第八章免疫學(xué)檢測(cè)方法

1、o 免疫學(xué)技術(shù)是利用抗原抗體特異性反應(yīng)免疫學(xué)技術(shù)是利用抗原抗體特異性反應(yīng)的原理建立的各種檢測(cè)與分析技術(shù)，以的原理建立的各種檢測(cè)與分析技術(shù)，以及建立這些技術(shù)的各種制備方法。及建立這些技術(shù)的各種制備方法。第八章第八章 免疫學(xué)檢測(cè)方法免疫學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)技術(shù)種類檢測(cè)技術(shù)種類 一、免疫學(xué)檢測(cè)免疫學(xué)檢測(cè)a 免疫凝集試驗(yàn)免疫凝集試驗(yàn)a 免疫沉淀試驗(yàn)免疫沉淀試驗(yàn)a 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)酶聯(lián)免疫試驗(yàn)a 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)a 免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)a 免疫印跡試驗(yàn)免疫印跡試驗(yàn)細(xì)菌凝集反應(yīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌學(xué)的診斷。在凝集反應(yīng)細(xì)菌凝集反應(yīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌學(xué)的診斷。在凝集反應(yīng)中，將參與反應(yīng)的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集

2、素中，將參與反應(yīng)的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。凝集法測(cè)定哈維氏弧菌抗體的效價(jià)凝集法測(cè)定哈維氏弧菌抗體的效價(jià) 管號(hào)管號(hào)1 12 23 34 45 56 67 7磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液0.90.90.90.90.90.90.90.90.90.90.90.91.01.0兔抗兔抗X X菌血清菌血清0.10.10.1(10.1(1) )0.1(20.1(2) )0.1(0.1(3)3)0.1(0.1(4)4)0.1(50.1(5) )0.00.01.1.稀釋抗體稀釋抗體2.2.玻片凝集法玻片凝集法 用用1ml1ml移液槍取移液槍取6 6號(hào)離心管中的溶液一滴滴在載玻片的一端，另一端加一滴號(hào)離心管中的

3、溶液一滴滴在載玻片的一端，另一端加一滴磷酸鹽緩沖液，然后分別加一滴準(zhǔn)備好的磷酸鹽緩沖液，然后分別加一滴準(zhǔn)備好的X X菌液。菌液。 牙簽混勻，至于顯微鏡下觀察，看是否有凝集塊的形成。牙簽混勻，至于顯微鏡下觀察，看是否有凝集塊的形成。 后取后取5 5、4 41 1號(hào)管的溶液逐個(gè)重復(fù)號(hào)管的溶液逐個(gè)重復(fù)1 1、2 2步驟。步驟。 取有凝集塊變?yōu)闊o凝集塊時(shí)取有凝集塊變?yōu)闊o凝集塊時(shí), ,那個(gè)有凝集反應(yīng)的試管作為抗體的效價(jià)。那個(gè)有凝集反應(yīng)的試管作為抗體的效價(jià)。 沉淀凝集反應(yīng)沉淀凝集反應(yīng)雙向免疫擴(kuò)散沉淀線示意圖雙向免疫擴(kuò)散沉淀線示意圖瓊擴(kuò)反應(yīng)中和實(shí)驗(yàn)熒光免疫技術(shù) 熒光免疫技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)。它將免疫熒光免疫

4、技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)。它將免疫化學(xué)和血清學(xué)的高度特異性和敏感性與顯微技術(shù)化學(xué)和血清學(xué)的高度特異性和敏感性與顯微技術(shù)的高度精確性相結(jié)合，為免疫學(xué)、臨床組織化學(xué)的高度精確性相結(jié)合，為免疫學(xué)、臨床組織化學(xué)及實(shí)驗(yàn)室診斷提供了一項(xiàng)其它方法尚不能取代的及實(shí)驗(yàn)室診斷提供了一項(xiàng)其它方法尚不能取代的、并有其獨(dú)特風(fēng)格的技術(shù)。目前，該技術(shù)已廣泛、并有其獨(dú)特風(fēng)格的技術(shù)。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、原蟲以及真菌等的鑒定和相應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、原蟲以及真菌等的鑒定和相應(yīng)病的診斷，血清抗體的檢查，病理組織學(xué)抗原應(yīng)病的診斷，血清抗體的檢查，病理組織學(xué)抗原、抗體和補(bǔ)體的鑒定及定位，免疫復(fù)合物病理的、抗體和補(bǔ)體的鑒定及定位

5、，免疫復(fù)合物病理的研究，細(xì)菌、病毒與細(xì)胞之間抗原關(guān)系的研究等研究，細(xì)菌、病毒與細(xì)胞之間抗原關(guān)系的研究等方面。其主要優(yōu)點(diǎn)在于：特異性強(qiáng)，速度快，敏方面。其主要優(yōu)點(diǎn)在于：特異性強(qiáng)，速度快，敏感性高；其缺點(diǎn)在于：非特異性染色問題尚未解感性高；其缺點(diǎn)在于：非特異性染色問題尚未解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也比較復(fù)決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也比較復(fù)雜。雜。1 1、原理、原理 熒光免疫技術(shù)是一種以熒光物質(zhì)作為標(biāo)記熒光免疫技術(shù)是一種以熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物的免疫分析技術(shù)，熒光物質(zhì)的分子在特定物的免疫分析技術(shù)，熒光物質(zhì)的分子在特定條件下吸收激發(fā)光的能量后，分子呈激發(fā)態(tài)條件下吸收激發(fā)光的能量后，分子呈

6、激發(fā)態(tài)而極不穩(wěn)定，其迅速回到基態(tài)時(shí)，以電磁輻而極不穩(wěn)定，其迅速回到基態(tài)時(shí)，以電磁輻射形式釋放出所有的光能，發(fā)射出波長(zhǎng)較照射形式釋放出所有的光能，發(fā)射出波長(zhǎng)較照射光長(zhǎng)的熒光。熒光免疫技術(shù)可分為熒光免射光長(zhǎng)的熒光。熒光免疫技術(shù)可分為熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)和熒光測(cè)定技術(shù)。熒光抗體疫組織化學(xué)技術(shù)和熒光測(cè)定技術(shù)。熒光抗體技術(shù)屬于前者，它是利用某些熒光素通過化技術(shù)屬于前者，它是利用某些熒光素通過化學(xué)方法與特異性抗體結(jié)合，形成的免疫復(fù)合學(xué)方法與特異性抗體結(jié)合，形成的免疫復(fù)合物在一定波長(zhǎng)光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，因此物在一定波長(zhǎng)光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，因此借助熒光顯微鏡檢測(cè)或定位被檢抗原。其又借助熒光顯微鏡檢測(cè)或定位

7、被檢抗原。其又可分為直接熒光抗體法、間接熒光抗體法和可分為直接熒光抗體法、間接熒光抗體法和補(bǔ)體熒光抗體法。補(bǔ)體熒光抗體法。熒光色素o 異硫氰酸熒光素（FITC）o 四乙基羅丹明（RB200）o 四甲基異硫氰酸羅丹明（TMRITC)1、熒光抗體染色方法、熒光抗體染色方法 直接法直接法 間接法間接法2、熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用、熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用 在細(xì)菌學(xué)診斷中的應(yīng)用在細(xì)菌學(xué)診斷中的應(yīng)用 在病毒感染診斷中的應(yīng)用在病毒感染診斷中的應(yīng)用 其它方面的應(yīng)用其它方面的應(yīng)用間接熒光抗體法（IFAT）操作步驟如下：（1）單層血細(xì)胞滴片，室溫晾干，放入丙酮中固定10min。室溫晾干。（2）以小白鼠抗血清（或雜交瘤細(xì)胞上

8、清液）為第一抗體，加在血細(xì)胞抗原上。37濕盒中孵育45min。（3）0.01M PBS洗三次，每次5min。（4）加第二抗體IgG-FITC ，37濕盒中孵育45min。（5）0.01M PBS洗三次，每次5min。（6）甘油封片，熒光鏡下觀察，拍照。間接免疫熒光法檢測(cè)對(duì)蝦白斑癥病毒病間接免疫熒光法檢測(cè)對(duì)蝦白斑癥病毒病間接免疫熒光法檢測(cè)淋巴囊腫病毒間接免疫熒光法檢測(cè)淋巴囊腫病毒直接ELISA間接ELISA間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)操作步驟如下：操作步驟如下：（1 1）分別以不同單抗為第一抗體，加在血細(xì)胞抗原上。）分別以不同單抗為第一抗體，加在血細(xì)胞抗原上。3737濕盒中孵育濕盒中

9、孵育60min60min。（2 2）0.01M PBS0.01M PBS洗三次，每次洗三次，每次5min5min。（3 3）加）加AP-IgG AP-IgG 為第二抗體，為第二抗體，3737濕盒中孵育濕盒中孵育45min45min。（4 4）0.01M PBS0.01M PBS洗三次，每次洗三次，每次5min5min。（5 5）加）加NBT/BCIPNBT/BCIP底物緩沖液發(fā)色底物緩沖液發(fā)色10min10min，（6 6）出現(xiàn)顏色加終止液終止反應(yīng)。）出現(xiàn)顏色加終止液終止反應(yīng)。 （7 7）用酶標(biāo)分析儀在）用酶標(biāo)分析儀在405nm,405nm,處測(cè)定各孔的吸光度，計(jì)算處測(cè)定各孔的吸光度，計(jì)算P

10、PN N（樣品光吸收值（樣品光吸收值與陰性對(duì)照的值），判定與陰性對(duì)照的值），判定ELISAELISA反應(yīng)結(jié)果。大于反應(yīng)結(jié)果。大于2.12.1時(shí)可判斷為陽(yáng)性。時(shí)可判斷為陽(yáng)性。以最大顯色至陽(yáng)性的顯色孔以最大顯色至陽(yáng)性的顯色孔50%50%反應(yīng)孔的抗體稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)反應(yīng)孔的抗體稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)。 圖 DOT BLOT方法篩選結(jié)果圖。免疫組織化學(xué)方法定扇貝血細(xì)胞分布細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)病毒感染四、四、Western blot 是蛋白水平檢測(cè)，研究基因表達(dá)與功能的一種方法是蛋白水平檢測(cè)，研究基因表達(dá)與功能的一種方法。 原理及步驟原理及步驟 樣品樣品 聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離

11、蛋白 （SDS-PAGE ) 轉(zhuǎn)移（印跡）于硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移（印跡）于硝酸纖維素膜 加抗體檢測(cè)某種特異性蛋白質(zhì)加抗體檢測(cè)某種特異性蛋白質(zhì)West Blot 圖：淋巴囊腫病毒與抗血清的Western blotting結(jié)果免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)（免疫電鏡技術(shù)（immune electron microscopic techniqueimmune electron microscopic technique）是一種將免疫學(xué)技術(shù)與電子顯微鏡技術(shù)相結(jié)合的血清學(xué)方是一種將免疫學(xué)技術(shù)與電子顯微鏡技術(shù)相結(jié)合的血清學(xué)方法，能使抗原在分子水平上進(jìn)行定位。它實(shí)際上是將細(xì)胞法，能使抗原在分子水平上進(jìn)行定位。它實(shí)際上

12、是將細(xì)胞水平的熒光抗體技術(shù)的基本原理應(yīng)用于分子水平上。這一水平的熒光抗體技術(shù)的基本原理應(yīng)用于分子水平上。這一技術(shù)的發(fā)明使抗原和抗體的定位研究達(dá)到了亞細(xì)胞或分子技術(shù)的發(fā)明使抗原和抗體的定位研究達(dá)到了亞細(xì)胞或分子水平。主要有以下幾種技術(shù)。水平。主要有以下幾種技術(shù)。鐵蛋白抗體法鐵蛋白抗體法酶標(biāo)記抗體法酶標(biāo)記抗體法重金屬標(biāo)記抗體法重金屬標(biāo)記抗體法圖 膠體金標(biāo)記免疫電鏡結(jié)果(A) (D) bar = 200 nm; (B) (C) bar = 100 nm膠體金免疫技術(shù)o 膠體金是氯金酸在還原劑如白磷、抗壞血酸等作用下的水溶液，具有高電子密度，并能與多種大分子發(fā)生物理吸附，因此，不但所有的大分子物質(zhì)都可

13、被金標(biāo)記，而且標(biāo)記后大分子物質(zhì)活性不發(fā)生改變。o 當(dāng)抗原和金標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)，肉眼可見紅色或粉紅色斑條（點(diǎn)）,在顯微鏡下觀察，抗原抗體結(jié)合處為黑褐色的顆粒。 o 斑點(diǎn)免疫金滲濾法（斑點(diǎn)免疫金滲濾法（DIGFA）的應(yīng)用）的應(yīng)用 與研究進(jìn)展與研究進(jìn)展 是是20世紀(jì)八十年代發(fā)展起來的一種免疫學(xué)檢世紀(jì)八十年代發(fā)展起來的一種免疫學(xué)檢 測(cè)方法，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。目前在測(cè)方法，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。目前在 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中主要應(yīng)用于檢測(cè)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中主要應(yīng)用于檢測(cè) HBsAg、HCG 和和HIV等。等。斑點(diǎn)免疫金滲濾法原理斑點(diǎn)免疫金滲濾法原理： NCM為固相載體-通過滲濾-抗原與抗體在膜上快速反應(yīng)-標(biāo)記的

14、膠體金堆積顯色。膠體金膠體金抗體抗體抗原抗原NCM吸水墊吸水墊 臨床應(yīng)用：臨床應(yīng)用：v 間接法測(cè)抗體：間接法測(cè)抗體： NCM 抗原-樣品抗體-金標(biāo)抗抗體顯色v 夾心法測(cè)抗原夾心法測(cè)抗原： NCM多抗-樣品抗原-金標(biāo)單抗顯色。 直接法檢測(cè)抗原直接法檢測(cè)抗原 NCM病毒病毒-金標(biāo)單抗顯色金標(biāo)單抗顯色 DIGFA步驟簡(jiǎn)化、時(shí)間縮短。 v DIGFA檢測(cè)操作程序檢測(cè)操作程序o2l檢測(cè)樣品-NCM-直徑2mm點(diǎn)-晾干； 100l封閉液，滲入； 100l的金標(biāo)抗體，滲入；o100l 的0.01M PBS-T（含0.05%Tween-20），滲入； 檢測(cè)結(jié)果：紅色斑點(diǎn)的為陽(yáng)性，無紅色斑點(diǎn)的為陰紅色斑點(diǎn)的為陽(yáng)

15、性，無紅色斑點(diǎn)的為陰性性。 陽(yáng)性代表檢測(cè)樣品中有病毒，陰性則無。 DIGFA檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)結(jié)果, 紅色斑點(diǎn)的為病毒陽(yáng)性紅色斑點(diǎn)的為病毒陽(yáng)性,無紅色斑點(diǎn)的為病毒陰性。無紅色斑點(diǎn)的為病毒陰性。The result of DIGFA, red dot shows there is WSSV, otherwise, there is no WSSV. 免疫金標(biāo)層析法的應(yīng)用與研究進(jìn)展免疫金標(biāo)層析法的應(yīng)用與研究進(jìn)展 o 檢測(cè)試紙的原理是：采用夾心免疫層析原理，即由檢測(cè)試紙的原理是：采用夾心免疫層析原理，即由金標(biāo)單抗同檢測(cè)樣品液中的抗原反應(yīng)，形成由金標(biāo)金標(biāo)單抗同檢測(cè)樣品液中的抗原反應(yīng)，形成由金標(biāo)單抗單抗-抗原

16、復(fù)合物，當(dāng)該復(fù)合物層析至硝酸纖維素抗原復(fù)合物，當(dāng)該復(fù)合物層析至硝酸纖維素膜上預(yù)先包被在檢測(cè)線上的另一種單抗處時(shí)，此處膜上預(yù)先包被在檢測(cè)線上的另一種單抗處時(shí)，此處的抗體會(huì)識(shí)別該復(fù)合物中抗原，反應(yīng)的結(jié)果便形成的抗體會(huì)識(shí)別該復(fù)合物中抗原，反應(yīng)的結(jié)果便形成了金標(biāo)單抗了金標(biāo)單抗+抗原抗原+包被單抗的夾心結(jié)構(gòu)，最終是包被單抗的夾心結(jié)構(gòu)，最終是金標(biāo)單抗上的膠體金顆粒在此固定并累積出現(xiàn)肉眼金標(biāo)單抗上的膠體金顆粒在此固定并累積出現(xiàn)肉眼可見的紅色線，未反應(yīng)的金標(biāo)單抗則仍繼續(xù)層析前可見的紅色線，未反應(yīng)的金標(biāo)單抗則仍繼續(xù)層析前行行,當(dāng)?shù)竭_(dá)點(diǎn)預(yù)先包被在質(zhì)控線羊抗鼠抗體處時(shí)，金當(dāng)?shù)竭_(dá)點(diǎn)預(yù)先包被在質(zhì)控線羊抗鼠抗體處時(shí)，金標(biāo)

17、單抗被其結(jié)合住，從而在此處也出現(xiàn)由膠體金顆標(biāo)單抗被其結(jié)合住，從而在此處也出現(xiàn)由膠體金顆粒固定并累積而顯現(xiàn)出肉眼可見的紅色線，結(jié)果是粒固定并累積而顯現(xiàn)出肉眼可見的紅色線，結(jié)果是：檢測(cè)線顯示紅色表示樣品陽(yáng)性；檢測(cè)線不顯示紅：檢測(cè)線顯示紅色表示樣品陽(yáng)性；檢測(cè)線不顯示紅色，表示樣品陰性。質(zhì)控線顯示紅色，表示試紙有色，表示樣品陰性。質(zhì)控線顯示紅色，表示試紙有效；質(zhì)控線處不顯示紅色，說明試紙失效，即或是效；質(zhì)控線處不顯示紅色，說明試紙失效，即或是金標(biāo)單抗、或是羊抗鼠抗體失活，檢測(cè)結(jié)果無效。金標(biāo)單抗、或是羊抗鼠抗體失活，檢測(cè)結(jié)果無效。該試紙條構(gòu)成:載體板7；在該載體板7的兩端部，分別設(shè)有加樣端4吸水層和手持

18、端1吸水層；在該載體板7中部段設(shè)有硝酸纖維膜的檢測(cè)層2，在該檢測(cè)層2與加樣端4吸水層交界處，設(shè)有載有金標(biāo)單抗E的玻璃纖維層塊3，該層塊3一端部分設(shè)置在加樣端4吸水層之下，其另一端部分設(shè)置在檢測(cè)層2之上；在與該層塊3延續(xù)的檢測(cè)層2上設(shè)有檢測(cè)線6和質(zhì)控線5，該檢測(cè)線6和質(zhì)控線5處分別包被有抗病毒單抗和羊抗鼠IgG。 用吖啶酯直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分

19、光的積分與待測(cè)抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗原的含量。 直接化學(xué)發(fā)光免疫分析發(fā)光Y YY磁微粒被測(cè)抗原+抗體+帶丫啶酯標(biāo)記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后（1）加入H2O2（pH10）直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理磁微粒模式圖YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特點(diǎn)已結(jié)合的抗原和抗體與未結(jié)合部分的易分離磁微粒技術(shù)五、聚合酶鏈反應(yīng)（五、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR） o PCR是模擬體內(nèi)是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制復(fù)制條件，應(yīng)用條件，應(yīng)用DNA聚合酶反聚合酶反應(yīng)，特異性擴(kuò)增某一應(yīng)，特異性擴(kuò)增某一DNA片段的技術(shù)。體外程序化片

20、段的技術(shù)。體外程序化的的DNA合成技術(shù)。合成技術(shù)。PCRACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAAStep3 : Extension 延伸72CCGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaq PolymeraseTaq PolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA原原 理：理：1) 合成待擴(kuò)增區(qū)域兩端已知序列，與模板合成待擴(kuò)增區(qū)域兩端已知序列，與模板DNA互互補(bǔ)的寡核苷酸特異性引物，引物的序列決定擴(kuò)增補(bǔ)的寡核苷酸特異性引物，引物的序列決定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度；片段的長(zhǎng)度；2) 反應(yīng)體系：反應(yīng)體系：DNA模板，模板，dNTP，Taq DNA聚聚合酶，合酶，buffer3) 反應(yīng)程序：反應(yīng)程序： 變性變性 ( 9495oC) 復(fù)性復(fù)性 延伸延伸 ( 3755 oC) ( 7072 oC ) 72 oC延伸延伸10min 30-35cycles DNA擴(kuò)增擴(kuò)增100萬倍萬倍P