第八章合成生物學(2)

1、合成生物學合成生物學Synthetic biology(概念、原理、應(yīng)用概念、原理、應(yīng)用)馬飛馬飛人工染色體人工染色體(技術(shù)技術(shù))BAC(細菌人工染色體細菌人工染色體)：Bacteria以細菌作為對象，將以細菌作為對象，將DNA片段與質(zhì)粒重組后轉(zhuǎn)片段與質(zhì)粒重組后轉(zhuǎn)入細菌中繁殖入細菌中繁殖YAC(酵母人工染色體酵母人工染色體)：Yeast以酵母作為對象以酵母作為對象PAC(噬菌體人工染色體噬菌體人工染色體)：Phagemid以噬菌體作為對象以噬菌體作為對象TAC(可轉(zhuǎn)化的細菌人工染色體可轉(zhuǎn)化的細菌人工染色體) MAC(哺乳類人工染色體哺乳類人工染色體)合成生物學應(yīng)運而生合成生物學應(yīng)運而生Synt

2、hetic BiologyWhat is Synthetic Biology? Taking an engineering approach to design and applying it to Biology 使用工程策略設(shè)計并應(yīng)用于生物學What is Synthetic Biology?1. Biology2. Chemistry3. Engineering4. Re-WritingBiologistsChemistsEngineers“Re-Writers”“The code is 3.6 billion years old. Its time for a re-write.” -

3、Tom KnightBiology“Test models by building them”合成生物學合成生物學 指人們將指人們將“基因基因”連接成網(wǎng)絡(luò)，讓細胞來連接成網(wǎng)絡(luò)，讓細胞來完成設(shè)計人員設(shè)想的各種任務(wù)。完成設(shè)計人員設(shè)想的各種任務(wù)。 例如把網(wǎng)絡(luò)同簡單的細胞相結(jié)合，可提高生物例如把網(wǎng)絡(luò)同簡單的細胞相結(jié)合，可提高生物傳感性，幫助檢查人員確定地雷或生物武器的傳感性，幫助檢查人員確定地雷或生物武器的位置。位置。 再如向網(wǎng)絡(luò)加入人體細胞，可以制成用于器官再如向網(wǎng)絡(luò)加入人體細胞，可以制成用于器官移植的完整器官。移植的完整器官。人工合成脊髓灰白質(zhì)炎病毒人工合成脊髓灰白質(zhì)炎病毒cDNA 美國紐約大學美

4、國紐約大學Wimmer 實驗室于實驗室于2002年報年報道了化學合成道了化學合成 脊髓灰白質(zhì)炎病毒脊髓灰白質(zhì)炎病毒cDNA，并用并用RNA聚合酶將它轉(zhuǎn)聚合酶將它轉(zhuǎn) 成有感染活力的病成有感染活力的病毒毒RNA。 開辟了利用已知基因組序列，不需要天然模板，開辟了利用已知基因組序列，不需要天然模板，從化合物單體合成感染性病毒的先河。從化合物單體合成感染性病毒的先河。 Wimmer從裝配平均長度為從裝配平均長度為69 bp的寡核苷的寡核苷酸入手，結(jié)合了化學合成與無細胞體系的酸入手，結(jié)合了化學合成與無細胞體系的從頭合成，用了從頭合成，用了3 年時間完成了這個劃時代年時間完成了這個劃時代的工作。的工作。V

5、enter 實驗室發(fā)展了合成基因組實驗室發(fā)展了合成基因組 X-174 噬菌體基因是單鏈環(huán)狀噬菌體基因是單鏈環(huán)狀 DNA，是歷史上第一個被純，是歷史上第一個被純化的化的DNA 分子，也是第一個被測序的分子，也是第一個被測序的DNA分子。分子。 X- 174 噬菌體對動植物無害，是合適的合成研究對象。噬菌體對動植物無害，是合適的合成研究對象。 美國美國Venter 實驗室發(fā)展了合成基因組的工作，實驗室發(fā)展了合成基因組的工作， 該實驗室只用該實驗室只用兩周就合成了兩周就合成了 X-174 噬菌體基因噬菌體基因 (5,386bp) 。 Venter實驗室的技術(shù)改進主要有：實驗室的技術(shù)改進主要有： (1

6、)用凝膠來提純寡核苷酸以減少污染；用凝膠來提純寡核苷酸以減少污染； (2) 嚴格控制退火連接溫度來防止與不正確的序列發(fā)生連嚴格控制退火連接溫度來防止與不正確的序列發(fā)生連 接；接； (3)采用聚合酶循環(huán)裝置來裝配連結(jié)產(chǎn)物。采用聚合酶循環(huán)裝置來裝配連結(jié)產(chǎn)物。合成生物學國際會議合成生物學國際會議 2004 年年6 月在美國麻省理工學院舉行了第一屆月在美國麻省理工學院舉行了第一屆 合成生物合成生物學國際會議。學國際會議。 會上除討論了科學與技術(shù)問會上除討論了科學與技術(shù)問 題外，還討論了合成生物學題外，還討論了合成生物學當前與將來的生物學風險，有關(guān)倫理學問題，以及知識產(chǎn)當前與將來的生物學風險，有關(guān)倫理學

7、問題，以及知識產(chǎn)權(quán)問題。權(quán)問題。 隨著這個領(lǐng)域的發(fā)展，對于合成生物學的安全性的考慮愈隨著這個領(lǐng)域的發(fā)展，對于合成生物學的安全性的考慮愈來愈多。來愈多。 現(xiàn)在不僅通過合成生成病毒，而且已經(jīng)可以合成細菌?，F(xiàn)在不僅通過合成生成病毒，而且已經(jīng)可以合成細菌。合成生物學開辟了設(shè)計生命的前景合成生物學開辟了設(shè)計生命的前景 一方面有可能合成模仿生命物質(zhì)特點的人一方面有可能合成模仿生命物質(zhì)特點的人工化學系統(tǒng)；另一方面也可能重新設(shè)計微工化學系統(tǒng)；另一方面也可能重新設(shè)計微生物生物 如如Keasling 實驗室向大腸桿菌中導入青蒿與酵實驗室向大腸桿菌中導入青蒿與酵母的基因，使大腸桿菌能在調(diào)節(jié)下合成青蒿素，母的基因，使

8、大腸桿菌能在調(diào)節(jié)下合成青蒿素，從而顯示了有效而價廉的治療瘧疾的前景從而顯示了有效而價廉的治療瘧疾的前景 合成生物學今后將能生成自然界不存在的新的合成生物學今后將能生成自然界不存在的新的微生物。微生物。應(yīng)用示例應(yīng)用示例 Schultz 實驗室研究向大腸桿菌蛋白質(zhì)生物合成裝置中添實驗室研究向大腸桿菌蛋白質(zhì)生物合成裝置中添入新組份，使之能通過基因生成非天然的氨基酸，結(jié)果取入新組份，使之能通過基因生成非天然的氨基酸，結(jié)果取得了成功。但是要在真核細胞做到這一點還有難度。得了成功。但是要在真核細胞做到這一點還有難度。 2003年，年，Schultz 實驗室報道了一種向酵母加實驗室報道了一種向酵母加 入非天

9、然入非天然氨基酸密碼子的方法，成功地向蛋白質(zhì)中導入了氨基酸密碼子的方法，成功地向蛋白質(zhì)中導入了5 種氨基種氨基酸。酸。 目前，能摻入到蛋白質(zhì)的非天然氨基酸已有目前，能摻入到蛋白質(zhì)的非天然氨基酸已有80多種。多種。 今后將可以直接向蛋白質(zhì)導入順磁標記、金屬結(jié)合、光敏今后將可以直接向蛋白質(zhì)導入順磁標記、金屬結(jié)合、光敏異構(gòu)化等的氨基酸，促進蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究。異構(gòu)化等的氨基酸，促進蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究。應(yīng)用示例應(yīng)用示例 Brenner 提出向細胞提出向細胞DNA中摻入天然不存中摻入天然不存在的堿基來發(fā)展人工遺傳系統(tǒng)在的堿基來發(fā)展人工遺傳系統(tǒng), 支持支持人工人工生命形式生命形式。 合成生物學也將

10、對生命起源，其他生命形合成生物學也將對生命起源，其他生命形式的研究作出貢獻。式的研究作出貢獻?？刂粕刂粕?目前，研究人員正在試圖控制細胞的行為，研制目前，研究人員正在試圖控制細胞的行為，研制不同的基因線路不同的基因線路即特別設(shè)計的、相互影響即特別設(shè)計的、相互影響的基因。的基因。 波士頓大學生物醫(yī)學工程師科林斯已研制出一種波士頓大學生物醫(yī)學工程師科林斯已研制出一種“套環(huán)開關(guān)套環(huán)開關(guān)”，所選擇的細胞功能可隨意開關(guān)。，所選擇的細胞功能可隨意開關(guān)。 加州大學生物學和物理學教授埃羅維茨等人研究加州大學生物學和物理學教授埃羅維茨等人研究出另外一種線路：出另外一種線路： 當某種特殊蛋白質(zhì)含量發(fā)生變化時

11、，細胞能在發(fā)光狀當某種特殊蛋白質(zhì)含量發(fā)生變化時，細胞能在發(fā)光狀態(tài)和非發(fā)光狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換，起到有機振蕩器的作用，態(tài)和非發(fā)光狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換，起到有機振蕩器的作用，打開了利用生物分子進行計算的大門。打開了利用生物分子進行計算的大門。 維斯維斯和加州理工學院化學工程師和加州理工學院化學工程師阿諾爾阿諾爾一一起，采用起，采用“定向進化定向進化”的方法，精細調(diào)整的方法，精細調(diào)整研制線路，將基因網(wǎng)絡(luò)插入細胞內(nèi)，有選研制線路，將基因網(wǎng)絡(luò)插入細胞內(nèi)，有選擇性地促進細胞生長。擇性地促進細胞生長。發(fā)展方向發(fā)展方向 維斯維斯目前正在研究另外一群稱為目前正在研究另外一群稱為“規(guī)則系統(tǒng)規(guī)則系統(tǒng)”的的基因，他希望細菌能估計刺激

12、物的距離，并根據(jù)基因，他希望細菌能估計刺激物的距離，并根據(jù)距離的改變做出反應(yīng)。距離的改變做出反應(yīng)。 該項研究可用來探測地雷位置該項研究可用來探測地雷位置(TNT：生物傳感器：生物傳感器)。 維斯另一項大膽的計劃是為成年干細胞編程維斯另一項大膽的計劃是為成年干細胞編程 促進某些干細胞分裂成骨細胞、肌肉細胞或軟骨細胞促進某些干細胞分裂成骨細胞、肌肉細胞或軟骨細胞等，讓細胞去修補受損的心臟或生產(chǎn)出合成膝關(guān)節(jié)。等，讓細胞去修補受損的心臟或生產(chǎn)出合成膝關(guān)節(jié)。 盡管該工作尚處初級階段，但卻是生物學調(diào)控領(lǐng)盡管該工作尚處初級階段，但卻是生物學調(diào)控領(lǐng)域中重要的進展。域中重要的進展。J. Craig Venter

13、：基因組替換：基因組替換 成功利用基因組取代技術(shù)，將一種細菌改變?yōu)榱沓晒没蚪M取代技術(shù)，將一種細菌改變?yōu)榱硪环N與之親緣關(guān)系較為緊密的另一細菌。這種由一種與之親緣關(guān)系較為緊密的另一細菌。這種由J. Craig Venter 進行的進行的 “移植移植(transplantation)”技術(shù)，有望將合成基因組插入細胞，用于生產(chǎn)合技術(shù)，有望將合成基因組插入細胞，用于生產(chǎn)合成生命。成生命。 用用Mycoplasma mycoides（蕈狀支原體（蕈狀支原體 ）的基因組）的基因組取代與之關(guān)系密切的取代與之關(guān)系密切的 Mycoplasma capricolum(山羊山羊支原體支原體)的基因組的基因組 C

14、. Lartigue et al. Genome transplantation in bacteria: Changing one species to another Science, June 28, 2007.人類歷史上第一個人造染色體合成成功人類歷史上第一個人造染色體合成成功美科學家稱美科學家稱“人造生命人造生命”技術(shù)已被掌握技術(shù)已被掌握最具爭議的美國著名科學家克雷格最具爭議的美國著名科學家克雷格文特爾宣布，他的研究小組已經(jīng)文特爾宣布，他的研究小組已經(jīng)合成出人類歷史上首個人造染色體，合成出人類歷史上首個人造染色體，并有可能創(chuàng)造出首個永久性生命并有可能創(chuàng)造出首個永久性生命形式，以此作為

15、應(yīng)對疾病和全球變暖的潛在手段形式，以此作為應(yīng)對疾病和全球變暖的潛在手段。該研究部分由美國能源部出資，希望藉此研制出新型環(huán)保燃料。由文該研究部分由美國能源部出資，希望藉此研制出新型環(huán)保燃料。由文特爾召集，諾貝爾醫(yī)學獎獲得者漢密爾頓特爾召集，諾貝爾醫(yī)學獎獲得者漢密爾頓史密斯領(lǐng)導的研究小組在史密斯領(lǐng)導的研究小組在這方面已經(jīng)進行了這方面已經(jīng)進行了5年研究。年研究。文特爾已用化學藥品在實驗室中研制出一種合成染色體。文特爾已用化學藥品在實驗室中研制出一種合成染色體。文特爾研究小組研制出的這種新型染色體即實驗室合成支原體文特爾研究小組研制出的這種新型染色體即實驗室合成支原體(Mycoplasma labor

16、atorium)，是一種經(jīng)過簡化拼接的生殖支原體，是一種經(jīng)過簡化拼接的生殖支原體(Mycoplasma genitalium)DNA序列，他們將這種合成支原體移植到序列，他們將這種合成支原體移植到活細胞中，使之在細胞中起主控作用，變換成一種新的染色體?；罴毎?，使之在細胞中起主控作用，變換成一種新的染色體。按照實驗計劃，最終這個染色體將控制這個細胞并變成一個新的生命按照實驗計劃，最終這個染色體將控制這個細胞并變成一個新的生命形式。形式。這種新單細胞生物體被命名為這種新單細胞生物體被命名為“合成器合成器”，受，受381個基因控制，包含個基因控制，包含56萬個堿基對。萬個堿基對。這些基因是維持細菌

17、生命所必備的，使它能夠攝食和這些基因是維持細菌生命所必備的，使它能夠攝食和繁殖。由于新的生物體是在現(xiàn)存生物體上搭建，其繁殖和新陳代謝仍繁殖。由于新的生物體是在現(xiàn)存生物體上搭建，其繁殖和新陳代謝仍然依賴原來生物體的胞內(nèi)機制。然依賴原來生物體的胞內(nèi)機制。從這一角度看，它并非完全意義上的新型生命形式。但這種給特定基從這一角度看，它并非完全意義上的新型生命形式。但這種給特定基因賦予特定任務(wù)的觀點已被眾多生物學家廣泛接受。因賦予特定任務(wù)的觀點已被眾多生物學家廣泛接受。 “這是人類自然科學史上一次重大進步，顯示人這是人類自然科學史上一次重大進步，顯示人類正在從閱讀基因密碼走向有能力重新編寫密碼，類正在從閱

18、讀基因密碼走向有能力重新編寫密碼，這將賦予科學家新的能力，從事以前從未做過的這將賦予科學家新的能力，從事以前從未做過的研究。研究?！?他希望這項突破有助于發(fā)展新能源，應(yīng)對氣候變化造他希望這項突破有助于發(fā)展新能源，應(yīng)對氣候變化造成的負面影響。如創(chuàng)造出具有特殊功能的新微生物，成的負面影響。如創(chuàng)造出具有特殊功能的新微生物，可被用作替代石油和煤炭的綠色燃料，或用來幫助清可被用作替代石油和煤炭的綠色燃料，或用來幫助清除危險化學物質(zhì)或輻射等；還可用來合成能吸收過多除危險化學物質(zhì)或輻射等；還可用來合成能吸收過多二氧化碳的細菌，為解決氣候變暖貢獻力量。二氧化碳的細菌，為解決氣候變暖貢獻力量。 然而制造永久生命

19、形式的前景極具爭議性，有可然而制造永久生命形式的前景極具爭議性，有可能激起道德、倫理等方面的激烈辯論。能激起道德、倫理等方面的激烈辯論。 加拿大生物倫理學組織加拿大生物倫理學組織ETC團體主任帕特團體主任帕特穆尼說，穆尼說，文特爾制造出了文特爾制造出了“一個基架，在此基架上人們幾一個基架，在此基架上人們幾乎可以制造出任何東西乎可以制造出任何東西”，“它可以用于研究新它可以用于研究新型藥物，也可以用于對人類產(chǎn)生巨大威脅的生物型藥物，也可以用于對人類產(chǎn)生巨大威脅的生物武器武器”。2009：Venter：Science 把蕈狀支原體的基因組加以改造，使它能把蕈狀支原體的基因組加以改造，使它能夠終移植

20、到山羊支原體內(nèi)，形成了一個新夠終移植到山羊支原體內(nèi)，形成了一個新的蕈狀支原體細胞。的蕈狀支原體細胞。 這也是今年這篇科研論文的雛形，在國外這也是今年這篇科研論文的雛形，在國外的科學媒體上曾經(jīng)引發(fā)熱烈的討論。的科學媒體上曾經(jīng)引發(fā)熱烈的討論。2010年的重要大事：年的重要大事： “人造生命人造生命”誕生誕生 John Craig Venter攪亂了攪亂了(生命生命)科學界科學界用化學合成的基因組構(gòu)建一個細菌細胞用化學合成的基因組構(gòu)建一個細菌細胞Venter的實驗的實驗http:/www.science- 實驗對象：蕈狀支原體。實驗對象：蕈狀支原體。 支原體是已知的可以自由生活的最小生物支原體是已知

21、的可以自由生活的最小生物,也是最小的原核細胞。也是最小的原核細胞。 是一種原核微生物是一種原核微生物, 內(nèi)部結(jié)構(gòu)很簡單，基因組僅有一百多萬堿基對，遠小內(nèi)部結(jié)構(gòu)很簡單，基因組僅有一百多萬堿基對，遠小于真核生物基因組十億級的堿基數(shù)量，這也是于真核生物基因組十億級的堿基數(shù)量，這也是Venter選擇操作它的原因。選擇操作它的原因。 Venter早在早在1995年就對生殖支原體測序，并致力于研究維持自由生命的年就對生殖支原體測序，并致力于研究維持自由生命的最小基因組。最小基因組。 在在2008年，年，Venter的團隊合成了長達的團隊合成了長達59萬堿基對的生殖支萬堿基對的生殖支原體基因組。原體基因組。

22、 此后，他們選擇生長速度更快的蕈狀支原體來做實驗。此后，他們選擇生長速度更快的蕈狀支原體來做實驗。 如果僅僅從技術(shù)上來說，如果僅僅從技術(shù)上來說，Venter做了一個無懈可擊的實驗，做了一個無懈可擊的實驗，“人造生命人造生命”思路和流程都做得無懈可擊。思路和流程都做得無懈可擊。三個步驟：合成、組裝和移植三個步驟：合成、組裝和移植 合成合成 ： 蕈狀支原體的基因組是一條大片段的蕈狀支原體的基因組是一條大片段的DNA分子，序列是分子，序列是A、T、G、C四種脫氧核糖核苷酸的排列組合。四種脫氧核糖核苷酸的排列組合。 通過實驗確定維持其生命周期的最小基因組，并加上通過實驗確定維持其生命周期的最小基因組，

23、并加上4個個“水印基因水印基因”作為標記。作為標記。 用計算機精確計算需要合成用計算機精確計算需要合成DNA分子序列，并用化學方分子序列，并用化學方法合成法合成A、T、G、C堿基，并使其按所要求序列延伸。堿基，并使其按所要求序列延伸。 這是它被稱為這是它被稱為“人造生命人造生命”或者或者“化學合成化學合成”的關(guān)鍵。的關(guān)鍵。 Venter用化學方法合成了一千多個約用化學方法合成了一千多個約1kb的的DNA片段，片段，作為這次組裝的基本材料。作為這次組裝的基本材料。 組裝：組裝： 因為合成生物學技術(shù)上的局限，不能直接合成上萬堿因為合成生物學技術(shù)上的局限，不能直接合成上萬堿基對的基對的DNA大分子，

24、所以大分子，所以Venter等人巧妙地借助啤酒等人巧妙地借助啤酒酵母和大腸桿菌的幫助，把酵母和大腸桿菌的幫助，把1Kb的的DNA分子有序準確分子有序準確的連成超過的連成超過1000kb的片段。的片段。 移植：移植： Venter等把這個合成基因組移植到不含限制性酶切系等把這個合成基因組移植到不含限制性酶切系統(tǒng)的山羊支原體中，基因組能使用后者的酶系統(tǒng)進行統(tǒng)的山羊支原體中，基因組能使用后者的酶系統(tǒng)進行自我復制，經(jīng)過多代繁殖后，長成的菌落已經(jīng)純粹由自我復制，經(jīng)過多代繁殖后，長成的菌落已經(jīng)純粹由蕈狀支原體組成。蕈狀支原體組成。Venter：“創(chuàng)造了一個計算機創(chuàng)造了一個計算機為父母的生命為父母的生命”J

25、CVI：將：將8個由個由60個核苷酸組成的個核苷酸組成的DNA片段，片段，首次人工合成實驗老鼠的線粒體基因組首次人工合成實驗老鼠的線粒體基因組 使用使用8個只含有個只含有60個核苷酸的個核苷酸的DNA片段，讓片段，讓它們同酶和化學試劑的混合物相結(jié)合，在它們同酶和化學試劑的混合物相結(jié)合，在50下孵化下孵化1小時，小時，5天內(nèi)合成出了實驗鼠天內(nèi)合成出了實驗鼠的線粒體基因組，得到的基因組能夠糾正的線粒體基因組，得到的基因組能夠糾正具有線粒體缺陷的細胞內(nèi)的異常。具有線粒體缺陷的細胞內(nèi)的異常。 用途：生物能源、生物除污用途：生物能源、生物除污 Venter下一步的計劃就是合成某種海藻基下一步的計劃就是合

26、成某種海藻基因組，這種新型海藻可以通過光合作用把因組，這種新型海藻可以通過光合作用把空氣中的二氧化碳轉(zhuǎn)化成汽油或者柴油等空氣中的二氧化碳轉(zhuǎn)化成汽油或者柴油等清潔能源，從而有效解決目前的氣候變化清潔能源，從而有效解決目前的氣候變化和能源危機。和能源危機。 疫苗、藥物、生物能源、生物除污等疫苗、藥物、生物能源、生物除污等What is Synthetic Biology?從原理角度來看從原理角度來看Synthetic BiologyUndergraduates in Synthetic Bernational Genetically Engineered Machineshttp:/p

27、/registry/index.php/Main_PageLego Assembly for DNA Parts/registry/index.php/Assembly:Standard_assemblySelf-organized Pattern FormationWhat can you make in SB?Arsenic Detector膿毒癥砷Lecture overview What weve talked about so far The study of biological systems, from compon

28、ents and interactions to dynamics Overview Our understanding of systems is complete when we can design our own DNA synthesis technologiesModifying life Biotechnology Techniques that use living organisms or parts of organisms to produce a variety of products (from medicines to industrial enzymes) Gen

29、etic Engineering Introduction of genetic changes (add, modify, delete) into an organism to achieve some goal Synthetic Biology Create novel biological functions and tools by modifying or integrating well-characterized biological components (i.e. genes, promoters) into higher order genetic networks S

30、ynthetic Biology History 1970 First gene synthesized from scratch (alanine tRNA) 1978 Nobel prize awarded to Werner Arber, Daniel Nathans and Hamilton Smith for the discovery of restriction enzymes 1978 (Boyer at UCSF) A synthetic version of the human insulin gene was constructed and inserted into t

31、he bacterium E. coli. 1980 Kary Mullis invents PCR 1991 Affymetrix chip-based oligonucleotide synthesis 2003 First iGEM competition, creation of standardized parts libraries at MITBiotechnology 1.0 Research Workflow1. Concept2. Collect DNA fragments (PCR, isolation, vendors, etc)6. Transform7. Test3

32、. Bench work5. Verify DNA4. SequenceDNA synthesis costs are dropping For example the bacteria Mycoplasma genitalium has the smallest genome out of all living cells: 517 genes over 580 kb. Minimal costs of oligo creation (not including error-checking): Mid 1990s: $1/bp = $580,000 Circa 2000: $0.35/bp

33、 = $203,000 2006: $0.11/bp = $63,800 Ambitious prediction of not-too-distant future (Church et al, 2004): $0.00005/bp = $29Synthesis lengths are increasingCommercial DNA Synthesis CompaniesData Source: Rob Carlson, U of W, SeattleBioneerSouth KoreaCinnagenTehran, IranTakara BiosciencesDalian, ChinaI

34、nqaba BiotecPretoria, South AfricaFermentasVilnius, LithuaniaBio S&T, Alpha DNA,BiocorpMontreal, CanadaGENEARTRegensberg, GermanyMWGBangalore, IndiaZelinsky InstituteMoscow, RussiaScinoPharmShan-hua, TaiwanGenosphereParis, FranceBiolegioMalden, NetherlandsAmbionAustin, TexasBiosearchNovato, Californ

35、iaBio-SynthesisLewisville, TexasChemgenesWilmington, Mass.BioSpringFrankfurt am Main, GermanyBiosourceCamarillo, CADharmaconLafaette, Co.CyberGene ABNovum, SwedenCortec DNAKingston, Ontario, CAEurogentecBelgium, U.K.DNA TechnologyAarhus, DenmarkGenemed SynthesisS. San Francisco, CADNA 2.0Menlo Park,

36、 CAMetabionMunich, GermanyMicrosynthBalgach, SwitzerlandJapan Bio ServicesJapanBlue Heron BiotechnologyBothell, WAGeneworksAdelaide, AustraliaImperial Bio-MedicChandigarh, IndiaBioserve BiotechnologiesHyderabad, IndiaGenelinkHawthorne, NY.DNA Synthesis (Caruthers method)Error Rate: 1%0.9950 = 0.6030

37、0 seconds per stepMicroarray oligonucleotide synthesisThe power of parallelismChip-based versus linear synthesisOligonucleotides synthesizedSingle-stranded fragments of 50-90nucleotides 3-overlapping next fragment by 17 nucleotides (Tm calculated 52-56)Steps 1 to 5 involve multiple rounds of PCR (he

38、ating to 95, cooling to 56, and PCR at 72).Number of rounds depends on number of fragments. Carried out by PCR machine.Final step of amplification of complete genedriven by use of excess of terminal single-stranded fragmentsPCR-based oligo ligationIn theory, the scale of synthesis is unlimitedBiotec

39、hnology 2.0 Research Workflow 1. Concept2. Design / debug/ test4. Design oligos6. Transform7. Test5. Synthesize DNA3. Run codeWhat are the implications of DNA synthesis capacity + freedom of information?The problem: “Dual Use” Research Dual use research includes life sciences research:qWith legitima

40、te scientific purpose qThat may be misused to pose a biologic threat to public health and/or national security.How easy is it to get this technology?What can we do?Number of IndividualsIndividuals IntenthonorabledishonorableBin Laden Genetics, Inc.DisgruntledResearcherGarage Bio-HackerBasicResearche

41、rRisk spectrumBasic logic circuitsBorrowing from electrical engineeringProtein Expression Basics RNA polymerase binds to promoter RNAP transcribes gene into messenger RNA Ribosome translates messenger RNA into proteinZZ PromoterZ GeneProteinTranscriptionDNATranslationMessenger RNARegulation Through

42、Repression and Induction Repressor proteins can bind to the promoter and block the RNA polymerase from performing transcription The DNA site near the promoter recognized by the repressor is called an operator The target gene can code for another repression protein enabling regulatory cascadesZ Promo

43、ter& OperatorZ GeneR GeneRRR PromoterTranscriptionTranslation DNA BindingLogic Circuits Proteins are the wires/signals Promoters + decay implement the gates Any finite-state digital circuit can be built For example, X or Y ZXYR1ZR1R1XYZ=genegenegeneTranscription-Based Inverter Protein concentrations

44、 are analogous to electrical current BUT proteins do not function in an isolated system and need to be unique0110RRZSimple Inverter Model00.80.81Input Protein ConcentrationOutput Protein ConcentrationROperatorZ GeneZRCooperativity Cooperative DNA binding is where the binding of o

45、ne protein increases the likelihood of a second protein binding Cooperativity adds more non-linearity to the system Increases switching sensitivity Improves robustness to noiseZ Promoter& OperatorZ GeneR GeneRRR PromoterTranscriptionTranslation CooperativeDNA BindingR00.80.81Inpu

46、t Protein ConcentrationOutput Protein ConcetrationNo CoopCoopCooperative Inverter ModelRROperatorZ GeneZRBioCircuit Computer-Aided DesignSPICEBioSPICEsteady statedynamicsintercellular BioSPICE: a prototype biocircuit CAD tool simulates protein and chemical concentrations intracellular circuits, inte

47、rcellular communication single cells, small cell aggregatesGenetic Circuit ElementsinputmRNAribosomepromoteroutputmRNAribosomeoperatortranslationtranscriptionRNApRBSRBSA BioSPICE Inverter Simulationinputoutputrepressorpromoter They work in vivo Flip-flop (Gardner & Collins, 2000) Ring oscillator (El

48、owitz & Leibler, 2000) However, cells are very complex environments Current modeling techniques poorly predict behavior“Proof of Concept” Circuitstime (x100 sec)ACBB_S_RA_RB_SAtime (x100 sec)time (x100 sec)RS-Latch (“flip-flop”)Ring oscillatorCellular Logic Summary Current systems are limited to les

49、s than a dozen gates Three inverter ring oscillator (Elowitz, 2000) RS latch (Gardner, 2000) Inter-cell communication (Weiss, 2001) A natural repressor-based logic technology presents serious scalability issues Scavenging natural repressor proteins is time consuming Matching natural repressor protei

50、ns to work together is difficultCellular Logic Summary Sophisticated synthetic biological systems require a scalable cellular logic technology with good cooperativity Zinc-finger proteins can be engineered to create many unique proteins relatively easily Zinc-finger proteins can be fused with dimeri

51、zation domains to increase cooperativity A cellular logic technology of only zinc-finger proteins should hopefully be easier to characterizeSingle Zinc-Finger StructureDNA Three BaseRecognition RegionZinc AtomAlphaHelixTwoBetaSheetsPoly-Finger ZFPsA.C. Jamieson, J.C. Miller, and C.O. Pabo. Drug disc

52、overy with engineered zinc-finger proteins. Nature Reviews Drug Discovery, May 2003Complex systemsQ: But if we dont fully understand all the rules of biology, how can we create anything more than basic systems?A: We can press our limits by modularizing and simplifying as much as possible. Standardiz

53、ation of Components Predictable performance Off-the-shelf Mechanical Engineering (1800s) & the manufacturing revolution (e.g. Henry Ford) Abstraction Insulate relevant characteristics from overwhelming detail Simple components that can be used in combination From Physics to Electrical Engineering (1

54、900s) Decoupling Design & Fabrication Rules insulating design process from details of fabrication Enable parts, device, and system designers to work together VLSI electronics (1970s)Enabling Synthetic BiologyCharacterization Catalog input-output characteristics of existing and new parts/devices Stan

55、dardization Physical connections Functional connections PerformancePoPSINPoPSOUTSB works via three layers of abstractionDevicesPartsSystemsAbstraction in biologyDevicesPartsSystemsBarriers- Technological- Legal- EthicalSynthetic Biology: Intellectual Property Relationship of synthetic biology to int

56、ellectual property law has been largely unexplored. The relevant research space already contains broad patents on foundational technology. Synthetic biology commons? Tools of open source property rights coupled with viral licensingSynthetic Biology: Intellectual Property What is patentable and/or co

57、pyrightable? Broad biological functions Specific sequences Specific uses Sources of uncertainty in synthetic biology as related to IPR definitions What are effects of alternate definitions of what is patentable and copyrightable on: Development of field? Efficiency? Justice? Synthetic Biology: Intel

58、lectual Property Patents on fundamental ideas in synthetic biology Example: A patent on the idea of a biological part: a piece of DNA with specific function that can be combined with another part in a predefined fashion. Such a patent would be impossible to circumvent. It represents a fundamental co

59、ncept that underpins synthetic biology. See Stanford patent on System and method for simulating operation of biochemical systems. United States Patent 5914891 Synthetic Biology: Intellectual Property Patents on fundamental biological functions Example: A patent on a genetically-encoded inverter Such

60、 a patent would be almost impossible to circumvent because it represents a basic biological function that is of use in a range of synthetic biological systems. See US Dept of Health patent on Molecular computing elements, gates and flip-flops. United States Patent 6774222 See Boston University paten