(xì)胞濃度。比例計(jì)數(shù)法比例計(jì)數(shù)法過濾計(jì)數(shù)法過濾計(jì)數(shù)法 當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的樣品當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理通過膜過濾器

53、。然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計(jì)算膜上（或一定面積中）使膜透明，再在顯微鏡下計(jì)算膜上（或一定面積中）的細(xì)菌數(shù)。的細(xì)菌數(shù)。 在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度（光密度（optical density, 即即OD）表示菌量。一表示菌量。一般對般對無色的微生物無色的微生物懸浮液進(jìn)行測定，一般選用懸浮液進(jìn)行測定，一般選用450650 nm波段。波段。2. 比濁法比濁法 實(shí)驗(yàn)測量時(shí)應(yīng)將測量值控制在菌濃度與光密度成正比實(shí)驗(yàn)測量時(shí)應(yīng)將測量值控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。的線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。 若要連續(xù)跟蹤某一培養(yǎng)物

54、的生長動(dòng)態(tài)，例如，測定若要連續(xù)跟蹤某一培養(yǎng)物的生長動(dòng)態(tài)，例如，測定生長曲線時(shí)可用帶有側(cè)臂的三角燒瓶作原位測定，即不生長曲線時(shí)可用帶有側(cè)臂的三角燒瓶作原位測定，即不必取樣。必取樣。（二）活細(xì)菌數(shù)量的測定（二）活細(xì)菌數(shù)量的測定 是一種是一種活菌計(jì)數(shù)法活菌計(jì)數(shù)法，這是一種依據(jù)活菌在，這是一種依據(jù)活菌在液體培養(yǎng)基中會(huì)使其變混或在固體培養(yǎng)基上液體培養(yǎng)基中會(huì)使其變混或在固體培養(yǎng)基上（內(nèi)）形成菌落的原理而設(shè)計(jì)。（內(nèi)）形成菌落的原理而設(shè)計(jì)。1. 稀釋平皿計(jì)數(shù)法稀釋平皿計(jì)數(shù)法3. 濃縮法（濾膜法）濃縮法（濾膜法）2. 最大概率法最大概率法1. 稀釋平皿計(jì)數(shù)法稀釋平皿計(jì)數(shù)法 在高度稀釋條件下，微生物細(xì)胞充分分在高

55、度稀釋條件下，微生物細(xì)胞充分分散形成單個(gè)細(xì)胞，每個(gè)活的單細(xì)胞均能繁殖散形成單個(gè)細(xì)胞，每個(gè)活的單細(xì)胞均能繁殖形成一個(gè)菌落，通過平皿培養(yǎng)的方法使其生形成一個(gè)菌落，通過平皿培養(yǎng)的方法使其生長，并統(tǒng)計(jì)長出的菌落數(shù)，進(jìn)而推算待測樣長，并統(tǒng)計(jì)長出的菌落數(shù)，進(jìn)而推算待測樣品中的活菌數(shù)。品中的活菌數(shù)。 迄今仍廣泛使用的活菌計(jì)數(shù)法，可反映迄今仍廣泛使用的活菌計(jì)數(shù)法，可反映樣品中樣品中活菌活菌的數(shù)量。的數(shù)量。稀釋平皿計(jì)數(shù)法：稀釋平皿計(jì)數(shù)法：樣品充分混勻；樣品充分混勻；每支移液管及涂布棒最每支移液管及涂布棒最好只接觸一個(gè)稀釋度的好只接觸一個(gè)稀釋度的菌液；菌液；同一稀釋度三個(gè)以上重同一稀釋度三個(gè)以上重復(fù)，取平均值；復(fù)

56、，取平均值；每個(gè)平板上的菌落數(shù)目每個(gè)平板上的菌落數(shù)目合適，便于準(zhǔn)確計(jì)數(shù)；合適，便于準(zhǔn)確計(jì)數(shù)；涂布涂布平板平板法法傾注平板法傾注平板法 一個(gè)菌落可能是多個(gè)細(xì)胞一起形成，一個(gè)菌落可能是多個(gè)細(xì)胞一起形成，所以在科研中一般用所以在科研中一般用菌落形成單位菌落形成單位（colony forming units， CFU）來表示，來表示，而不是直接表示為細(xì)胞數(shù)。而不是直接表示為細(xì)胞數(shù)。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 此方法最為常用，適用于此方法最為常用，適用于測定細(xì)菌、酵母測定細(xì)菌、酵母菌等單細(xì)胞微生物的生長情況菌等單細(xì)胞微生物的生長情況。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 操作較繁瑣，故要求操作者技術(shù)熟練、準(zhǔn)操作較繁瑣，故要求操作者技術(shù)熟練、

57、準(zhǔn)確，確，否則難以得到正確的結(jié)果。否則難以得到正確的結(jié)果。 不適于霉菌等多細(xì)胞微生物測定。不適于霉菌等多細(xì)胞微生物測定。技術(shù)要求：技術(shù)要求：樣品充分混勻，操作熟練快速，嚴(yán)格無樣品充分混勻，操作熟練快速，嚴(yán)格無 菌操作；菌操作；注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)：每一支吸管只用于一個(gè)稀釋度，樣品混每一支吸管只用于一個(gè)稀釋度，樣品混 勻處理，傾注平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度；勻處理，傾注平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度；適用范圍適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營養(yǎng)瓊脂中溫、好氧和兼性厭氧、能在營養(yǎng)瓊脂 上生長的微生物；上生長的微生物；誤差：誤差：主要誤差來源是多次稀釋造成的，其次還有主要誤差來源是多次稀釋造成的，其次還有 樣品內(nèi)菌體分

58、布不均勻以及不當(dāng)操作。樣品內(nèi)菌體分布不均勻以及不當(dāng)操作。2. 最大概率法最大概率法 對未知樣品進(jìn)行一系列十倍稀釋，每個(gè)稀釋度平對未知樣品進(jìn)行一系列十倍稀釋，每個(gè)稀釋度平行接種多支試管，對這些平行試管的微生物生長情況行接種多支試管，對這些平行試管的微生物生長情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，長菌的為陽性，未長菌的為陰性。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，長菌的為陽性，未長菌的為陰性。 會(huì)看到在一定稀釋度以前會(huì)看到在一定稀釋度以前平行試管中有菌生長，平行試管中有菌生長，在這些稀釋度以后平行試管中不再有菌生長。將最后在這些稀釋度以后平行試管中不再有菌生長。將最后三級有菌生長的稀釋度稱為臨界級數(shù)，三級有菌生長的稀釋度稱為臨界級數(shù)，然后根據(jù)數(shù)學(xué)然

59、后根據(jù)數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)計(jì)算出樣品中的微生物數(shù)目。統(tǒng)計(jì)計(jì)算出樣品中的微生物數(shù)目。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：主要適用于只能進(jìn)行液體培養(yǎng)的微生物，或采主要適用于只能進(jìn)行液體培養(yǎng)的微生物，或采用液體鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行直接鑒定并計(jì)數(shù)的微生物。用液體鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行直接鑒定并計(jì)數(shù)的微生物。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：結(jié)果較粗放結(jié)果較粗放。3. 濃縮法（濾膜法）濃縮法（濾膜法） 對于測定像空氣、水等體積大而且含菌濃度較對于測定像空氣、水等體積大而且含菌濃度較低的樣品中的活菌數(shù)時(shí)，應(yīng)先將待測樣品通過微孔低的樣品中的活菌數(shù)時(shí)，應(yīng)先將待測樣品通過微孔薄膜（如硝酸纖維素薄膜）過濾富集，再與膜一起薄膜（如硝酸纖維素薄膜）過濾富集，再與膜一起放到合適的培養(yǎng)基或浸

60、有培養(yǎng)液的支持物表面上培放到合適的培養(yǎng)基或浸有培養(yǎng)液的支持物表面上培養(yǎng)，最后可根究菌落數(shù)推算出樣品含菌數(shù)。養(yǎng)，最后可根究菌落數(shù)推算出樣品含菌數(shù)。 霉菌的生長表現(xiàn)為菌絲的伸長和分枝，可以以其菌落的直徑或面積作為生長的指標(biāo)。 平皿培養(yǎng)法：將霉菌接種在平皿中央，在一定的時(shí)間內(nèi)測量菌落的直徑和面積，直到菌落掩蓋全皿為止。由此可求出菌絲的平均生長速度并繪制生長曲線。缺點(diǎn)：不能反映菌絲總量。 U形管培養(yǎng)法： 將霉菌自管的一端孔口接到管內(nèi)的培養(yǎng)基上，經(jīng)一定時(shí)間間隔測菌絲長度。優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)時(shí)間長且不易污染，缺點(diǎn)是不能測菌絲總量，不易挑出菌絲和孢子作檢查，且通氣不良。（三）絲狀真菌、霉菌生長的測定（三）絲狀真菌、