基因操作的工具酶

1、會計學(xué)1基因操作的工具酶基因操作的工具酶第1頁/共68頁第二章第二章 基因操作原理基因操作原理第一節(jié)第一節(jié) 分子克隆的工具酶分子克隆的工具酶第二節(jié)第二節(jié) 載體載體第三節(jié)第三節(jié) 電泳技術(shù)與分子雜交技術(shù)電泳技術(shù)與分子雜交技術(shù)第四節(jié)第四節(jié) 聚合酶鏈式反應(yīng)聚合酶鏈式反應(yīng)第五節(jié)第五節(jié) 基因克隆的策略基因克隆的策略第六節(jié)第六節(jié) 生物芯片生物芯片第七節(jié)第七節(jié) 基因文庫的構(gòu)建基因文庫的構(gòu)建第八節(jié)第八節(jié) 分子標記技術(shù)分子標記技術(shù)第1頁/共68頁第2頁/共68頁第一節(jié)第一節(jié) 基因操作的工具酶基因操作的工具酶一一 限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用二二 DNA連接酶及其應(yīng)用連接酶及其應(yīng)用三三 DNA聚

2、合酶及其應(yīng)用聚合酶及其應(yīng)用四四 修飾性工具酶修飾性工具酶Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer. 第2頁/共68頁第3頁/共68頁1 1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)2 2、限制性核酸內(nèi)切酶的分類和命名、限制性核酸內(nèi)切酶的分類和命名3 3、IIII型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4 4、限制性核酸內(nèi)切酶

3、的消化反應(yīng)、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)一一 限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用第3頁/共68頁第4頁/共68頁50年代初發(fā)現(xiàn)了由寄主控制的年代初發(fā)現(xiàn)了由寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象限制和修飾現(xiàn)象 (K) (B)大腸桿菌大腸桿菌B大腸桿菌大腸桿菌K1110 410 4E.O.P 成斑率成斑率efficiency of plating1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)E.coli C 100% 第4頁/共68頁第5頁/共68頁限制限制修飾的酶學(xué)假說修飾的酶學(xué)假說 (B) (B)酶切位點酶切位點不被修飾不被修飾噬菌體噬菌體DNA被切割被切割酶切位點酶切位點被修飾被修飾Met

4、hylation基因組基因組DNA不被切割不被切割1968年，年，Meselson 和和Yuan從大腸桿菌從大腸桿菌K和和B中發(fā)現(xiàn)了中發(fā)現(xiàn)了I型限制性核酸內(nèi)切酶；型限制性核酸內(nèi)切酶；1970年，年，Smith和和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離純化了第一個從流感嗜血桿菌中分離純化了第一個II型限制性核型限制性核 酸內(nèi)切酶酸內(nèi)切酶Hind II，使得，使得DNA分子的體外精確切割成為可能。分子的體外精確切割成為可能。KKBB第5頁/共68頁第6頁/共68頁限制性核酸內(nèi)切酶的概念限制性核酸內(nèi)切酶的概念已經(jīng)從近已經(jīng)從近300中微生物中分離出了中微生物中分離出了500余種限制性核酸內(nèi)切酶。余種限制性核

5、酸內(nèi)切酶。2、限制性核酸內(nèi)切酶的分類合命名限制性核酸內(nèi)切酶的分類合命名第6頁/共68頁第7頁/共68頁限制性核酸內(nèi)切酶的分類限制性核酸內(nèi)切酶的分類1. 限制修飾活性限制修飾活性2. 內(nèi)切酶的蛋白內(nèi)切酶的蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu)質(zhì)結(jié)構(gòu)3. 限制輔助因子限制輔助因子4. 切割位點切割位點5. 特異性切割特異性切割6. 基因克隆中基因克隆中 I 型型單一多功能的酶單一多功能的酶3種不同亞基種不同亞基ATP、Mg2+和和S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸距特異性位點距特異性位點1000bp不是不是無用無用 II 型型限制酶和修飾酶分開限制酶和修飾酶分開單一成分單一成分Mg2+特異性位點及其附近特異性位點及其附近是是非常

6、有用非常有用 III 型型雙功能酶雙功能酶2種亞基種亞基ATP、Mg2+和和S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸特異性位點特異性位點3端端24-26bp處處是是有用有用第7頁/共68頁第8頁/共68頁限制性核酸內(nèi)切酶的命名限制性核酸內(nèi)切酶的命名1、寄主菌屬名的第一個字母（大寫）和種名的頭兩寄主菌屬名的第一個字母（大寫）和種名的頭兩個字母（小寫）組成個字母（小寫）組成3 個個斜體字母斜體字母的略語表示酶來源的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌的菌種名稱，如大腸桿菌Escherichia coli 表示為表示為Eco , 流感嗜血菌流感嗜血菌Hemophilus influenzae 表示為表示為 Hi

7、n；2、用一個正體字母表示菌株的類型，比如用一個正體字母表示菌株的類型，比如EcoR、Hind；3、如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修飾體系，則飾體系，則 用羅馬數(shù)字標出，比如用羅馬數(shù)字標出，比如EcoR I、 Hind III。第8頁/共68頁第9頁/共68頁第9頁/共68頁第10頁/共68頁3. II型限制性核酸內(nèi)切酶的型限制性核酸內(nèi)切酶的3大特點大特點1、識別位點的特異性、識別位點的特異性 每種酶都有其特定的每種酶都有其特定的DNA識別識別 位點，通常是由位點，通常是由4、5、6或或7個核苷酸組成的特定序個核苷酸組成的特定序 列（靶序列）

8、。列（靶序列）。2、識別序列的對稱性、識別序列的對稱性 靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱 的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。3、切割位點的規(guī)范性、切割位點的規(guī)范性 雙鏈雙鏈DNA被酶切后，分布在兩被酶切后，分布在兩 條鏈上的切割位點旋轉(zhuǎn)對稱（可形成粘性末端或平條鏈上的切割位點旋轉(zhuǎn)對稱（可形成粘性末端或平 末端的末端的DNA分子）。分子）。第10頁/共68頁第11頁/共68頁與與II型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個概念型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個概念粘性末端粘性末端 cohesive ends 因酶切位點在兩條因酶切位點在兩條DNA單鏈上不同（對稱）

9、酶單鏈上不同（對稱）酶 切后形成的具有互補堿基的單鏈末端結(jié)構(gòu)，酶切產(chǎn)生的兩個粘性末端切后形成的具有互補堿基的單鏈末端結(jié)構(gòu)，酶切產(chǎn)生的兩個粘性末端 很很 容易容易通過互補堿基的配對而重新通過互補堿基的配對而重新連接連接起來。起來。平平 末末 端端 Blunt end 因酶切位點在兩條因酶切位點在兩條DNA單鏈上相同，酶切后形成的平齊單鏈上相同，酶切后形成的平齊 的末端結(jié)構(gòu)，這種末端的末端結(jié)構(gòu)，這種末端不易不易重新重新連接連接起來。起來。同位酶同位酶 識別相同序列的酶稱為同位酶。識別相同序列的酶稱為同位酶。同裂酶同裂酶 isoschizomers 能識別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同內(nèi)切酶。能識別

10、和切割同樣的核苷酸靶序列的不同內(nèi)切酶。（切割位點不同）（同序同切酶、同序異切酶）（切割位點不同）（同序同切酶、同序異切酶）同尾酶同尾酶 isocaudamers 識別的靶序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的一識別的靶序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的一 類限制性核酸內(nèi)切酶。類限制性核酸內(nèi)切酶。注注 意：意： 由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶 消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的 任一種所識別。任一種所識別。第11頁/共68頁第12頁/共68頁幾種

11、幾種IIII型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點Pst IProvindencia stuartii 164 CTGCAGGACGTCHaemophilus influenzae Rd 第12頁/共68頁第13頁/共68頁 經(jīng)同尾酶消化的經(jīng)同尾酶消化的DNA末端連接示意圖末端連接示意圖5 XXXXG GATCCXXXXXX 33 XXXXCCTAG GXXXXXX 5BamH I5 XXXXG GATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAG GXXXXXX 55 XXXXA GATCTXXXXXX 33 XXXXTCTAG AXXXXXX 5Bgl II5 XXXXA

12、GATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG AXXXXXX 55 XXXXA GATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAGGXXXXXX 5BamH IBgl II第13頁/共68頁第14頁/共68頁 推測酶切割位點出現(xiàn)的頻率對于推斷推測酶切割位點出現(xiàn)的頻率對于推斷DNA酶切片段大小很有用。酶切片段大小很有用。假定假定4種核苷酸在種核苷酸在DNA分子上出現(xiàn)的頻率相同，那么靶序列為分子上出現(xiàn)的頻率相同，那么靶序列為6個核苷酸的內(nèi)切酶個核苷酸的內(nèi)切酶在每在每46（=4096）個核苷酸中酶切位點就有一次

13、出現(xiàn)機會。據(jù)此推算，一條個核苷酸中酶切位點就有一次出現(xiàn)機會。據(jù)此推算，一條49000bp長的長的DNA中有中有12個個6核苷酸識別序列的酶切位點（核苷酸識別序列的酶切位點（49000/4096）。但）。但事實上并非真正如此，因為事實上并非真正如此，因為DNA分子中分子中4種堿基的出現(xiàn)頻率并不均等。種堿基的出現(xiàn)頻率并不均等。識別位點在識別位點在DNA分子上出現(xiàn)的頻率分子上出現(xiàn)的頻率第14頁/共68頁第15頁/共68頁 一個酶活單位一個酶活單位（U）指：指：在理想的反應(yīng)條件（適宜在理想的反應(yīng)條件（適宜的緩沖液和反應(yīng)溫度，通常為的緩沖液和反應(yīng)溫度，通常為37）下，）下，50 L反應(yīng)體反應(yīng)體系中完全降

14、解系中完全降解1 g DNA所需要的酶量。所需要的酶量。影響酶活性的因素很多，最重要的有：影響酶活性的因素很多，最重要的有：A。DNA的純度和甲基化程度的純度和甲基化程度B。甘油的含量（不超過甘油的含量（不超過5%）C。反應(yīng)體系中的離子強度反應(yīng)體系中的離子強度D。反應(yīng)體系的反應(yīng)體系的pH值值F。反應(yīng)的溫度條件反應(yīng)的溫度條件 （通常為（通常為37 ）酶單位的定義和影響酶活性的因素酶單位的定義和影響酶活性的因素Buffer (10X) 2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LEnzyme 0.5 LVolume 20.0 L 4、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)第

15、15頁/共68頁第16頁/共68頁酶酶 切切 反反 應(yīng)應(yīng) 的的 基基 本本 步步 驟驟電泳紫外分析37 1h加反應(yīng)液CKMBuffer (10X) 2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 L（ 1 g/ L ）Enzyme 0.5 LVolume 20.0 L 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT第16頁/共68頁第17頁/共68頁第17頁/共68頁第18頁/共68頁1、DNA連接酶作用的特點連接酶作用的特點2、DNA連接酶的反應(yīng)條件連接酶的反應(yīng)條件3、DNA連接的策略連接的策略二二 DNA連接酶及其應(yīng)用連接酶及其應(yīng)用第18頁/共68頁第19頁/共68頁DNA

16、連接酶的發(fā)現(xiàn)連接酶的發(fā)現(xiàn) 環(huán)形環(huán)形DNADNA分子的發(fā)現(xiàn)使科學(xué)家相信一定有一種能連接這種分子的發(fā)現(xiàn)使科學(xué)家相信一定有一種能連接這種NickNick的酶存在。的酶存在。 19671967年，世界上幾個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在年，世界上幾個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2 2條條 DNADNA鏈之間形成鏈之間形成磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵的酶的酶DNADNA連接酶（連接酶（ligaseligase）。DNA連接酶連接酶 由大腸桿菌基因組由大腸桿菌基因組DNA編碼，以編碼，以NAD+作為能源輔助因子作為能源輔助因子；T4DNA連接酶連接酶 由大腸桿菌由大腸桿菌T4噬菌體噬菌體DNA編碼，以編

17、碼，以ATP作為能源輔助因子。作為能源輔助因子。（1970年）年） 容易制備，而且可以連接完全配對的平末端容易制備，而且可以連接完全配對的平末端DNA分子，所分子，所 以在基因克隆中應(yīng)用廣泛。以在基因克隆中應(yīng)用廣泛。NickNick1、DNA連接酶作用的特點連接酶作用的特點第19頁/共68頁第20頁/共68頁DNA連接酶作用的特點連接酶作用的特點A. 連接的兩條鏈必須分別具有連接的兩條鏈必須分別具有 3端自由羥基（端自由羥基（-OH） 和和5 端磷酸基團（端磷酸基團（-P），而且只有這兩個基團彼），而且只有這兩個基團彼 此相鄰時才能進行連接反應(yīng)；此相鄰時才能進行連接反應(yīng)；B. 在羥基和磷酸基團

18、間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過在羥基和磷酸基團間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過 程，因此連接反應(yīng)必須有能量分子的參與，通常有程，因此連接反應(yīng)必須有能量分子的參與，通常有 兩種能量分子，即兩種能量分子，即ATP和和NAD+。OKNO第20頁/共68頁第21頁/共68頁第21頁/共68頁第22頁/共68頁載體去磷防止自連的應(yīng)用示例載體去磷防止自連的應(yīng)用示例POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH連接酶連接酶連接酶連接酶連接酶連接酶堿性磷酸酶堿性磷酸酶2Pi寄主修復(fù)缺口寄主修復(fù)缺口載體自連或產(chǎn)載體自連或產(chǎn)生二具體等生二具體等第22頁/共68頁第23頁/共68頁2.DNA連接反應(yīng)的條件連接反

19、應(yīng)的條件 連接反應(yīng)最佳溫度為連接反應(yīng)最佳溫度為3737，但是此時粘性末端間氫鍵結(jié)合不，但是此時粘性末端間氫鍵結(jié)合不夠穩(wěn)定，而且酶活性也會迅速降低。比如，夠穩(wěn)定，而且酶活性也會迅速降低。比如，EcoRI EcoRI 粘性末端連接粘性末端連接部位只有部位只有4 4個堿基對，很容易斷開。所以個堿基對，很容易斷開。所以通常在通常在4-154-15連接。連接。影響連接效率的因素有：影響連接效率的因素有：A. A. 溫度（最主要的因素）溫度（最主要的因素）B. ATPB. ATP的濃度的濃度( 1 M - 10 M )C. C. 連接酶濃度（平末端較粘性末端要求高）連接酶濃度（平末端較粘性末端要求高）D.

20、 D. 反應(yīng)時間（通常連接過夜）反應(yīng)時間（通常連接過夜）E. E. 插入片段和載體片段插入片段和載體片段 的摩爾比的摩爾比轉(zhuǎn)化4 過夜加反應(yīng)液CK-重組菌落重組菌落CK+第23頁/共68頁第24頁/共68頁粘性末端粘性末端DNA片段的連接片段的連接NickNick3、DNA連接的策略連接的策略第24頁/共68頁第25頁/共68頁平末端平末端DNA片段的末端加尾連接法片段的末端加尾連接法33553355末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶+dATP+dTTP3355AAAAA3355TTTTDNADNA聚合酶聚合酶和和T4DNAT4DNA連接酶連接酶第25頁/共68頁第26頁/共68頁平末端平末端D

21、NA片段加接頭連接法片段加接頭連接法 銜接物銜接物(linker)(linker)，也叫接頭，也叫接頭，是由人工化學(xué)合成的一段是由人工化學(xué)合成的一段10-10-1212個核苷酸的個核苷酸的DNADNA雙鏈，其中包含有雙鏈，其中包含有1 1個或幾個限制性酶切位點。個或幾個限制性酶切位點。使用時只須將銜接物和目的片段的使用時只須將銜接物和目的片段的55端用多核苷酸激酶處理使端用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后用之磷酸化，然后用T4DNAT4DNA連接酶進行連接，就可獲得能產(chǎn)生粘性連接酶進行連接，就可獲得能產(chǎn)生粘性末端的末端的DNADNA片段。片段。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸化磷酸

22、化CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHOHPPPOHOHT4連接酶連接酶CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHPOHEcoR ICCGAATTCGGGGCTTAAGCCAATTCGGGCCCCGGGCTTAA第26頁/共68頁第27頁/共68頁第27頁/共68頁第28頁/共68頁第28頁/共68頁第29頁/共68頁第一節(jié)第一節(jié) 基因操作的工具酶基因操作的工具酶一一 限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用二二 DNA連接酶及其應(yīng)用連接酶及其應(yīng)用三三 DNA聚合酶及其應(yīng)用聚合酶及其應(yīng)用四四 修飾性工具酶修飾性工具酶Genetic engineering is large

23、ly an exercise in carefully controlled enzymology. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer. 第29頁/共68頁第30頁/共68頁1、大腸桿菌、大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶 I2、Klenow片段片段3、T4 DNA聚合酶聚合酶4、逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）、逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）三三 DNA聚合酶及其應(yīng)用聚合酶及其應(yīng)用第30頁/共68頁第31頁/共68頁 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I （E。Coli DNA pol I）是）是Kornberg A.

24、1956年首先從大腸桿菌年首先從大腸桿菌E。Coli 細胞中分離出來的。它是一細胞中分離出來的。它是一種多功能性的酶，包括種多功能性的酶，包括 3 3 種不同的酶活力：種不同的酶活力：A. 5- 3聚合酶活性聚合酶活性 以雙鏈以雙鏈DNA為模板，催化單核苷酸結(jié)合到引為模板，催化單核苷酸結(jié)合到引物的物的3-OH末端，并不斷延伸。末端，并不斷延伸。B. 5- 3外切酶活性外切酶活性 將雙鏈將雙鏈DNA中游離的中游離的5末端逐個切去。末端逐個切去。C. 3 - 5外切酶活性外切酶活性 將游離的雙鏈或單鏈將游離的雙鏈或單鏈DNA的的3端降解。不過端降解。不過對于雙鏈的降解可被對于雙鏈的降解可被5-3的

25、多聚活性所抑制。的多聚活性所抑制。CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPol I + Mg2+ATAGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPol I + Mg2+CCGATAGCCTGGCTAPol I + Mg2+T第31頁/共68頁第32頁/共68頁 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I 的三種用途的三種用途A. 制備高比活度的制備高比活度的DNA探針探針 利用其利用其5 3的外切酶活性及其聚合酶活性。的外切酶活性及其聚合酶活性。B. 用于用于DNA連接后的大缺口填充連接后的大缺口填充 利用利用

26、5 3的聚合酶活性。的聚合酶活性。C. 用于用于DNA的序列分析的序列分析 利用利用5 3的聚合酶活性。的聚合酶活性。第32頁/共68頁第33頁/共68頁 大腸桿菌聚合酶大腸桿菌聚合酶I的應(yīng)用示例的應(yīng)用示例CCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTATCGGAPol I + Mg2+切口平移(Nick translation)CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPol I + Mg2+ATAGCCT第33頁/共68頁第34頁/共68頁1、大腸桿菌、大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I2、Klenow片段片段3、T4 DNA聚合酶聚合酶4、逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）、

27、逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）三三 DNA聚合酶及其應(yīng)用聚合酶及其應(yīng)用第34頁/共68頁第35頁/共68頁 Klenow片段的主要用途片段的主要用途Klenow片段片段大腸桿菌聚合酶大腸桿菌聚合酶 I 全酶經(jīng)全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生處理后產(chǎn)生的大片段酶分子，它仍然有的大片段酶分子，它仍然有5 3的聚合酶活性和的聚合酶活性和3 5 的核酸外切酶的核酸外切酶活性，但失去了活性，但失去了5 3的外切酶活性。的外切酶活性。Klenow片段片段的主要用途的主要用途A. 修補限制性酶消化修補限制性酶消化DNA形成的形成的3隱蔽末端隱蔽末端B. 標記標記DNA片段的末端片段的末端C. cDNA克隆

28、中第二鏈克隆中第二鏈cDNA的合成的合成D. DNA序列的測定序列的測定GAACTTAA第35頁/共68頁第36頁/共68頁1、大腸桿菌、大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I2、Klenow片段片段3、T4 、T7 DNA聚合酶聚合酶4、逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）、逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）三三 DNA聚合酶及其應(yīng)用聚合酶及其應(yīng)用第36頁/共68頁第37頁/共68頁 T4、T7 DNA聚合酶的特點聚合酶的特點 T4 DNA聚合酶是聚合酶是從從T4 噬菌體感染了的大腸桿菌中噬菌體感染了的大腸桿菌中分離出來的，它和分離出來的，它和大腸桿菌聚合酶大腸桿菌聚合酶 I一樣一樣具有具有5 3的聚的聚合酶活性、合酶活性、 5

29、3的外切酶活性和的外切酶活性和3 5 的核酸外切酶活的核酸外切酶活性。性。其外切酶活性要比大腸桿菌聚合酶其外切酶活性要比大腸桿菌聚合酶 I 的活性高的活性高200倍。倍。 T7 DNA聚合酶是聚合酶是從從T7 噬菌體感染了的大腸桿菌中噬菌體感染了的大腸桿菌中分離出來的，分離出來的， T7 DNA聚合酶是所有聚合酶是所有DNA聚合酶中聚合酶中 持持續(xù)合成能力最強的一種酶，續(xù)合成能力最強的一種酶，其其3 5 的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性是是Klenow DNA聚合酶的聚合酶的1000倍。倍。 T7 DNA聚合酶可以聚合酶可以替代替代T4 DNA聚合酶的功能并能用于大片斷的擴增。聚合酶的功能并能

30、用于大片斷的擴增。第37頁/共68頁第38頁/共68頁 T4 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途1、以填充反應(yīng)標記有、以填充反應(yīng)標記有5端延伸的雙鏈端延伸的雙鏈 DNA片段；片段；2、以取代反應(yīng)標記延伸末端或平頭末端、以取代反應(yīng)標記延伸末端或平頭末端 的雙鏈的雙鏈DNA片段；片段；3、用于、用于DNA序列分析；序列分析；第38頁/共68頁第39頁/共68頁第39頁/共68頁第40頁/共68頁1、大腸桿菌、大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I2、Klenow片段片段3、T4 DNA聚合酶聚合酶4、逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）、逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）三三 DNA聚合酶及其應(yīng)用聚合酶及其應(yīng)用第40頁/共68頁第41頁/共

31、68頁 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶Reverse transcriptase逆轉(zhuǎn)錄酶是逆轉(zhuǎn)錄酶是 一種可以有效地將一種可以有效地將mRNA轉(zhuǎn)錄成為轉(zhuǎn)錄成為DNA的酶，其產(chǎn)物稱為的酶，其產(chǎn)物稱為cDNA (complementary DNA). 實際實際上，它也是一種上，它也是一種RNA依賴的依賴的DNA聚合酶。聚合酶。逆轉(zhuǎn)錄酶首先是逆轉(zhuǎn)錄酶首先是1970年從鼠白血病毒和勞氏肉瘤病毒年從鼠白血病毒和勞氏肉瘤病毒中發(fā)現(xiàn)的。中發(fā)現(xiàn)的。這兩個課題組的論文都發(fā)在了同一期的這兩個課題組的論文都發(fā)在了同一期的Nature雜志上。雜志上。主要用途是主要用途是 將將mRNA轉(zhuǎn)錄成轉(zhuǎn)錄成cDNA以制備基因片段以制備基因片段

32、。3 AAAAAAAA AAAAAAAA5 TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5 TTTTTTTTT3 AAAAAAAA 第41頁/共68頁第42頁/共68頁第一節(jié)第一節(jié) 基因操作的工具酶基因操作的工具酶一一 限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用二二 DNA連接酶及其應(yīng)用連接酶及其應(yīng)用三三 DNA聚合酶及其應(yīng)用聚合酶及其應(yīng)用四四 修飾性工具酶修飾性工具酶Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology. A variety of enzymes form th

33、e basic toolkit of the genetic engineer. 第42頁/共68頁第43頁/共68頁1、末端轉(zhuǎn)移酶（、末端轉(zhuǎn)移酶（terminal transferase）2、核酸酶、核酸酶SI（SI nuclease）4、堿性磷酸化酶、堿性磷酸化酶四四 修飾性工具酶修飾性工具酶第43頁/共68頁第44頁/共68頁末端轉(zhuǎn)移酶的特性末端轉(zhuǎn)移酶的特性l末端轉(zhuǎn)移酶是一類不依賴于末端轉(zhuǎn)移酶是一類不依賴于DNA模板的模板的DNA聚合酶。聚合酶。l該類酶可以在沒有模板鏈存在的情況下，該類酶可以在沒有模板鏈存在的情況下，將核苷酸連接到將核苷酸連接到DNA的在的在3 羥基，特別羥基，特別是對

34、于平末端的雙鏈是對于平末端的雙鏈DNA末端加尾十分有末端加尾十分有效。效。l最常見的用途是在酶切產(chǎn)生的平末端加尾最常見的用途是在酶切產(chǎn)生的平末端加尾以便于創(chuàng)造粘性的互補末端以便于創(chuàng)造粘性的互補末端。第44頁/共68頁第45頁/共68頁平末端平末端DNA片段的末端加尾連接法片段的末端加尾連接法33553355末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶+dATP+dTTP33553355AAAAATTTTDNADNA聚合酶和聚合酶和T4DNAT4DNA連接酶連接酶第45頁/共68頁第46頁/共68頁1、末端轉(zhuǎn)移酶（、末端轉(zhuǎn)移酶（terminal transferase）2、核酸酶、核酸酶SI（SI nucl

35、ease）3、堿性磷酸化酶（、堿性磷酸化酶（Alkaline phosphatase）四四 修飾性工具酶修飾性工具酶第46頁/共68頁第47頁/共68頁 核酸酶核酸酶SI的特性的特性 這是一種從米曲霉（這是一種從米曲霉（Aspergillus oryzae）中分）中分離的可以降解單鏈離的可以降解單鏈DNA或或RNA的外切酶的外切酶。其主要用途有其主要用途有（降解單鏈核酸）（降解單鏈核酸）A、在、在cDNA合成過程中，切開合成過程中，切開cDNA的發(fā)夾末端；的發(fā)夾末端；B、載體構(gòu)建過程中，切去、載體構(gòu)建過程中，切去DNA片段的單鏈尾巴，片段的單鏈尾巴， 形成平末端結(jié)構(gòu)。形成平末端結(jié)構(gòu)。第47頁/

36、共68頁第48頁/共68頁3 AAAAAAAA AAAAAAAA5 TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5 TTTTTTTTT3 AAAAAAAA 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的切除發(fā)夾結(jié)構(gòu)的切除TTAAAATT單鏈尾巴的切除單鏈尾巴的切除第48頁/共68頁第49頁/共68頁1、末端轉(zhuǎn)移酶（、末端轉(zhuǎn)移酶（terminal transferase）2、核酸酶、核酸酶SI（SI nuclease）3、堿性磷酸化酶、堿性磷酸化酶四四 修飾性工具酶修飾性工具酶第49頁/共68頁第50頁/共68頁 堿性磷酸化酶的特性堿性磷酸化酶的特性 從細菌中分離的堿性磷酸化酶簡稱從細菌中分離的堿性磷酸化酶簡稱BAP（Ba

37、cterial Alkaline Phosphatase），從小牛腸中分離的簡稱），從小牛腸中分離的簡稱CAP（Calf Alkaline Phosphatase）.其主要功能是將其主要功能是將DNA或或RNA5端的磷酸切除。端的磷酸切除。其主要用途有：其主要用途有：A、在用、在用P標記標記DNA 5端之前，去除端之前，去除5端的磷；端的磷；B、在、在DNA重組技術(shù)中，去除重組技術(shù)中，去除DNA片段的片段的5磷酸，防磷酸，防 止載體的自身環(huán)化。止載體的自身環(huán)化。第50頁/共68頁第51頁/共68頁載體去磷防止自連的應(yīng)用示例載體去磷防止自連的應(yīng)用示例POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHO

38、HOHOH連接酶連接酶連接酶連接酶連接酶連接酶堿性磷酸酶堿性磷酸酶2Pi寄主修復(fù)缺口寄主修復(fù)缺口載體自連或產(chǎn)載體自連或產(chǎn)生二具體等生二具體等第51頁/共68頁第52頁/共68頁第52頁/共68頁第53頁/共68頁第一節(jié)第一節(jié) 基因操作的工具酶基因操作的工具酶一一 限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用二二 DNA連接酶及其應(yīng)用連接酶及其應(yīng)用三三 DNA聚合酶及其應(yīng)用聚合酶及其應(yīng)用四四 修飾性工具酶修飾性工具酶第53頁/共68頁第54頁/共68頁1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)2、限制性核酸內(nèi)切酶的分類合命名、限制性核酸內(nèi)切酶的分類合命名3、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基

39、本特性型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)一一 限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用第54頁/共68頁第55頁/共68頁1、DNA連接酶作用的機理連接酶作用的機理2、DNA連接酶的反應(yīng)條件連接酶的反應(yīng)條件3、DNA連接的策略連接的策略二二 DNA連接酶及其應(yīng)用連接酶及其應(yīng)用第55頁/共68頁第56頁/共68頁1、大腸桿菌、大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I2、Klenow片段片段3、T4 DNA聚合酶聚合酶4、逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）、逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）三三 DNA聚合酶及其應(yīng)用聚合酶及其應(yīng)用第56頁/共68頁第57頁/共68頁1、末端轉(zhuǎn)移酶（、末端轉(zhuǎn)移酶（terminal transferase）2、核酸酶、核酸酶SI（SI nuclease）4、堿性磷酸化酶（、堿性磷酸化酶（Alkaline phosphatase）四四 修飾性工具酶修飾性工具酶第57頁/共68頁第58頁/共68頁基因工程的基本步驟基因工程的基本步驟基因分基因分離酶切離酶切載體酶切載體酶切基因和載基因和載體連接體連接導(dǎo)入細菌導(dǎo)入細菌重組質(zhì)粒繁殖重組質(zhì)粒繁殖重組克隆的選擇重組克隆的選擇序列分析和基序列分析和基因表達等研究因表達等研究導(dǎo)入導(dǎo)入植物植物細胞細胞第58頁/共68頁第59頁/共68頁第59頁/共68頁第60頁/