生物工程概論

1、 1.1 生物工程的產(chǎn)生及定義 1.2 生物工程的種類生物工程概念的提出 1917年匈牙利工程師提出： 用甜菜作為飼料進(jìn)行大規(guī)模養(yǎng)豬,及利用生物將原料轉(zhuǎn)化成為產(chǎn)品. 19世紀(jì)：人類有意識(shí)的利用酵母進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)：酒精、面包酵母、檸檬酸 1928年 發(fā)現(xiàn)青霉素，同時(shí)以獲取細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物抗生素為主要特征的抗生素工業(yè)成為當(dāng)時(shí)生物技術(shù)的支柱產(chǎn)業(yè)。 氨基酸發(fā)酵工業(yè)成為生物工程的一個(gè)新成員20世紀(jì)60年代 酶制劑工業(yè)的出現(xiàn) 人類基因組測(cè)序酵母基因組測(cè)序、水稻基因組測(cè)序先后基本或全部完成，使生物技術(shù)發(fā)生了巨大的革命，逐步形成了以基因工程為核心的現(xiàn)代生物技術(shù) 1917：利用生物將原材料轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品 19

2、82：應(yīng)用自然科學(xué)及工程學(xué)的原理，依靠微生物、動(dòng)物、植物作為反應(yīng)器，將物料進(jìn)行加工以提供產(chǎn)品來為社會(huì)服務(wù)的技術(shù)生物工程的定義：生物工程的定義：人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的，即現(xiàn)代生物工程技術(shù)。 基因工程 細(xì)胞工程 發(fā)酵工程 酶工程 蛋白質(zhì)工程應(yīng)用：農(nóng)業(yè)、環(huán)境、食品、醫(yī)藥等多個(gè)方面 也叫基因操作、遺傳工程或重組DNA技術(shù)，是20世紀(jì)70年代以后興起的一門新技術(shù)。 基因工程(gene engineering) 是指在基因水平上的操作井改變生物遺傳特性的 技術(shù)。即按照人們的需要，用類似

3、工程設(shè)計(jì)的方法將不同來源的基因(DNA 分子)在體外構(gòu)建成雜種DNA分子，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù) 制、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的操作，也稱DNA重組技術(shù)。因此，由該技術(shù)構(gòu)建的且具有 新遺傳性狀的生物稱為基因工程生物或轉(zhuǎn)基因生物。 細(xì)胞工程(cell engineering)是指以細(xì)胞為基本單位，在體外條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為地使細(xì)胞某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改 變，從而達(dá)到改良生物品種和創(chuàng)造新品種的目的，加速繁育動(dòng)植物個(gè)體，或獲 得某種有用物質(zhì)的技術(shù)。細(xì)胞工程主要包括動(dòng)植物細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞 融合技術(shù)(也稱細(xì)胞雜交技術(shù))、細(xì)胞器移植技術(shù)等。 發(fā)酵工程(fermentation eng

4、ineering)是指利用包括工程微生物在內(nèi)的某些微生物或動(dòng)、植物細(xì)胞及其特定功能，通過現(xiàn)代工程技術(shù)手段(主要是發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器的自動(dòng)化、高效化、功能多樣化、大型化)生產(chǎn)各種特定的有用物質(zhì)；或者把微生物直接用于某些工業(yè)化生產(chǎn)的一種技術(shù)。由于發(fā)酵多與微生物密切聯(lián)系在一起，所以又有微生物工程或微生物發(fā)酵工程之稱。 利用酶、細(xì)胞器或細(xì)胞所具有的特異催化功能以及對(duì)酶進(jìn)行的修飾改造，并借助于生物反應(yīng)器生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品的一項(xiàng)技術(shù)。 主要包括酶的固定化技術(shù)、細(xì)胞固定化技術(shù)、酶的修飾改造技術(shù)及酶反應(yīng)器的設(shè)計(jì)技術(shù)等。 蛋白質(zhì)工程(protein engineering)這一名稱是1981年由美國基因公司的Ul

5、mer提出的，它是指在基因工程的基礎(chǔ)上，結(jié)合蛋白質(zhì)晶體學(xué)、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)化學(xué)等多學(xué)科的基礎(chǔ)知識(shí)，通過對(duì)基因的人工定向改造等手段，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾、改造、拼接，以產(chǎn)生能滿足人類需要的新型蛋白質(zhì)的技術(shù)。 現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展 現(xiàn)代生物技術(shù)時(shí)期是以分子生物學(xué)的理論為先導(dǎo)，以20世紀(jì)70年代DNA重組技術(shù)的建立為標(biāo)志的。 1944年美國微生物學(xué)家Avery等用實(shí)驗(yàn)證明了DNA是遺傳信息的攜帶者。 1953年美國學(xué)者Watson和Crick發(fā)現(xiàn)了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，1958年Crick又闡明了DNA的半保留復(fù)制模式，從而奠定了現(xiàn)代分子生物學(xué)的基礎(chǔ)。 1961年Nirenberg，

6、1965年 Holley，1967年Khorana分別對(duì)20種常見氨基酸以及起始和終止密碼完成了破譯。 1972年 Berg創(chuàng)建了DNA體外重組技術(shù)，這標(biāo)志著生物技術(shù)的核心技術(shù)基因工程技術(shù)的開始。 目前三個(gè)平臺(tái)：DNA重組、細(xì)胞培養(yǎng)和DNA芯片 未來將會(huì)形成的幾個(gè)新的平臺(tái) 1.基因組平臺(tái) 2.生物芯片 3.干細(xì)胞生物學(xué) 4.生物信息學(xué) 5.神經(jīng)科學(xué)第一章1-1酶工程原理和方法酶工程原理和方法1、酶是由生物體產(chǎn)生的具有催化劑活、酶是由生物體產(chǎn)生的具有催化劑活性的蛋白質(zhì)性的蛋白質(zhì) 。2、本身就是一段、本身就是一段RNA，不需要額外的，不需要額外的蛋白酶就可以對(duì)自身進(jìn)行剪切。蛋白酶就可以對(duì)自身進(jìn)行剪

7、切。 高效率比非催化高1081020倍比非酶催化高1071013倍 高度專一性 反應(yīng)條件溫和 酶催化是可調(diào)控的 酶工程酶工程 (enzyme engineering)即利用酶的催化作用，即利用酶的催化作用，在一定的生物反應(yīng)器中，在一定的生物反應(yīng)器中，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所需的產(chǎn)品。酶工程是現(xiàn)需的產(chǎn)品。酶工程是現(xiàn)代酶學(xué)理論與化工技術(shù)代酶學(xué)理論與化工技術(shù)的交叉技術(shù)，它的應(yīng)用的交叉技術(shù)，它的應(yīng)用主要集中于食品工業(yè)、主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)輕工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域。域。酶工程：酶工程： 酶是基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工酶是基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程和生化工程的研究對(duì)象和

8、工具。程和生化工程的研究對(duì)象和工具。 酶工程的研究可以促進(jìn)基因工程、酶工程的研究可以促進(jìn)基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程和生化工程的發(fā)細(xì)胞工程、發(fā)酵工程和生化工程的發(fā)展。展。酶工程酶工程化學(xué)酶工程化學(xué)酶工程生物酶工程生物酶工程自然酶自然酶化學(xué)修飾酶化學(xué)修飾酶固定化酶固定化酶人工合成酶人工合成酶克隆酶克隆酶突變酶突變酶新酶新酶 (一)反應(yīng)條件溫和 (二)催化效率高 (三)反應(yīng)專一性強(qiáng) (四)反應(yīng)可調(diào)節(jié)控制 （一）常用產(chǎn)酶微生物 (二)菌種的分離篩選 1優(yōu)良菌種的特點(diǎn) 一個(gè)優(yōu)良菌種應(yīng)具備以下幾個(gè)條件：繁殖快，產(chǎn)酶量高，生產(chǎn)周期短；適應(yīng)性強(qiáng)，容易培養(yǎng)和控制，便于管理和降低生產(chǎn)成本；產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，不易退化

9、，不易受噬菌體侵襲；產(chǎn)生的酶容易分離純化；菌種本身和代謝產(chǎn)物安全無毒，對(duì)生產(chǎn)人員、生產(chǎn)環(huán)境，酶的應(yīng)用不會(huì)產(chǎn)生不良影響。 2菌種的分離 (1)含菌樣品的收集 (2)富集培養(yǎng) (3)菌種的純化 3.菌種的篩選 (三)產(chǎn)酶微生物育種 1誘變育種 2原生質(zhì)體融合育種 3基因工程育種 (四)菌種的保藏 1斜面冰箱保藏法 2沙土管保藏法 3石蠟油封保藏法 4真空干燥冷凍保藏 液氮超低溫保藏法 （1）對(duì)生物寶庫中存在天然酶的開發(fā)和生產(chǎn)；）對(duì)生物寶庫中存在天然酶的開發(fā)和生產(chǎn)；（2）自然酶的分離純化及鑒定技術(shù)；）自然酶的分離純化及鑒定技術(shù)；（3）酶的固定化技術(shù)（酶和細(xì)胞固定化）；）酶的固定化技術(shù)（酶和細(xì)胞固定化

10、）；（4）酶反應(yīng)器的研制和應(yīng)用；）酶反應(yīng)器的研制和應(yīng)用；（5）與其他生物技術(shù)領(lǐng)域的交叉和滲透。）與其他生物技術(shù)領(lǐng)域的交叉和滲透。 其中固定化酶技術(shù)是酶工程的核心。實(shí)際其中固定化酶技術(shù)是酶工程的核心。實(shí)際上有了酶的固定化技術(shù)，酶在工業(yè)生產(chǎn)中的上有了酶的固定化技術(shù)，酶在工業(yè)生產(chǎn)中的利用價(jià)值才真正得以體現(xiàn)。利用價(jià)值才真正得以體現(xiàn)。 生命活動(dòng)過程中的新陳代謝所涉及的各種生命活動(dòng)過程中的新陳代謝所涉及的各種化學(xué)反應(yīng)由各種酶的催化來實(shí)現(xiàn)?；瘜W(xué)反應(yīng)由各種酶的催化來實(shí)現(xiàn)。（1）生命活動(dòng)規(guī)律；）生命活動(dòng)規(guī)律； （2）生物工程的工具；）生物工程的工具；（3）醫(yī)藥工業(yè)（疾病發(fā)生、診斷和治療等）；）醫(yī)藥工業(yè)（疾病發(fā)生

11、、診斷和治療等）；（4）工農(nóng)業(yè)、環(huán)保等領(lǐng)域的應(yīng)用；）工農(nóng)業(yè)、環(huán)保等領(lǐng)域的應(yīng)用；（5）分析工具。）分析工具。 2.1酶的生產(chǎn)方法酶的生產(chǎn)方法提取法提取法 采用各種提取、分離技術(shù)從動(dòng)物、植物或微采用各種提取、分離技術(shù)從動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞或組織中將酶提取分離出來。是最生物細(xì)胞或組織中將酶提取分離出來。是最早采用的酶生產(chǎn)技術(shù)。目前在動(dòng)、植物資源早采用的酶生產(chǎn)技術(shù)。目前在動(dòng)、植物資源豐富的地區(qū)，仍有使用價(jià)值。豐富的地區(qū)，仍有使用價(jià)值。 簡單方便，但受氣候、地理環(huán)境的影響，產(chǎn)簡單方便，但受氣候、地理環(huán)境的影響，產(chǎn)品含雜質(zhì)較多，分離純化較困難。品含雜質(zhì)較多，分離純化較困難。 例如，從動(dòng)物胰臟中提取胰酶；

12、從動(dòng)物胃中例如，從動(dòng)物胰臟中提取胰酶；從動(dòng)物胃中提取胃蛋白酶等提取胃蛋白酶等。1-2酶的生物發(fā)酵生產(chǎn)酶的生物發(fā)酵生產(chǎn) 發(fā)酵法發(fā)酵法 利用細(xì)胞，主要是微生物細(xì)胞的生命活動(dòng)而利用細(xì)胞，主要是微生物細(xì)胞的生命活動(dòng)而獲得所需的酶。獲得所需的酶。 根據(jù)微生物培養(yǎng)方式的不同，分為固體培養(yǎng)根據(jù)微生物培養(yǎng)方式的不同，分為固體培養(yǎng)法、液體深層法、固定化細(xì)胞和固定化原生法、液體深層法、固定化細(xì)胞和固定化原生質(zhì)體法等。質(zhì)體法等。 化學(xué)合成法化學(xué)合成法 現(xiàn)在已可用肽合成儀來進(jìn)行酶的化學(xué)合成?，F(xiàn)在已可用肽合成儀來進(jìn)行酶的化學(xué)合成。 合成成本高昂，且只能合成已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的合成成本高昂，且只能合成已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的酶。酶。酶的

13、生產(chǎn)方法酶的生產(chǎn)方法 2.2發(fā)酵生產(chǎn)用產(chǎn)酶菌株的要求發(fā)酵生產(chǎn)用產(chǎn)酶菌株的要求酶的產(chǎn)量高酶的產(chǎn)量高容易培養(yǎng)和管理容易培養(yǎng)和管理產(chǎn)酶穩(wěn)定性好產(chǎn)酶穩(wěn)定性好利于酶的分離純化利于酶的分離純化安全可靠安全可靠 2.3菌種獲得途徑：菌種獲得途徑：菌種保存機(jī)構(gòu)菌種保存機(jī)構(gòu)篩選篩選 菌種采集菌種采集 菌種的分離、純化菌種的分離、純化 菌種生產(chǎn)性能的檢定菌種生產(chǎn)性能的檢定初篩：從已分離的菌種中挑出可產(chǎn)初篩：從已分離的菌種中挑出可產(chǎn)生目的酶的菌株。生目的酶的菌株。復(fù)篩：在初篩基礎(chǔ)上篩選產(chǎn)酶量高、復(fù)篩：在初篩基礎(chǔ)上篩選產(chǎn)酶量高、性能更符合要求的菌株。性能更符合要求的菌株。一、菌種的活化和擴(kuò)大培養(yǎng)(一)菌種活化(二)菌

14、種的擴(kuò)大培養(yǎng) 二、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備 1碳源，碳源是指能向細(xì)胞提供碳素的含碳化合物。一般采用淀粉及其水解產(chǎn)物，如糊精、麥芽糖等 2氮源，能夠向細(xì)胞提供氮素的化合物稱為氮源。氮源分為有機(jī)氮和無機(jī)氮。有機(jī)氮主要是各種蛋白質(zhì)材料及蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物 。無機(jī)氮包括各種銨鹽和硝酸鹽等。 3無機(jī)鹽類無機(jī)鹽提供細(xì)胞生命活動(dòng)必需的無機(jī)元素，對(duì)培養(yǎng)基的pH、緩沖能力和滲透壓起調(diào)節(jié)作用。 4生長因子生長因子是指細(xì)胞生長繁殖所必需的微量有機(jī)物質(zhì)，包括維生素、氨基酸、嘧啶、嘌呤等，它們是構(gòu)成輔酶的必需物質(zhì)。 三、酶合成的促進(jìn)劑和阻遏物 (一)酶合成的促進(jìn)劑 在培養(yǎng)基中少量添加就明顯著增加酶產(chǎn)量的物質(zhì)，統(tǒng)稱為產(chǎn)酶促進(jìn)劑它們

15、大多屬于酶合成的誘導(dǎo)物、酶的穩(wěn)定劑或表面活性劑。誘導(dǎo)物多為底物或底物類似物，如淀粉、蔗糖、纖維素分別是淀粉酶、蔗糖酶、纖維素酶的誘導(dǎo)物。 (二)酶合成的阻遏物 微生物酶的生產(chǎn)受代謝途徑末端產(chǎn)物和分解代謝產(chǎn)物的阻遏。例如，枯草桿菌堿性磷酸酶的合成受其催化產(chǎn)物無機(jī)磷酸的抑制 產(chǎn)酶效率高 ，細(xì)胞被固定化后，只能在一定的空間范圍內(nèi)生長繁殖，細(xì)胞密度增大，故可加快生化反應(yīng)速度，提高產(chǎn)酶率。 可進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，固定化細(xì)胞固定在載體上，不易脫落，可反復(fù)使用多次。 縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率，在利用固定化細(xì)胞發(fā)酵時(shí)，第二批次及以后批次的發(fā)酵周期縮短。 酶容易分離純化，固定化細(xì)胞顆粒很容易與發(fā)酵液分離，發(fā)酵液中

16、游離細(xì)胞很少，因此有利于酶的分離純化 (一)溫度 不同的微生物生長有不同的最適溫度，例如黑曲霉的最適溫度為2832，枯草桿菌最適溫度是3437。 (二)pH值 不同的微生物所需要的最適pH不同。例如，黑曲霉既可產(chǎn)生，淀粉酶，又可產(chǎn)生糖化酶，當(dāng)培養(yǎng)基的pH偏中性時(shí)，有利于淀粉酶的生產(chǎn)；而當(dāng)pH偏酸性時(shí)糖化酶產(chǎn)量提高，淀粉酶產(chǎn)量降低。 (三)溶解氧 在發(fā)酵過程中應(yīng)連續(xù)不斷地供給無菌空氣，同時(shí)進(jìn)行攪拌以增加培養(yǎng)基中溶解氧的含量。 3.1酶分離純化的一般程序 首先獲得出發(fā)酶液。如果微生物發(fā)酵生產(chǎn)的是胞外酶，液體發(fā)酵的培養(yǎng)液或固體培養(yǎng)物的抽提液就是出發(fā)酶液；如果發(fā)酵生產(chǎn)的是胞內(nèi)酶，先分離收集菌體，將其破

17、碎，再利用提取液將酶抽提至液相，即獲得出發(fā)酶液。 除去出發(fā)酶液中的懸浮固形物獲得澄清的酶液。 利用各種技術(shù)將酶沉淀分離。 將獲得的沉淀干燥，研磨成粉，加入適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑、填充劑等，做成粉末制劑。 當(dāng)對(duì)酶產(chǎn)品的純度要求很高時(shí)，還需要精制。 保藏菌種保藏菌種活化活化擴(kuò)培擴(kuò)培發(fā)酵發(fā)酵分離純化分離純化成品成品(酶酶)固體發(fā)酵固體發(fā)酵液體發(fā)酵液體發(fā)酵一般工藝流程：一般工藝流程： 1溫度操作過程盡可能在低溫()下進(jìn)行，溶液中存在無機(jī)鹽或有機(jī)溶劑時(shí)，更應(yīng)如此，以防止蛋白質(zhì)水解酶對(duì)目的酶的分解破壞。 2pH 在提純過程中通常采用一定pH的緩沖液，防止溶液過酸或過堿影響酶的穩(wěn)定性和溶解度。 3鹽濃度 大多數(shù)蛋白質(zhì)

18、具有在適當(dāng)?shù)柠}濃度下溶解度增大的性質(zhì)，但當(dāng)鹽濃度過高時(shí)，酶蛋白易變性失活。 4雜菌污染 含酶溶液是微生物生長的良好培養(yǎng)基，在提純過程中要防止雜菌污染。 (一)細(xì)胞破碎技術(shù) 1機(jī)械破碎 2物理破碎 3化學(xué)破碎法 4酶法酶法 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破首先需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。碎處理。1）機(jī)械破碎）機(jī)械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化學(xué)破碎）化學(xué)破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超聲波超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞破碎珠細(xì)胞破碎珠高壓細(xì)胞破碎機(jī)高壓細(xì)胞破碎機(jī)DY89-I型型 電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)電動(dòng)玻璃

19、勻漿機(jī)機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法 物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法 化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。力，使組織、細(xì)胞破碎。通過各種物理因素的作用，通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。壞，而使細(xì)胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞通過各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)

20、胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理細(xì)胞破碎方法及其原理本章目錄微生物細(xì)胞的破碎一、一、機(jī)械破碎法機(jī)械破碎法1、高壓勻漿法高壓勻漿法2、珠磨法、珠磨法3、超聲破碎法、超聲破碎法二、非機(jī)械破碎法二、非機(jī)械破碎法1、酶溶法、酶溶法2、化學(xué)滲透法、化學(xué)滲透法 （二）發(fā)酵液的絮凝與凝聚技術(shù) 1、凝聚 凝聚是指在電解質(zhì)作用下，溶液的膠粒之間雙電層排斥作用降低，而使膠體體系不穩(wěn)定，膠粒間相互凝聚的現(xiàn)象。常用的凝聚電解質(zhì)有硫酸鋁、氯化鋁、三氯化鐵、硫酸亞鐵、石灰、硫酸鋅、碳酸鎂等。 2絮凝 絮凝是指在某些高分子絮凝劑的作用下，溶掖中的較小膠粒聚合形成較大絮疑團(tuán)的過程。采用絮凝

21、法產(chǎn)生的絮凝團(tuán)較粗大，容易過濾分離。 絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物分子量可高達(dá)數(shù)萬至一千萬以上，它們具有長的鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性基團(tuán)，包括帶正、負(fù)電荷的離子，如羧基(COOH)、氨基(NH2)等 絮凝劑可分為三類： 有機(jī)高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物； 無機(jī)高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等； 天然有機(jī)高分子絮凝劑，如聚糖類膠黏物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。 (三)發(fā)酵液的過濾技術(shù) 1過濾技術(shù)的分類 根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同，過濾可分為粗濾、微濾、超濾和反滲透4大類。 根據(jù)過濾對(duì)產(chǎn)生推動(dòng)力的條件不同，粗濾可分為常壓過濾、離心

22、過濾、加壓過濾、減壓過濾等4種。 常用的過濾設(shè)備 (1)板框過濾機(jī)，適合于固體含量110的懸浮液的分離。 (2)真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)，適合于固體顆粒大、固體含量高(10)的懸浮液的分離 酶的提取、分離純化技術(shù)路線酶的提取、分離純化技術(shù)路線細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎酶提取酶提取酶分離純化酶分離純化酶濃縮酶濃縮酶貯存酶貯存動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。取分離，結(jié)晶分離等。 酶產(chǎn)品的提取和分離純化的一般步驟：酶產(chǎn)品的提取和分離純化的一般步驟：胞內(nèi)酶：細(xì)胞分離收集菌體胞

23、內(nèi)酶：細(xì)胞分離收集菌體破碎破碎勻漿勻漿胞外酶：發(fā)酵液或固體培養(yǎng)物的酶浸提物胞外酶：發(fā)酵液或固體培養(yǎng)物的酶浸提物 離心或過濾離心或過濾 沉淀分離沉淀分離干燥干燥精制精制 (四)酶的提取技術(shù) 1稀鹽溶液抽提，是利用某些蛋白質(zhì)溶解于稀鹽溶液的特性來提取酶的。大多數(shù)酶溶于水，而且在一定濃度鹽存在的條件下，溶解度增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象。 2稀酸溶液抽提，某些酶在酸性條件下溶解度較大，且穩(wěn)定性較好，適宜用稀酸溶液提取。 3稀堿溶液抽提，某些酶在堿性條件下溶解度較大，而且穩(wěn)定性好，適用于稀堿溶液提取。 4有機(jī)溶劑抽提，某些酶與脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中含非極性基團(tuán)較多，不溶或難溶于極性溶劑，需用乙醇、丙酮、丁醇

24、等有機(jī)溶劑提取。 5雙水相體系萃取 它是利用兩種不同水溶性聚合物的水溶液混合時(shí)，體系形成的互不兼容的兩相，即雙水相體系來提取酶。 (五)酶的離心分離技術(shù) 離心分離是酶提取純化過程中最常用的方法，是借助離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使酶與其他物質(zhì)分離的技術(shù)。主要用于除去發(fā)酵液中的菌體殘?jiān)?、培養(yǎng)基殘?jiān)约俺樘徇^程中生成的沉淀物。 (六)酶的沉淀分離技術(shù) 1鹽析沉淀法 鹽析沉淀法又稱為鹽析法，該法利用蛋白質(zhì)在一定濃度的鹽溶液中沉淀的特性分離蛋白質(zhì)。在鹽濃度較高時(shí)，由于鹽離子的水合作用，使水分子的活度降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度下降，蛋白質(zhì)沉淀，這就是鹽析現(xiàn)象。 2有機(jī)溶劑法 在等電點(diǎn)附近，蛋白質(zhì)分子主要以兩

25、性電解質(zhì)的形式存在。如果這時(shí)添加有機(jī)溶劑，由于有機(jī)溶劑的存在使溶液的介電常數(shù)降低，兩性電解質(zhì)分子之間的靜電引力增大，從而使分子凝聚沉淀。另一方面，有機(jī)溶劑本身的水合作用也會(huì)破壞蛋白質(zhì)表面的水合層，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子脫水而沉淀。 3有機(jī)聚合物沉淀法 除了鹽和有機(jī)溶劑能使蛋白質(zhì)沉淀外，水溶性中性高聚物也能沉淀蛋白質(zhì)。常用于蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)聚合物有PEG6000、PEG20000、聚丙烯酸、單寧等。 4選擇性變性沉淀法 有一些蛋白質(zhì)的穩(wěn)定相當(dāng)好，可忍受極端環(huán)境條件，因此，可利用極端條件使非目的酶變性，并從溶液中沉淀出來，從而使目的酶得到分離?？晒├玫淖冃詶l件有熱變性、pH變性和有機(jī)溶劑變性。 (七)酶

26、的濃縮技術(shù) 由于發(fā)酵液或酶的抽提液中酶的濃度一般都比較低，一般用減壓、超濾等方法進(jìn)行適當(dāng)濃度的濃縮。 (八)酶的干燥技術(shù) 酶的工業(yè)化制劑有液態(tài)和固體粉劑兩種。固體酶制劑穩(wěn)定性高，便于貯存、運(yùn)輸和應(yīng)用。干燥是將固體、半固體或濃縮液中的水分除去一部分，以獲得含水量較少的固體的過程。常用的干燥方法有真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥、吸附干燥等。 (一)透析與超濾技術(shù) 1透析 2超濾 (二)層析分離技術(shù) 1吸附層析技術(shù) 2離子交換層析技術(shù) 3凝膠層析技術(shù) 4親和層析 (三)電泳分離技術(shù) 1凝膠電泳技術(shù) 2等電聚焦電泳技術(shù) 1、根據(jù)酶分子溶解度不同的方法、根據(jù)酶分子溶解度不同的方法2、根據(jù)酶分子大

27、小和形狀不同的方法、根據(jù)酶分子大小和形狀不同的方法3、根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的方法、根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的方法4、根據(jù)酶分子專一性結(jié)合的分離方法、根據(jù)酶分子專一性結(jié)合的分離方法5、根據(jù)分配系數(shù)的分離方法、根據(jù)分配系數(shù)的分離方法6、其他分離方法、其他分離方法酶的提取和精制酶的提取和精制溶解度溶解度不同不同鹽析鹽析沉淀法沉淀法等電點(diǎn)等電點(diǎn)沉淀法沉淀法有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑沉淀法沉淀法復(fù)合復(fù)合沉淀法沉淀法根據(jù)某一濃根據(jù)某一濃度的鹽溶液度的鹽溶液中不同濃度中不同濃度的蛋白質(zhì)和的蛋白質(zhì)和酶的溶解度酶的溶解度不同不同根據(jù)兩性根據(jù)兩性電解質(zhì)在電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)等電點(diǎn)時(shí)溶解度最溶解度最低低利用酶利用酶在有機(jī)在有機(jī)質(zhì)中的質(zhì)中

28、的溶解度溶解度的不同的不同利用酶利用酶能與某能與某些物質(zhì)些物質(zhì)形成沉形成沉淀淀酶分子酶分子大小和形狀大小和形狀離心離心分離法分離法凝膠凝膠過濾法過濾法透析透析超濾超濾反滲透反滲透電滲析電滲析瓊脂和瓊脂凝膠、聚丙烯瓊脂和瓊脂凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、葡萄糖凝膠酰胺凝膠、葡萄糖凝膠膜分離技術(shù)膜分離技術(shù)離子交換柱層析離子交換柱層析層析聚焦層析聚焦電泳分離電泳分離等電聚焦電泳等電聚焦電泳酶分子酶分子電荷性質(zhì)電荷性質(zhì)酶分子專一性結(jié)合酶分子專一性結(jié)合1、親和層析、親和層析2、免疫吸附層析、免疫吸附層析3、染料配體親和層析、染料配體親和層析4、共價(jià)層析、共價(jià)層析 (一)合適的溫度 (二)適當(dāng)?shù)膒 值 (三)抗氧

29、化保護(hù) (四)提高酶的濃度和純度1、穩(wěn)定性差、穩(wěn)定性差2、對(duì)反應(yīng)的溫度、要求嚴(yán)格、對(duì)反應(yīng)的溫度、要求嚴(yán)格3、Km值過大值過大 4、具有抗原性、具有抗原性天然酶在應(yīng)用中的限制因素天然酶在應(yīng)用中的限制因素 定義：通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，而使蛋白質(zhì)定義：通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，而使蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變酶的某些特性和功共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變酶的某些特性和功能的過程。能的過程。 即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學(xué)即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，基團(tuán)（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。進(jìn)

30、行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。 提高酶的活力提高酶的活力 activityactivity 增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 stabilitystability 降低或消除酶的抗原性降低或消除酶的抗原性 immunological immunological propertyproperty 研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對(duì)酶分單位、金屬離子和各種物理因素對(duì)酶分子空間構(gòu)象的影響子空間構(gòu)象的影響 structure structure 1 1 對(duì)酶分子進(jìn)行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)對(duì)酶分子進(jìn)行修飾必須在修飾原理、修飾劑和

31、反應(yīng)條件的選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。條件的選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。（1 1）酶的穩(wěn)定性）酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pHpH、抑制劑、抑制劑等。等。 （2 2）酶活性中心的狀況）酶活性中心的狀況 活性中心基團(tuán)、輔因子等。其他如分子大小、性活性中心基團(tuán)、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。狀、亞基數(shù)等。 2 2 在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡量不破壞酶活性功能的在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團(tuán)，使修飾率高，同時(shí)酶的活力回收高。必需基團(tuán)，使修飾率高，同時(shí)酶的活力回收高。（1 1）pHpH與離子強(qiáng)度與離子

32、強(qiáng)度 pHpH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)。由決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。（2 2）修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間）修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間 嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間可以減少以至消除一些非專嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。一性的修飾反應(yīng)。（3 3）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例 1、金屬離子置換修飾、金屬離子置換修飾2、大分子結(jié)合修飾、大分子結(jié)合修飾3、側(cè)鏈水解修飾、側(cè)鏈水解修飾4、側(cè)鏈基團(tuán)修飾、側(cè)鏈基團(tuán)修飾5、酶基因與改造、酶基因與改造6、酶分子的物理修飾、酶分子的物

33、理修飾1、金屬離子置換修飾、金屬離子置換修飾 定義：通過改變酶分子中所含的金屬離子，使酶定義：通過改變酶分子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法。的特性和功能發(fā)生改變的方法。 定義：定義：把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法。子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法。 常用于酶分子修飾的是二價(jià)金屬離子，如：常用于酶分子修飾的是二價(jià)金屬離子，如：Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，F(xiàn)e2+等。等。 若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會(huì)喪失其催化活性

34、。如果重新加入原往往會(huì)喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。若用另一種金屬離子進(jìn)行置者部分恢復(fù)。若用另一種金屬離子進(jìn)行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的可換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。1、金屬離子置換修飾、金屬離子置換修飾p a. 酶的分離純化：首先將欲進(jìn)行修飾的酶經(jīng)過分離純酶的分離純化：首先將欲進(jìn)行修飾的酶經(jīng)過分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。化，除去雜質(zhì)，獲得

35、具有一定純度的酶液。p b. 除去原有的金屬離子：在經(jīng)過純化的酶液中加入一除去原有的金屬離子：在經(jīng)過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使）等，使酶分子中的金屬離子與酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液金屬螯合物從酶液中除去。此時(shí)，酶往往成為無活性狀態(tài)。中除去。此時(shí)，酶往往成為無活性狀態(tài)。pc c. . 加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新

36、加入的金屬離子結(jié)合，除去一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。1、金屬離子置換修飾、金屬離子置換修飾 金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。 用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價(jià)金屬離子。都是二價(jià)金屬離子。 1、金屬離子置換修飾、金屬離子置換修飾例如例如:鋅型蛋白酶鋅型蛋白酶Zn2+Ca2+活力提高活力提高20%30%30%淀粉酶淀粉酶Mg2+,Zn2+ C

37、a2+可提高活力可提高活力增加穩(wěn)定性增加穩(wěn)定性2、大分子結(jié)合修飾、大分子結(jié)合修飾 定義：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的定義：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。的特性與功能的方法。 常用修飾劑：右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖聚常用修飾劑：右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖聚合物、聚氨基酸等。使用前一般需經(jīng)過活化，然后合物、聚氨基酸等。使用前一般需經(jīng)過活化，然后在一定條件下與酶分子共價(jià)結(jié)合。在一定條件下與酶分子共價(jià)結(jié)合。 修飾條件的控制：修飾劑的種類與濃度、溫度、修飾條件的控制：修飾劑的種類與濃度、溫度、p

38、H和反應(yīng)時(shí)和反應(yīng)時(shí)間等。間等。 此法是目前應(yīng)用最廣泛的酶分子修飾方法此法是目前應(yīng)用最廣泛的酶分子修飾方法.如尿激酶與大分子如尿激酶與大分子結(jié)合增加穩(wěn)定性結(jié)合增加穩(wěn)定性,木瓜蛋白酶與右旋糖酐結(jié)合木瓜蛋白酶與右旋糖酐結(jié)合.聚乙二醇對(duì)色氨聚乙二醇對(duì)色氨酸酶進(jìn)行修飾消除抗原性酸酶進(jìn)行修飾消除抗原性 定義：有些酶的肽鏈經(jīng)有限水解，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生定義：有些酶的肽鏈經(jīng)有限水解，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性和功能的方法。某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性和功能的方法。 利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變

39、，從而改變酶的特性和功能的其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。方法。 酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/ /酶原激活法。酶原激活法。 方法：方法： 常用修飾劑：專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶。常用修飾劑：專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶。 其他：如其他：如EDTA+純水或稀鹽酸透析處理枯草桿菌中純水或稀鹽酸透析處理枯草桿菌中性蛋白酶，可使其部分水解。性蛋白酶，可使其部分水解。3 3、 酶側(cè)鏈水解修飾酶側(cè)鏈水解修飾( (肽鏈有限水解修飾肽鏈有限水解修飾) ) 采用一定的方法（一般為化學(xué)法）使酶蛋白采用一定的方法（一般為化學(xué)法）使酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特

40、的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法。性和功能的修飾方法。 酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要包括氨基、羧基、巰殘基上的功能團(tuán)。主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。這些基團(tuán)可以形成各種基、胍基、酚基等。這些基團(tuán)可以形成各種副鍵，對(duì)酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定有重副鍵，對(duì)酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定有重要作用。側(cè)鏈基團(tuán)一旦改變將引起酶蛋白空要作用。側(cè)鏈基團(tuán)一旦改變將引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的特性和功能。間構(gòu)象的改變，從而改變酶的特性和功能。 （1）羧基修飾劑 羧基修飾劑可使羧基酯化、?；蚪Y(jié)合上其他基

41、團(tuán)。最早用來修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈羧基的修飾劑是乙醇鹽酸試劑，它可使羧基產(chǎn)生酯化作用。 （2）氨基修飾劑 主要有二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、亞硝酸、乙亞胺甲酯、O甲基異脲、順丁烯二酸酐等。它們可與氨基共價(jià)結(jié)合將氨基屏蔽起來，或?qū)е旅摪被饔?，從而改變酶蛋白的?gòu)象或性質(zhì)。例如用O甲基異脲與溶菌酶賴氨酸殘基的氨基結(jié)合，酶活力保持不變，但穩(wěn)定性提高，而且很容易結(jié)晶析出；用亞硝酸修飾天冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸和肽鏈中的賴氨酸的氨基轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基，使酶的穩(wěn)定性提高，在體內(nèi)的半衰期可延長2倍。 （3）巰基修飾劑 巰基在維持亞基間的相互作用和在酶的催化過程中起重要的作用，然而巰基卻容易發(fā)生變化，從而改

42、變酶的性質(zhì)和催化特性。常用的 巰基修飾劑有：二硫蘇糖醇、巰基乙醇、硫代硫酸鹽、硼氫化鈉等還原劑以及各種?；瘎?、烷基化劑等。 （4）酚基修飾劑 常用碘化法、硝化法和琥珀酰化法等修飾酶蛋白中的酚基。酚基經(jīng)修飾劑修飾后，引入負(fù)電荷，因而增大酶對(duì)帶正電荷的底物的結(jié)合力 （5）胍基修飾劑 精氨酸含有胍基。胍基可與二羰基化合物縮合生成穩(wěn)定的雜環(huán)。所以二羰基化合物，如環(huán)己二酮、乙二醛、苯乙二醛等，都可以用做胍基修飾劑。 （6）分子內(nèi)交聯(lián)劑 用含有雙功能團(tuán)的化合物，如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等，與酶分子內(nèi)兩個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)，在分子內(nèi)共價(jià)交聯(lián)，可使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定。 5、酶基因與改造、酶基因與改造 20世

43、紀(jì)世紀(jì)80年代在基因工程基礎(chǔ)上發(fā)展而來的年代在基因工程基礎(chǔ)上發(fā)展而來的酶的蛋白質(zhì)工程，又稱為第二代基因工程，是指酶的蛋白質(zhì)工程，又稱為第二代基因工程，是指通過改造與蛋白質(zhì)相對(duì)應(yīng)的基因中的堿基排列次通過改造與蛋白質(zhì)相對(duì)應(yīng)的基因中的堿基排列次序，或設(shè)計(jì)合成新的基因，將它克隆到寄主細(xì)胞序，或設(shè)計(jì)合成新的基因，將它克隆到寄主細(xì)胞中，通過基因表達(dá)而獲得具有新的特性的蛋白質(zhì)中，通過基因表達(dá)而獲得具有新的特性的蛋白質(zhì)的技術(shù)。的技術(shù)。 新蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)新蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)突變基因的核苷酸序列突變基因的核苷酸序列的確定的確定突變基因的獲得突變基因的獲得新蛋白質(zhì)的產(chǎn)生新蛋白質(zhì)的產(chǎn)生 生物酶工程主要包括三方面內(nèi)容： 用基因

44、工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶； 修飾酶基因，產(chǎn)生遺傳修飾； 設(shè)計(jì)出新酶基因，合成自然界中從未有過的酶。 基因工程的方法包括基因工程的方法包括:利用克隆利用克隆,良好的宿主良好的宿主-載體系統(tǒng)和不同的表達(dá)系統(tǒng)載體系統(tǒng)和不同的表達(dá)系統(tǒng)基因的定點(diǎn)誘變基因的定點(diǎn)誘變隨機(jī)誘變隨機(jī)誘變蛋白質(zhì)分子剪裁蛋白質(zhì)分子剪裁對(duì)蛋白質(zhì)功能元件進(jìn)行分解或重組來獲得具有單一對(duì)蛋白質(zhì)功能元件進(jìn)行分解或重組來獲得具有單一或復(fù)合功能的新蛋白質(zhì)或復(fù)合功能的新蛋白質(zhì) 克隆克隆是酶基因工程的關(guān)鍵一步，是把編碼目的酶的基因插入適當(dāng)?shù)妮d體，后帶入載體相容的宿主，并隨宿主復(fù)制。 酶基因插入載體后，在宿主中有兩種表達(dá)方式，一種是利用自身自身攜帶的起始密

45、碼起始密碼子，啟動(dòng)合成與天然酶完全相同的酶相同的酶 另一種是利用載體載體所具有的密碼子密碼子，合成相應(yīng)的融合蛋白融合蛋白，融合蛋白經(jīng)化學(xué)或酶法水解水解后形成天然酶。要構(gòu)建一個(gè)具有良好產(chǎn)酶性能的菌株，必須具備良好的宿主宿主載體系統(tǒng)載體系統(tǒng) 所希望的酶占細(xì)胞總蛋白量的比例要高比例要高，能以活性形式分泌； 菌體容易大規(guī)模培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)，生長無特殊要求，且能利用廉價(jià)的原料； 載體與宿主相容，克隆酶基因的載體能在宿主中穩(wěn)定維持穩(wěn)定維持； 宿主中的蛋白酶蛋白酶盡可能少少，產(chǎn)生的外源酶不會(huì)被迅速降解降解； 宿主菌對(duì)人安全安全，不分泌毒素。例如；青霉素?；咐纾磺嗝顾仵；?葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖異構(gòu)酶,凝乳蛋

46、白酶凝乳蛋白酶,絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶 特點(diǎn)在于不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶特點(diǎn)在于不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理因分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。 通過物理修飾，可以了解不同物理?xiàng)l件下，通過物理修飾，可以了解不同物理?xiàng)l件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端極端pHpH值等）由于酶分子空間構(gòu)象的改變而值等）由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。引起酶的特性和功能的變化情況。 熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性：一般來說，熱穩(wěn)定性有

47、較大的提高。：一般來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高。 抗原性抗原性：比較公認(rèn)的是：比較公認(rèn)的是PEGPEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。比較明顯。 各類失活因子的抵抗力各類失活因子的抵抗力：修飾酶對(duì)蛋白酶、抑制劑均有一定的抵：修飾酶對(duì)蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性?？鼓芰Γ瑥亩岣咂浞€(wěn)定性。 半衰期半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后，：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強(qiáng)對(duì)熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長了在體內(nèi)的半衰期。增強(qiáng)對(duì)熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長了在體內(nèi)的半衰

48、期。 最適最適pHpH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pHpH發(fā)生了變化，這種變化發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時(shí)具有重要意義。修飾酶最適在應(yīng)用研究上有時(shí)具有重要意義。修飾酶最適pHpH更接近于生理環(huán)境，在更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。臨床應(yīng)用上有較大意義。 KmKm的變化的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，VmVm沒有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，沒有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，KmKm值變大。值變大。修飾酶的性質(zhì)特征：修飾酶的性質(zhì)特征：1、酶的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)；、酶的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)；2、消除抗原性作用；、消除抗原性作用；3、許多修飾酶在體內(nèi)

49、的半衰期延長；、許多修飾酶在體內(nèi)的半衰期延長；4、修飾酶的最適、修飾酶的最適pH值均向有利于生理和臨床應(yīng)值均向有利于生理和臨床應(yīng)用范圍變化；用范圍變化；5、對(duì)最大反應(yīng)速度和米氏常數(shù)的影響；、對(duì)最大反應(yīng)速度和米氏常數(shù)的影響；6、修飾酶對(duì)組織的分布能力有所提高。、修飾酶對(duì)組織的分布能力有所提高。1-5酶的固定化酶的固定化 游離酶在應(yīng)用中的不足游離酶在應(yīng)用中的不足 穩(wěn)定性差；穩(wěn)定性差； 難于回收重復(fù)利用；難于回收重復(fù)利用； 給后續(xù)分離純化增加困難給后續(xù)分離純化增加困難。 固定化酶固定化酶 固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。的酶。 用于固定化

50、的酶，通常是經(jīng)提取分離純化后的酶，用于固定化的酶，通常是經(jīng)提取分離純化后的酶，也可以是含酶菌體或菌體碎片。也可以是含酶菌體或菌體碎片。 優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性增加；可反復(fù)使用；利于連續(xù)操作；優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性增加；可反復(fù)使用；利于連續(xù)操作；易于和反應(yīng)產(chǎn)物分離。易于和反應(yīng)產(chǎn)物分離。 通常采用的固定化方法可大體概括為：載體通常采用的固定化方法可大體概括為：載體結(jié)合法、離子交換吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法、交結(jié)合法、離子交換吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法、交聯(lián)法、螯合法、包埋法和熱處理法等。聯(lián)法、螯合法、包埋法和熱處理法等。 載體結(jié)合法載體結(jié)合法 通過載體表面和酶分子表面間的次級(jí)鍵相互作用而通過載體表面和酶分子表面間的次級(jí)鍵相互作用而達(dá)

51、到固定目的的方法。根據(jù)吸附劑的特點(diǎn)又分為兩達(dá)到固定目的的方法。根據(jù)吸附劑的特點(diǎn)又分為兩種：物理吸附和離子交換吸附。種：物理吸附和離子交換吸附。 物理吸附物理吸附： 通過氫鍵、疏水鍵等物理作用力將酶固定于不溶通過氫鍵、疏水鍵等物理作用力將酶固定于不溶性載體的方法。性載體的方法。 常用的載體常用的載體無機(jī)吸附劑：活性炭、高嶺土、氧化鋁、硅膠、無機(jī)吸附劑：活性炭、高嶺土、氧化鋁、硅膠、微孔玻璃、多孔陶瓷等；微孔玻璃、多孔陶瓷等；有機(jī)吸附劑：纖維素、膠原、火棉膠等。有機(jī)吸附劑：纖維素、膠原、火棉膠等。 通常有機(jī)吸附劑的吸附容量高于無機(jī)吸附劑，且通常有機(jī)吸附劑的吸附容量高于無機(jī)吸附劑，且無機(jī)吸附劑會(huì)使某

52、些酶發(fā)生吸附變性。吸附力弱無機(jī)吸附劑會(huì)使某些酶發(fā)生吸附變性。吸附力弱. 離子交換吸附離子交換吸附 在適宜的在適宜的pH和離子強(qiáng)度條件下，利用酶的側(cè)鏈解和離子強(qiáng)度條件下，利用酶的側(cè)鏈解離基團(tuán)和離子交換基團(tuán)的相互作用而達(dá)到酶固定離基團(tuán)和離子交換基團(tuán)的相互作用而達(dá)到酶固定化的方法?；姆椒?。 常用離子交換劑：常用離子交換劑：CMC、DEAE-纖維素、纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等。葡聚糖凝膠等。 二乙胺基乙基纖維素二乙胺基乙基纖維素 離子交換劑的吸附容量一般大于物理吸附劑。離子交換劑的吸附容量一般大于物理吸附劑。 具體的操作方法分類具體的操作方法分類 靜態(tài)法靜態(tài)法 電沉積法電沉積法 動(dòng)力學(xué)批量式固定

53、化法動(dòng)力學(xué)批量式固定化法 反應(yīng)器裝載法反應(yīng)器裝載法 特點(diǎn)特點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，條件溫和，吸附劑可反復(fù)使用。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，條件溫和，吸附劑可反復(fù)使用。 缺點(diǎn)：酶和載體吸附力較弱，易解吸脫落。缺點(diǎn)：酶和載體吸附力較弱，易解吸脫落。 共價(jià)結(jié)合法共價(jià)結(jié)合法 借助共價(jià)鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體的功能基團(tuán)進(jìn)借助共價(jià)鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體的功能基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)制備固定化酶的方法。行偶聯(lián)制備固定化酶的方法。 常用載體常用載體 天然高分子及其衍生物：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝天然高分子及其衍生物：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)等；膠、甲殼質(zhì)等； 合成高聚物：聚丙烯酰胺、氨基酸共聚物、甲基

54、丙烯醇共合成高聚物：聚丙烯酰胺、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。聚物等。 酶分子中可形成共價(jià)鍵的基團(tuán)主要有：氨基、羧基、巰基、酶分子中可形成共價(jià)鍵的基團(tuán)主要有：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等。羥基、酚基和咪唑基等。 載體首先需活化，即引入活潑基團(tuán)。載體首先需活化，即引入活潑基團(tuán)。 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合很牢固，酶不會(huì)脫落，可以長期使用；優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合很牢固，酶不會(huì)脫落，可以長期使用； 缺點(diǎn)：載體活化的操作復(fù)雜，比較麻煩，同時(shí)在反應(yīng)過程缺點(diǎn)：載體活化的操作復(fù)雜，比較麻煩，同時(shí)在反應(yīng)過程中可能影響酶的空間構(gòu)象而影響其催化活性。中可能影響酶的空間構(gòu)象而影響其催化活性。 此法將

55、酶螯合到載螯合到載體表面的鈦(二價(jià)或四價(jià))、鉻(四價(jià))和釩(三價(jià))等金屬氫氧化物金屬氫氧化物上。 包埋法包埋法 將酶包埋在高分子凝膠微孔中或高分子半透膜微囊將酶包埋在高分子凝膠微孔中或高分子半透膜微囊內(nèi)，酶被包埋后不會(huì)擴(kuò)散到周圍介質(zhì)中，而底物和內(nèi)，酶被包埋后不會(huì)擴(kuò)散到周圍介質(zhì)中，而底物和產(chǎn)物卻能自由出入。產(chǎn)物卻能自由出入。 常用載體：瓊脂、海藻酸鈉、卡拉膠、明膠、聚丙常用載體：瓊脂、海藻酸鈉、卡拉膠、明膠、聚丙烯酰胺、火棉膠、尼龍等。烯酰胺、火棉膠、尼龍等。 根據(jù)載體材料和方法的不同，包埋法可分為根據(jù)載體材料和方法的不同，包埋法可分為 凝膠包埋法凝膠包埋法 半透膜（微膠囊）包埋法半透膜（微膠囊

56、）包埋法 脂質(zhì)體包埋法脂質(zhì)體包埋法 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)是： 有較好的適應(yīng)性，原則上既可固定化酶也可固定化不同種類、不同生理狀態(tài)的細(xì)胞； 條件溫和，方法簡便； 穩(wěn)定性好，特別是固定化細(xì)胞； 容量高，包埋法制備的固定化酶或固定化細(xì)胞的含量可達(dá)30 %- 60 % ，全部載體體積均可利用；包埋后載體可防止蛋白酶及機(jī)械作用對(duì)酶的損害。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)： 載體大分子對(duì)底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散阻力大，因此對(duì)作用于大分子底物的酶，固定化后活力較低，因底物不易穿透包埋物； 由于酶分子較小，故有時(shí)有漏出現(xiàn)象。 共價(jià)交聯(lián)法（架橋法）共價(jià)交聯(lián)法（架橋法） 利用雙功能或多功能試劑在酶分子間、酶分子與惰利用雙功能或多功能試劑在酶分子間、酶分子

57、與惰性蛋白間或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，制備固性蛋白間或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，制備固定化酶的方法。定化酶的方法。 常用試劑：戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶常用試劑：戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中戊二醛最為常用。氮苯等。其中戊二醛最為常用。 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，結(jié)合牢固，可長時(shí)間使用。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，結(jié)合牢固，可長時(shí)間使用。 缺點(diǎn)：交聯(lián)反應(yīng)條件較激烈，酶活力損失較大，缺點(diǎn)：交聯(lián)反應(yīng)條件較激烈，酶活力損失較大，且制成的固定化酶顆粒較小，機(jī)械強(qiáng)度也較低，且制成的固定化酶顆粒較小，機(jī)械強(qiáng)度也較低，使用不便。使用不便。 根據(jù)固定化對(duì)象確定固定化方法根據(jù)固定化對(duì)象確定

58、固定化方法： 一般對(duì)酶的固定化多采用共價(jià)結(jié)合、離子結(jié)合和物理吸附等方法；而固定化細(xì)胞則以包埋法有效。 根據(jù)固定化方法選擇載體：根據(jù)固定化方法選擇載體： 具有離子交換基團(tuán)和吸附蛋白質(zhì)能力的如CM纖維素、DEAE纖維素、CMSephadex、DEAESephadex及藻土、磷灰石等均可作為離子結(jié)合和物理吸附法的載體。而具有活性基團(tuán)如羥基、氨基、羧基、酰胺基、巰基的載體，如多糖類、蛋白質(zhì)類、多孔玻璃、硅膠等也可經(jīng)過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)結(jié)合上更活潑的基團(tuán)而直接用于和酶形成共價(jià)鍵而將酶固定化。上述載體都可用于共價(jià)鍵合法的載體，而能形成凝膠或進(jìn)行凝聚的瓊脂、角叉菜膠、海藻酸鹽、明膠、聚丙烯酰胺等，可作為包埋法的

59、載體。 這種方法實(shí)用意義不大，多用于下述輔助場(chǎng)這種方法實(shí)用意義不大，多用于下述輔助場(chǎng)合：合： 將酶蛋白和惰性蛋白交聯(lián)，從而減少目的將酶蛋白和惰性蛋白交聯(lián)，從而減少目的酶活力的大幅度降低；酶活力的大幅度降低； 為克服物理吸附法制備的固定化酶在使用為克服物理吸附法制備的固定化酶在使用時(shí)易脫落的缺點(diǎn)，用交聯(lián)劑將吸附好的酶交時(shí)易脫落的缺點(diǎn)，用交聯(lián)劑將吸附好的酶交聯(lián)在載體表面，形成一個(gè)交聯(lián)酶分子層，從聯(lián)在載體表面，形成一個(gè)交聯(lián)酶分子層，從而增加牢固程度、防止酶脫落；而增加牢固程度、防止酶脫落； 包埋法制備的固定化酶，由于載體孔徑大，包埋法制備的固定化酶，由于載體孔徑大，酶分子易漏出，包埋后進(jìn)行交聯(lián)，可防

60、止酶酶分子易漏出，包埋后進(jìn)行交聯(lián)，可防止酶漏出，同樣也可交聯(lián)包埋細(xì)胞。漏出，同樣也可交聯(lián)包埋細(xì)胞。 熱處理法熱處理法 將含酶細(xì)胞在一定溫度下加熱處理一段時(shí)間，使酶將含酶細(xì)胞在一定溫度下加熱處理一段時(shí)間，使酶固定在菌體內(nèi)而制得。固定在菌體內(nèi)而制得。 只適用于熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化。熱處理時(shí)，只適用于熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化。熱處理時(shí)，要嚴(yán)格控制好加熱溫度和時(shí)間，以免引起酶的變性要嚴(yán)格控制好加熱溫度和時(shí)間，以免引起酶的變性失活。失活。 例如：鏈霉菌細(xì)胞中葡萄糖異構(gòu)酶的固定化，可采例如：鏈霉菌細(xì)胞中葡萄糖異構(gòu)酶的固定化，可采用用6065下處理下處理15min。5.2固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì) 1