southern雜交和測序

1、1. Southern blotting, for detecting DNA ;2. Northern blotting, for detecting RNA;3. Western blotting, for detecting protein.Southern and Northern blottingBlot typeTargetProbeApplicationsSouthern DNA DNA or RNAmapping genomic clonesestimating gene numbersNorthernRNADNA or RNARNA sizes, abundance,and

2、expressionWesternProteinAntibodiesprotein size, abundanceSouthern and Northern blottingDNA on blotRNA on blot1.Genomic DNA preparation RNA preparation2.Restriction digestion-3.Denature with alkaliby formamide4. Agarose gel electrophoresis 5. DNA blotting/transfer and fixation RNA6. Probe labeling 7.

3、 Hybridization (temperature) 8. Signal detection (X-ray film or antibody) Southern blotting1.Genomic DNA preparation2.Restriction digestion3.Denature with alkali4.Agarose gel electrophoresis 5.DNA blotting/ transfer and fixation6.Probe labeling 7.Hybridization (temperature) 8.Signal detection (X-ray

4、 film or antibody)Stringency (嚴厲度，緊張性嚴厲度，緊張性): Determined by hybridization temperature and salt concentration in the hybridization buffer. High temperature and low salt is more stringent as only perfectly matched hybrids remain stable.Formamide （甲酰胺，甲酰胺，50）in hybridization buffer reduce the actual h

5、ybridization temperature by 25C (from 68C to 43C )Washing temperature: 12C below theoretical melting temperature (理論熔解溫度，理論熔解溫度，Tm)Tm = 69.3C + 0.41 (G+C) % 650/L, where L is the length of probe moleculeNorthern blotting for detecting:Length of mRNAWhether a genomic clone has regions that are transc

6、ribed 基基因組克隆是否含有轉(zhuǎn)錄區(qū)因組克隆是否含有轉(zhuǎn)錄區(qū)Differential expression in tissues and cellsZoo blots (多物種印跡）多物種印跡）: blots with DNA/RNA samples from different organisms for detecting conserved genes between species（不同生物體的印跡檢測種間保守（不同生物體的印跡檢測種間保守基因）基因）.NCBI的另一個網(wǎng)站，EntrezOMIM:人類孟德爾遺傳在線人類孟德爾遺傳在線Books :在線圖書在線圖書Taxonomy, Ge

7、nBank中收錄生物的分類中收錄生物的分類Structure ：大分子三：大分子三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PubMed,生物醫(yī)學文獻，包括生物醫(yī)學文獻，包括植物分子生物學文獻，但不包植物分子生物學文獻，但不包括傳統(tǒng)植物文獻括傳統(tǒng)植物文獻 NCBI的另一個網(wǎng)站，Entrez (http:/www.ncbi. /Entrez/)把文獻檢索、基因數(shù)據(jù)、應用軟件、生物分類、相關(guān)圖書等資源都整合到了一起，應用起來非常方便，所以如果要到GenBank，最好通過Entrez。 Entrez網(wǎng)站包括以下主要內(nèi)容（均可網(wǎng)站包括以下主要內(nèi)容（均可點擊鏈接）：點擊鏈接）：(1)PubMed,生

8、物醫(yī)學文獻，包括植物生物醫(yī)學文獻，包括植物分子生物學文獻，但不包括傳統(tǒng)植物分子生物學文獻，但不包括傳統(tǒng)植物文獻；文獻；(2)Books ，在線圖書；，在線圖書；(3)OMIM，人類孟德爾遺傳在線網(wǎng)，人類孟德爾遺傳在線網(wǎng)（online mendelian inheritance in man）,主要用于醫(yī)學；主要用于醫(yī)學；(4)GenBank，核苷酸序列數(shù)據(jù)庫；，核苷酸序列數(shù)據(jù)庫；(5)Protein sequence database, 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫；序列數(shù)據(jù)庫；(6)CDD，保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)。，保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)。(7) 3D Domains，來自，來自Entrez Structure結(jié)

9、構(gòu)域數(shù)據(jù)；結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)；(8)UniSTS,標記和作圖數(shù)據(jù)；標記和作圖數(shù)據(jù)；(9) PopSet ，群體研究數(shù)據(jù)組合，群體研究數(shù)據(jù)組合(10) Genome ，完全組裝后的基因組，完全組裝后的基因組序列；序列；(11) Structure ，大分子三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，大分子三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫；庫； (12) Taxonomy, GenBank中收錄生物中收錄生物的分類；的分類；(13)SNP，單核苷酸多態(tài)性，單核苷酸多態(tài)性。 點擊Entrez“Genome”，就可以進入到基因組數(shù)據(jù)庫，既可以尋找任何生物的基因組，又可以到各類生物群體中去瀏覽，如:微生物基因組；細胞器基因組；植物基因組中心；病毒基因組等等。

10、 還有用于基因組研究的主要計算機軟件：TaxPlot(基因組相似性比較)；COGs（clusters of orthologous groups of protein,正源蛋白質(zhì)類聚)；BLAST（尋找同源序列）。 點擊點擊“Plant genomes Central” ，就會進入如下幾大，就會進入如下幾大類：類：Genome projects in progress (正在進行的基因組計劃正在進行的基因組計劃)； Plant-oriented resources at NCBI （NCBI與植物有關(guān)的資與植物有關(guān)的資源）；源）； Large-scale sequencing projects

11、（大規(guī)模序列分析項（大規(guī)模序列分析項目）；目）；Genetic maps（遺傳圖譜）；（遺傳圖譜）； Large-scale EST sequencing projects（大規(guī)模（大規(guī)模EST序列分析序列分析項目）。項目）。 點擊點擊“Large-scale sequencing projects”中的中的“Arabidopsis thaliana” (擬南芥擬南芥)，就會被鏈接到一，就會被鏈接到一個含有擬南芥基因組個含有擬南芥基因組5條染色體及線粒體和葉綠體圖條染色體及線粒體和葉綠體圖像的界面。像的界面?；蚪M基因組5條染色體（條染色體（ I 、II、III、IV、V）；）；葉綠體（葉綠體

12、（CHL） ；線粒體（線粒體（MT）；）； 還可以將任何基因序列與擬南芥基因組比較還可以將任何基因序列與擬南芥基因組比較（點擊右上角的（點擊右上角的“BLAST search Arabidopsis genome”）。）。 如果點擊染色體如果點擊染色體I，就會看到，就會看到擬南芥第一條染色體的整體圖：擬南芥第一條染色體的整體圖：克隆、基因的分布；克隆、基因的分布；基因序列（蛋白質(zhì)、基因序列（蛋白質(zhì)、mRNA）的鏈接；的鏈接；基因產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與功能的分析鑒基因產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與功能的分析鑒定資料鏈接（定資料鏈接（TIGR MIPS TAIR，擬南芥的三大數(shù)據(jù)庫）；，擬南芥的三大數(shù)據(jù)庫）；該基因的描述：該基因的描述：s