DB23∕T 3169-2022 大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤能力與固氮效果評價技術(shù)規(guī)程

1、 ICS 65.020.20CCS B05DB23黑 龍 江 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB23/T 31692022大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤能力與固氮效果評價技術(shù)規(guī)程2022-05-09發(fā)布2022-06-08實施 DB23/T 31692022前言本文件依據(jù) GB/T 1.1-2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。I DB23/T 31692022大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤能力與固氮效果評價技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤能力與固氮效果評價技術(shù)的術(shù)語和定義、結(jié)瘤能力評價與固氮效果評價的方法。本文件適用于外源接種大豆根瘤菌的效果評價。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過

2、文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室技術(shù)要求GB/T 19495.3-2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸提取純化方法NY/T 2066-2011微生物肥料生產(chǎn)菌株的鑒別聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1占瘤率應(yīng)用特定根瘤菌株接種豆科植物與土著根瘤菌競爭結(jié)瘤,在競爭中特定根瘤菌結(jié)瘤數(shù)占總瘤數(shù)的百分?jǐn)?shù)稱為占瘤率。占瘤率是評估接種根瘤菌相對土著根瘤菌的競爭結(jié)瘤能力的重要參數(shù)。3.2競爭結(jié)瘤能力根瘤菌能

3、夠在宿主豆科植物上形成根瘤，而且它在其他根瘤菌存在的情況下，也能與相同的豆科植物結(jié)瘤的能力，叫做競爭結(jié)瘤能力。3.3固氮能力固氮能力是根瘤菌將分子態(tài)氮還原成氨和其他含氮化合物的能力，通過對比接種待測菌株與未接種處理的根瘤固氮酶活性和植株全氮含量來評價。4結(jié)瘤能力評價4.1一般要求實驗室操作人員應(yīng)具備良好的分子生物學(xué)專業(yè)技能，操作熟練。有毒、有害、廢棄物的處理及安全防護(hù)應(yīng)符合GB/T 19495.2的要求。1 DB23/T 316920224.2原理利用BOX-PCR指紋圖譜比較，檢測接種根瘤菌菌株的占瘤率，以此評價供試菌株相對于土著根瘤菌的競爭結(jié)瘤能力；根據(jù)根瘤固氮酶活性和大豆植株全氮含量，協(xié)

4、同評價根瘤菌的固氮能力。4.3主要材料與用具鐵鍬、小鏟、鑷子、記號筆、塑料袋、剪刀、冰盒、小型離心機(jī)、微量可調(diào)移液器及對應(yīng)的無菌Tip頭、1.5mL無菌離心管、振蕩培養(yǎng)箱（搖床）、靜置培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、分光光度計、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、超凈工作臺、PCR儀、電泳儀及電泳槽、凝膠成像分析儀等。4.4占瘤率測定方法4.4.1蛭石盆栽實驗中根瘤菌占瘤率的測定根瘤菌占瘤率的測定按照如下程序進(jìn)行：a ）大豆種子的處理精選無病、飽滿、大小一致的大豆種子，經(jīng)過75%酒精處理2min、20%次氯酸鈉處理5min、無菌水水洗3次后置于1%水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待其萌芽后種植于滅菌的蛭石中，進(jìn)行蛭石盆栽

5、培養(yǎng)，每盆 3粒4粒大豆種子。b ）根瘤菌接種將根瘤菌接種于YMA培養(yǎng)基（配方見附錄A）上，5 d后用生理鹽水將菌體洗下來。待大豆對生真葉展開時，將上述菌懸液接種于根部，每盆約5mL菌液（OD600=1.0），每個菌株接種3棵4棵植株。以不接種無菌生理鹽水的大豆為陰性對照。c ）根瘤中收獲類菌體蛭石盆栽培養(yǎng)45 d后收獲根瘤，每個盆中隨機(jī)挑取3個5個根瘤，分別用75%乙醇消毒1 min、15%次氯酸鈉消毒3min、無菌水水洗3次后置于滅菌的EP管中，用滅菌的鑷子將根瘤搗碎后，使根瘤內(nèi)汁液流出，去除植物根瘤組織后，加入10L的無菌水，13000rpm離心3min，保留沉淀，即為收獲的類菌體。d）

6、類菌體DNA的制備在上述收獲的類菌體中加入10L無菌水充分懸浮類菌體，混勻后于沸水中煮沸5 min，然后迅速移入冰上冰浴5 min，隨后進(jìn)行13000 rpm離心3 min，取上清液，參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取根瘤菌基因組DNA，即為類菌體DNA模板。e） BOX-PCR擴(kuò)增以接種菌株的基因組DNA為對照進(jìn)行BOX-PCR，接種菌株的DNA提取方法按照GB/T19495.3-2004附錄A.4中的規(guī)定執(zhí)行，BOX-PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增反應(yīng)程序見附錄B。f） BOX-PCR產(chǎn)物的檢測：電泳結(jié)束后在凝膠成像分析儀中掃描凝膠，將指紋圖譜用TIFF文件保存，PCR產(chǎn)物電泳圖譜帶型按照NY

7、/T 2066-2011中5.6和6.2規(guī)定的方法進(jìn)行檢測與判定。4.4.2土壤盆栽試驗中根瘤菌占瘤率的測定以土壤作為大豆生產(chǎn)的基質(zhì)，按照上述方法進(jìn)行土壤盆栽試驗，從根際隨機(jī)挑取20個根瘤并進(jìn)行根瘤表面消毒，無菌水清洗后，按照上述方法進(jìn)行BOX-PCR擴(kuò)增及圖譜分析。4.4.3結(jié)果分析對比分離根瘤菌與接種菌種的BOX-PCR指紋圖譜，達(dá)到100%相似水平時即可定位同一類BOX圖譜類型，統(tǒng)計各類型的菌株數(shù)量，占空白對照所分離的根瘤菌菌株的比例即為屬于該類型的根瘤菌的占瘤率。2 DB23/T 316920225固氮效果評價材料與工具5.1大豆盛花期植株根瘤樣品，102G型氣相色譜儀，標(biāo)準(zhǔn)乙烯（靈敏

8、度為103，衰減1/128），待測樣品中乙烯（靈敏度為104，衰減1/1），乙炔（C2H2）氣體，100mL帶有異丁基膠塞的血清瓶，注射器（1mL、10 mL密封性能好的），100L微量注射器。5.2固氮酶活性測定采用乙炔還原法測定大豆根瘤菌固氮酶活性：取樣計數(shù)后將鮮根瘤稱重，收集到100 mL血清瓶中，立即用異丁基膠塞密封，然后按瓶子中氣相體積用注射器從瓶中抽空5%10%的空氣，再用注射器注入等體積的C2H2，28 ºC保溫2 h。取出瓶子，用注射器吸出100 mL的混合氣體，用氣相色譜儀以外標(biāo)法測定其固氮酶活性。計算公式如下：nm´tU =式中：U 根瘤固氮酶活性 nm

9、ol/mg/h；n 乙烯含量 nmol；m 根瘤鮮重 mg；t 反應(yīng)時間 h。5.3全氮含量測定植物全氮含量計算公式如下：W = c´(Vm´(V2-V1)´0.014¸V)´10003式中：W 植株全氮含量 g/kg；c 硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度 0.01 moL/L；V1 空白滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量 mL；V2 試劑滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量 mL；V3 上機(jī)測試液量10 mL；m 樣品質(zhì)量 g；V 消煮后定容液量100 mL；0.014 氮的毫摩爾質(zhì)量 g/mmoL。3 DB23/T 31692022附錄A（規(guī)范性）培養(yǎng)基配方A.1 YMA培養(yǎng)基配方甘露醇，1

10、0.0 g；酵母粉，0.8 g；K2HPO4，0.25 g；KH2PO4，0.25 g；MgSO4·7H2O，0.2 g；NaCl，0.1 g；0.25%溴麝香草酚藍(lán)（僅在從根瘤中分離根瘤菌時選擇性的加入），1 mL；瓊脂，15 g18 g；蒸餾水，1000 mL；pH值，6.87.0。4 DB23/T 31692022附錄B（規(guī)范性）BOX-PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增反應(yīng)程序B.1 BOX-PCR引物BOX-A1R：5-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3。擴(kuò)增體系為25.0LB.210×Reaction Buffer， 2.5L；MgCl2（20 mmolL-1），5.6L；BSA（10 mgmL），0.2L；-1），0.32L；），1.0L；ddH2O補(bǔ)足至25.0L。4×dNTP（10 mmolL模板DNA（100 ngLB.3 BOX-PCR擴(kuò)增程序-1），2.0L；100% DMSO，2.5L；BOX