農(nóng)學核酸合成

1、會計學1農(nóng)學核酸合成農(nóng)學核酸合成2022-6-2822022-6-283 DNA是生物遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，生物機體的遺傳信息以密碼的形式編碼在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序(三聯(lián)體密碼)，并通過DNA的復(fù)制由親代傳遞給子代。在后代的生長發(fā)育過程中，遺傳信息自DNA轉(zhuǎn)錄給RNA,然后翻譯成特異的蛋白質(zhì)，以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀。DNA是生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)遺傳信息的載體2022-6-284中 心 法 則1964-1970 勞氏肉瘤病毒的遺傳方式致癌RNA病毒、植物RNA病毒病毒（復(fù)制）復(fù)制轉(zhuǎn)錄DNA RNA 蛋白質(zhì)翻譯逆轉(zhuǎn)錄1958年，遺傳信息的單向遺傳信息的

2、傳遞2022-6-285復(fù)制：親代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過程。轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板，按照堿基配對原則將其所含的遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補的RNA的過程。翻譯：亦叫轉(zhuǎn)譯，以mRNA為模板，將mRNA的密碼解讀成蛋白質(zhì)的AA順序的過程。逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，生成DNA的過程。Reverse transcription2022-6-286 DNA的復(fù)制（DNA指導下的DNA合成） 逆轉(zhuǎn)錄（RNA指導下的DNA的合成） DNA 突變 DNA的損傷與修復(fù)(修復(fù)合成)2022-6-287DNA的存在形式 染色體與質(zhì)粒嚴緊

3、控制質(zhì)粒單拷貝質(zhì)粒：每個細胞內(nèi)只有一個或少數(shù)幾個拷貝松弛控制質(zhì)粒多拷貝質(zhì)粒：每個細胞內(nèi)含有許多拷貝（20以上）1 DNA的復(fù)制2022-6-288病毒與細菌的DNA2022-6-289真核細胞的染色體2022-6-2810半保留復(fù)制的實驗證據(jù):1958年Meselson和Stahl用同位素15N標記大腸桿菌DNA,首先證明了DNA的半保留復(fù)制。2022-6-2811細胞在15N標記培養(yǎng)基中（NH4Cl）連續(xù)培養(yǎng)15代，使所有DNA分子均標記上15N，轉(zhuǎn)入14N標記的培養(yǎng)基CsCl密度梯度離心 浮力密度 15NDNA 1.742g/ml 14NDNA 1.710g/ml15N/ 14NDNA 1

4、.717g/ml2022-6-2812復(fù)制叉的移動方向解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物體DNA聚合酶ISSB335前導鏈隨后鏈35復(fù)制的起始DNA鏈的合成與延長DNA鏈合成的終止5RNA引物33DNA連接酶復(fù)習2022-6-28132022-6-28141.2 復(fù)制起點、方向和方式1.2.1復(fù)制起點（origin ， ori或 o ， 復(fù)制原點） 原核生物染色體DNA（或真核生物的細胞器DNA） 單復(fù)制起點，即整個染色體只有一個復(fù)制單位。 真核生物染色體DNA : 多復(fù)制起點 一個genome中有多個復(fù)制單位復(fù)制起點：復(fù)制開始處DNA分子的特定位置復(fù)制子(Replicon)（復(fù)制單

5、位 ）：從一個起點到一個終點所包含的DNA區(qū)域，是基因組獨立進行復(fù)制的單位。許多生物的復(fù)制起點都是富含A、T的區(qū)段2022-6-2815復(fù)制叉（Replication fork）：DNA復(fù)制進行時，在眼的兩側(cè)出現(xiàn)兩個叉子狀的生長點(growth point)，叫復(fù)制叉。在復(fù)制叉上分布著各種與復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白因子，它們構(gòu)成的復(fù)合物稱為復(fù)制體（replisome）大多數(shù)復(fù)制是雙向的，形成兩個復(fù)制叉； 復(fù)制眼（replication eye）：電子顯微鏡下觀察正在復(fù)制的DNA，復(fù)制的區(qū)域形如一只眼睛1.2.2 復(fù)制方向及方式2022-6-2816復(fù)制方式雙向復(fù)制(bi-directional) ：

6、大多數(shù)復(fù)制從起點開始向2個方向復(fù)制2個復(fù)制叉(replication fork)單向復(fù)制(unidirectional) ：少數(shù)復(fù)制從起點向1個方向復(fù)制1個復(fù)制叉或生長點(growing point)2022-6-2817真核染色體DNA 線環(huán)狀雙鏈E .coli染色體DNA 環(huán)狀雙鏈2022-6-28181.3 與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)1.3.1 DNA聚合酶1.3.2拓撲異構(gòu)酶1.3.3 DNA解旋酶1.3.4單鏈結(jié)合蛋白1.3.5引發(fā)酶及引發(fā)體1.3.6 DNA連接酶目前已發(fā)現(xiàn)30多種酶及蛋白質(zhì)因子參與DNA復(fù)制2022-6-28191.3.1 DNA聚合酶(DNA polymera

7、se):延長子鏈DNA聚合酶不能從頭合成子鏈，只能延長DNA聚合酶：多種類、多種活性2022-6-28202022-6-28211）DNA聚合反應(yīng)條件（1）底物 dNTP（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）（2）聚合酶（3）模板單鏈的DNA母鏈（4）引物寡核苷酸引物（RNA)（5）其他：解鏈酶，解旋酶，單鏈結(jié)合蛋白，連接酶2022-6-28222）聚合機制（1）DNA聚合酶： 5 3的聚合活性pp pp pppPPPOHOHOH55PPiN1N2N3N1N2N3533 需引物鏈2022-6-2823（2）DNA聚合酶：核酸外切酶活性 35外切酶活性 53外切酶活性533535外切酶活性5

8、3外切酶活性2022-6-2824在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)主要有三種DNA聚合酶，分別為： DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 E.coli DNA聚合酶DNA聚合酶IV和V：1999年發(fā)現(xiàn)，當DNA嚴重損傷 時，誘導產(chǎn)生。2022-6-28252022-6-2826 DNA聚合酶：是原核生物DNA復(fù)制的主要聚合酶，該酶由10種亞基組成，其中、形成全酶的核心酶。具有5 3 DNA聚合酶活性（ 亞基，速率高）； 具有3 5外切酶（亞基）的校對功能，提高DNA復(fù)制的保真性；還具有5 3外切酶活性（單鏈有效，其意義未知）。（4） DNA聚合酶IV和V：1999年發(fā)現(xiàn)，當DNA嚴重損傷時，誘導產(chǎn)生。20

9、22-6-2827主要是對DNA損傷的修復(fù)；以及在DNA復(fù)制時切除RNA引物并填補其留下的空隙。修復(fù)紫外光引起的DNA損傷DNA 復(fù)制的主要聚合酶，還具有3 -5 外切酶的校對功能，提高DNA復(fù)制的保真性2022-6-28281.3.2 拓撲異構(gòu)酶：催化DNA的拓撲鏈環(huán)數(shù)發(fā)生變化的酶，在DNA重組修復(fù)和其他轉(zhuǎn)變方面起重要作用。除鏈環(huán)數(shù)不同外其它性質(zhì)均相同的DNA分子稱為拓撲異構(gòu)體，引起拓撲異構(gòu)體反應(yīng)的酶稱為拓撲異構(gòu)酶(Topo，解超螺旋酶)2022-6-2829Topo ：切開DNA中的一條鏈，與另一條鏈解纏繞或再纏繞連接Topo 同時切開DNA雙鏈解旋或再螺旋連接2022-6-2830本質(zhì)：

10、切斷DNA磷酸二酯鍵 改變DNA的鏈環(huán)數(shù)，再連接 兼具DNA內(nèi)切酶、連接酶的性質(zhì) 斷裂、連接反應(yīng)相互耦聯(lián)不能連接事先已經(jīng)存在的斷裂DNA2022-6-28312022-6-28322022-6-28331.3.4 單鏈結(jié)合蛋白(SSB-single-strand binding protein)：穩(wěn)定已被解開的DNA單鏈，阻止復(fù)性和保護單鏈不被核酸酶降解。2022-6-28341.3.5 引發(fā)酶及引發(fā)體引發(fā)前體:它由多種蛋白質(zhì)dnaA、dnaB、dnaC、n、n、n 和i組成。引發(fā)酶：此酶以DNA為模板合成一段RNA,這段RNA作為合成DNA的引物（Primer)。實質(zhì)是以DNA為模板的RNA

11、聚合酶。引發(fā)前體再與引發(fā)酶結(jié)合組裝成引發(fā)體。 引發(fā)體可以沿模板鏈53方向移動,具有識別合成起始位點的功能，移動到一定位置上即可引發(fā)RNA引物的合成。移動和引發(fā)均需要ATP提供能量，引發(fā)體的移動與復(fù)制叉移動的方向相同，與岡崎片段的合成方向相反。以DNA為模板合成一段RNA, 作為合成DNA的引物。2022-6-2835大腸桿菌和其它細菌的DNA連接酶要求NAD+提供能量，在高等生物和噬菌體中，則要求ATP提供能量。T4噬菌體的DNA連接酶不僅能在模板鏈上連接DNA和DNA鏈之間的切口，而且能連接無單鏈粘性末端的平頭雙鏈DNA。 2022-6-283635535353HOP DNA ligaseN

12、ADATPNMNAMP+PPi+POHP5533+53DNAligaseOOHPOOO-OOHPOOOPP-PPi2022-6-28372022-6-2838酶-AMPAMP-P-5-DNA磷酰胺鍵以焦磷酸活化磷原子2022-6-2839拓撲異構(gòu)酶解鏈酶單鏈結(jié)合蛋白DNA聚合酶引物酶及引發(fā)體DNA連接酶引物DNA雙鏈 5 3 5 3DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)2022-6-2840拓撲異構(gòu)酶解鏈酶單鏈結(jié)合蛋白DNA聚合酶引物酶及引發(fā)體DNA連接酶引物拓撲異構(gòu)酶與DNA雙鏈結(jié)合，解開超螺旋。 5 3 5 3DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)2022-6-2841拓撲異構(gòu)酶解鏈酶單鏈結(jié)合蛋白DNA聚合酶引物

13、酶及引發(fā)體DNA連接酶引物解鏈酶解開DNA雙螺旋 5 3 5 3DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)2022-6-2842拓撲異構(gòu)酶解鏈酶單鏈結(jié)合蛋白DNA聚合酶引物酶及引發(fā)體DNA連接酶引物單鏈結(jié)合蛋白防止復(fù)螺旋 5 3 5 3DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)2022-6-2843拓撲異構(gòu)酶解鏈酶單鏈結(jié)合蛋白DNA聚合酶引物酶及引發(fā)體DNA連接酶引物引物酶合成引物 5 3 5 3DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)2022-6-28441.4 DNA的半不連續(xù)復(fù)制 1968年由岡崎通過實驗證明 DNA復(fù)制是半不連續(xù)的2022-6-2845后兩個實驗表明：在DNA復(fù)制時只有一條鏈是不連續(xù)的！2022-6-2846領(lǐng)頭鏈

14、在DNA復(fù)制時，合成方向與復(fù)制叉移動的方向一致并連續(xù)合成的鏈（前導鏈）。隨后鏈在DNA復(fù)制時，合成方向與復(fù)制叉移動的方向相反，形成許多不連續(xù)的片段，最后再連成一條完整的DNA鏈（滯后鏈）。這些不連續(xù)的片斷，稱為岡崎片斷。每個岡崎片段的合成也都需要引物。岡崎片段：真核生物中100-200個核苷酸（核小體的DNA單位）。原核生物中1000-2000個核苷酸。半不連續(xù)復(fù)制（semidiscontinuous replication）在DNA復(fù)制時，領(lǐng)頭鏈是連續(xù)合成的,而隨后鏈的合成是不連續(xù)的，這種復(fù)制方式稱為半不連續(xù)復(fù)制。 2022-6-284735351.4.2 半不連續(xù)復(fù)制2022-6-2848

15、岡崎片段合成后由DNA聚合酶切除RNA引物并催化合成一段DNA填補留下的空隙。再由DNA連接酶把他們連成一條完整的子代鏈，稱為滯后鏈。2022-6-2849 起 始 延 伸 終 止2022-6-2850解鏈引發(fā)延長復(fù)制起點RNA前體1.5.1復(fù)制的起始 2022-6-28512022-6-2852u20個DnaA結(jié)合在四組9bp重復(fù)區(qū)，形成起始復(fù)合物，DNA環(huán)繞此復(fù)合物。u三組13bp重復(fù)區(qū)依次變性，產(chǎn)生開放型復(fù)合物。uDnaB（解螺旋酶）在DnaC協(xié)助下與開放復(fù)合物結(jié)合，進一步解鏈。u解鏈時帶來的扭曲張力還需DNA旋轉(zhuǎn)酶（屬DNA拓撲異構(gòu)酶）引入負超螺旋消除。2022-6-2853u單鏈結(jié)合

16、蛋白( SSB）結(jié)合在單鏈區(qū)，阻止復(fù)性和保護單鏈DNA不被核酸酶降解u引發(fā)體：引物合成酶與各種蛋白質(zhì)因子構(gòu)成的復(fù)合體（引發(fā)體），以DNA為模板合成RNA引物（ 6-10個堿基）引發(fā)2022-6-2854復(fù)制叉拓撲異構(gòu)酶解螺旋酶引物單鏈結(jié)合蛋白（SSB)引物合成酶引物在DNA的復(fù)制原點，雙股螺旋解開，成單鏈狀態(tài)，分別作為模板，合成其互補單鏈。解鏈2022-6-2855 引發(fā)體在復(fù)制叉上移動，識別合成的起始位點， 引發(fā)RNA引物的合成。領(lǐng)頭鏈先引發(fā)開始合成，以原來一條DNA單鏈為模板（3 5),按5 3的方向合成一段RNA引物鏈。領(lǐng)頭鏈開始合成后，隨后鏈也開始合成其引物。在引物的3端為游離的羥基。

17、復(fù)制叉拓撲異構(gòu)酶解螺旋酶引物單鏈結(jié)合蛋白（SSB)引物合成酶引物RNA引物合成DnaB蛋白活化引物合成酶。引物長度約為幾個至10個核苷酸，與復(fù)制叉移動的方向相同， （引物酶的底物是核苷三磷酸） 5端含3個磷酸殘基，2022-6-2856大腸桿菌復(fù)制原點起始復(fù)制所需蛋白質(zhì)SSB解鏈酶引物引物酶拓撲異構(gòu)酶打開DNA超螺鏈打開雙螺旋合成防止復(fù)螺旋2022-6-2857復(fù)制叉拓撲異構(gòu)酶解螺旋酶引物單鏈結(jié)合蛋白（SSB)引物合成酶引物在DNA聚合酶的催化下，以脫氧核糖核苷酸為底物，在RNA引物的3端加上脫氧核糖核苷酸。1.5.2 DNA鏈的延伸2022-6-2858DNA鏈的延伸v以復(fù)制叉向前移動的方向

18、為標準，一條模板鏈是3 5 走向，與之互補的DNA能以5 3 的方向連續(xù)合成，稱為前導鏈（領(lǐng)頭鏈）。v另一條模板鏈是5 3 走向，與其互補的DNA也是5 3 方向合成，與復(fù)制叉移動方向正好相反，隨復(fù)制叉的移動，形成許多不連續(xù)的片斷，稱為岡崎片斷。每個岡崎片段的合成也都需要引物。2022-6-2859延 伸2022-6-2860、和三種亞基組成核心酶,核心酶形成二聚體-亞基猶如一個夾子夾住DNA分子，并向前滑動，使DNA聚合酶在完成復(fù)制前不再脫離DNA2022-6-2861復(fù)制體沿著復(fù)制叉方向前進，同時進行前導鏈和滯后鏈的合成。一分子的 DNA pol III. 協(xié)同合成前導鏈和滯后鏈，因此滯后

19、鏈必須繞成一個突環(huán)。53352022-6-2862E每個區(qū)域只對一個方向的復(fù)制叉起作用Tus蛋白-ter復(fù)合物阻止一個方向的復(fù)制叉前移(通過抑制DNA解旋酶而發(fā)揮終止作用)2022-6-2864終 止兩個復(fù)制叉向前移動，最后在終止區(qū)相遇并停止復(fù)制，由DNA聚合酶填補空隙，最后由連接酶封口。結(jié)果形成兩個DNA雙股螺旋分子。2022-6-2865復(fù)制叉的移動方向解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物體DNA聚合酶ISSB335前導鏈隨后鏈35復(fù)制的起始DNA鏈的合成與延長DNA鏈合成的終止5RNA引物33DNA連接酶2022-6-28661.6真核生物染色體DNA的復(fù)制 1.6.1真核和原核

20、DNA復(fù)制比較、 、 、 、 負責核DNA的復(fù)制負責線粒體DNA的復(fù)制較慢較快2022-6-2867引物 合成修復(fù)作用線粒體DNA的復(fù)制核DNA的復(fù)制修復(fù)作用2022-6-28682022-6-2869真核生物染色體DNA復(fù)制過程中 組蛋白的裝配2022-6-2870原核生物染色體DNA是環(huán)狀的，其隨后鏈的5最末端岡崎片斷的RNA引物被切除后可借助另半圈DNA連向前延伸來填補，2022-6-2871復(fù)制叉復(fù)制叉終止區(qū) 端粒結(jié)構(gòu)35 35 端粒結(jié)構(gòu)端粒酶是含RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶與細胞老化有關(guān)端粒（telomeres） ：是真核細胞染色體末端所特有的結(jié)構(gòu)，有許多串（1000串或更多）短的重復(fù)序列

21、組成，通常3末端鏈是富含G的短序列。端粒酶:含有RNA和蛋白質(zhì)（起DNA聚合酶的作用）兩種組分，RNA分子約150b，含有與重復(fù)端粒結(jié)構(gòu)互補的一個片斷，可作為端粒鏈合成的模板。2022-6-28721.7 確保DNA復(fù)制忠實性的機制1、采用DNA聚合酶催化聚合反應(yīng)2、依賴DNA聚合酶核酸外切酶活性3、使用RNA引物4、依賴核苷酸代謝庫調(diào)節(jié)系統(tǒng)(保證dNTP的正常水平),多種修復(fù)系統(tǒng)2022-6-28733 D-環(huán)式復(fù)制方式（線粒體雙鏈環(huán)狀DNA：兩條鏈的復(fù)制起點不同位置，且復(fù)制不同步；或同步為2-D環(huán)）切開正鏈，以負鏈為模板開始復(fù)制2022-6-28742.1 DNA的損傷 某些理化因子（紫外

22、線、電離輻射和化學誘變劑等）作用于DNA，造成其結(jié)構(gòu)和功能的破壞，從而引起生物突變和致死的效應(yīng)DNA的損傷常見的DNA損傷方式嘧啶二聚體的形成2022-6-28751、DNA分子的自發(fā)損傷1）堿基錯配：盡管DNA聚合酶具有校對修復(fù)功能仍存在極少量的錯配（10-10）2）自發(fā)性化學變化： 堿基異構(gòu) 堿基脫氨基 脫嘌呤、脫嘧啶 堿基修飾 鏈斷裂3）物理因素引發(fā)的損傷 紫外線 電離輻射 DNA鏈斷裂 交聯(lián)4）化學因素引發(fā)的損傷 烷化劑對DNA的損傷： 堿基烷基化、堿基脫落 斷鏈、交聯(lián) 堿基修飾劑、類似物對DNA的損傷 人工促變劑、抗癌藥物 亞硝酸鹽、黃曲霉毒素 2022-6-28762、DNA損傷的

23、后果1）DNA分子的改變：點突變、缺失、插入、倒位、易位、鏈斷裂2）DNA損傷的結(jié)果：（1）致死性（2）喪失某些功能（3）改變基因型而不改變表現(xiàn)型（4）發(fā)生有利于物種生存的結(jié)果，生物進化2022-6-28772022-6-2878在一定條件下，生物體能使DNA的損傷得到修復(fù):暗修復(fù)2.1光裂合酶修復(fù)2.2切除修復(fù)2.3重組修復(fù) 2.4誘導修復(fù)（SOS修復(fù)）2.5錯配修復(fù)2.2 DNA的損傷2022-6-28792022-6-2880光復(fù)合酶特異地和嘧啶二聚體結(jié)合酶被可見光激活解聚二聚體后酶被釋放2022-6-28812022-6-2882 2.3DNA的重組修復(fù)是復(fù)制后的修復(fù)DNA鏈的損傷并未

24、除去一直只存在母鏈上！若干代后相當于被稀釋。胸腺嘧啶二聚體2022-6-28832022-6-2884生物體內(nèi)存在錯配修復(fù)系統(tǒng)：能夠識別“新” “舊”鏈！(依據(jù)甲基化)2022-6-2885 概念： DNA分子中的核苷酸序列發(fā)生突然而穩(wěn)定的改變，從而導致DNA的復(fù)制以及后來的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物隨之發(fā)生變化，表現(xiàn)出異常的遺傳特性，稱為DNA的突變。產(chǎn)生：DNA在復(fù)制中可能產(chǎn)生錯配，但自然條件下發(fā)生的突變率非常低某些物理化學因素，如紫外線、電離輻射和化學誘變劑（烷化劑、堿基類似物、嵌入染料）等2022-6-2886自然條件下發(fā)生的突變成為自然突變，突變率非常低，能提高突變的物理或化學因子稱為誘變劑。堿

25、基類似物(base analog）：5-溴尿嘧啶堿基修飾劑(base modifier)：亞硝酸嵌入染料(intercalation dye) ：吖啶橙、溴化乙錠 紫外線(ultraviolet)和電離輻射(ionizing radiation2022-6-2887誘變因素及突變類型2022-6-2888 堿基對的置換(substitution)轉(zhuǎn)換：兩種嘌呤或兩種嘧啶之間互換（常見）顛換：嘌呤與嘧啶或嘧啶與嘌呤之間互換 移碼突變(framesshift mutation)突變分子改變的類型2022-6-2889轉(zhuǎn)換野生型基因 -T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-

26、G-A-C-A-T-G-C-顛換堿基對的置換(substitution) -T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C- -T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-點突變（HNO2、NH2OH、烷化劑等）插入或缺失1-2個堿基 -T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C-插入A -T-C-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失T移碼突變(framesshift mutation)2022-6-28

27、902022-6-28912022-6-28922022-6-28931958，Crick，中心法則轉(zhuǎn)錄DNA指導下RNA的合成2022-6-2894DNA復(fù)制：以DNA為模板合成DNA，遺傳信息自上一代細胞向下 一代細胞傳遞轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板合成RNA，遺傳信息自DNA轉(zhuǎn)錄至RNA分子翻譯：以mRNA為模板合成蛋白質(zhì)，遺傳信息表達至蛋白質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板合成DNA（RNA病毒、真核細胞的端粒酶）RNA復(fù)制：以RNA為模板合成RNA（RNA病毒）2022-6-2895順式作用元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的DNA序列，如啟動子、終止子、增強子反式作用因子可與順式作用元件結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白；如啟動轉(zhuǎn)錄因子、終

28、止因子RNA聚合酶幾個有關(guān)的概念轉(zhuǎn)錄的主要酶，即依賴DNA的RNA聚合酶加工轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA的切割、加帽、加尾和化學修飾 （如形成稀有堿基）DDDP：依賴DNA的DNA聚合酶DDRP：依賴DNA的RNA聚合酶2022-6-28962022-6-28972022-6-28982022-6-2899E.coli RNA聚合酶的特點： 反應(yīng)底物：NTP(ATP/GTP/UTP/CTP)， DNA為模板、Mg2+促進聚合反應(yīng)。 RNA聚合酶不需要引物，合成方向53 。2022-6-281002022-6-281011.2.1起始位點的識別 RNA的合成不需要引物。體外實驗證明，不含亞基的核心酶會隨機地

29、在一個基因的兩條鏈上啟動，當有亞基時就會選擇正確的起點。 亞基起著識別DNA分子上的起始信號（啟動子指RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列）的作用。啟動子的結(jié)構(gòu)至少由三部分組成：-35序列提供了RNA聚合酶全酶識別的信號；-10序列是酶的緊密結(jié)合位點（富含AT堿基，利于雙鏈打開）；第三部分是RNA合成的起始點。AACTGTATATTATTGACATATAAT+1轉(zhuǎn)錄起始點5335 35序列 Sextama 框 10序列Pribnow框2022-6-281021.2.2轉(zhuǎn)錄起始 RNA聚合酶全酶掃描解鏈區(qū)，找到起始點，然后結(jié)合第一個核苷三磷酸。加入的第一個核苷三磷酸常是GTP或ATP

30、，很少是CTP，不用UTP。完成最初的幾個（2-9）核苷酸連接后，亞基就會被釋放脫離核心酶。所形成的啟動子、全酶和RNA鏈復(fù)合物稱為三元起始復(fù)合物。因子僅與起始有關(guān)，RNA的合成一旦開始，便被釋放E-35-10pppG或pppA5533模板鏈2022-6-281031.2.3 RNA鏈的延伸DNA分子和酶分子發(fā)生構(gòu)象的變化，核心酶與DNA結(jié)合比較松弛，可沿DNA模板移動，并按模板順序選擇下一個核苷酸，將核苷三磷酸加到生長的RNA鏈的3-OH端，催化形成磷酸二酯鍵。轉(zhuǎn)錄延伸方向從5 3轉(zhuǎn)錄泡RNA聚合酶DNA模板RNA 2022-6-28104ACGACGUU模板DNA5353新合成RNA202

31、2-6-281051.2.4 轉(zhuǎn)錄終止（終止子和終止因子） 在DNA分子上（基因末端）提供轉(zhuǎn)錄停止信號的DNA序列稱為終止子（terminators),它能使RNA聚合酶停止合成RNA并釋放出RNA。（RNA聚合酶只能感受已經(jīng)轉(zhuǎn)錄的信號序列） 終止因子，協(xié)助RNA聚合酶識別終止信號的輔助因子（蛋白質(zhì)）。終止因子因子能與RNA聚合酶結(jié)合但不是酶的組分，它的作用是阻止RNA聚合酶向前移動，于是轉(zhuǎn)錄終止，并釋放出已轉(zhuǎn)錄完成的RNA鏈。大腸桿菌有兩類終止子： （1）不依賴于因子的終止子（強） （2）依賴因子的終止子（弱終止子）2022-6-28106不依賴于因子的終止子有2個特征（強終止子） 在DNA

32、中，在轉(zhuǎn)錄單位的終點之前都有一個回文結(jié)構(gòu)，其轉(zhuǎn)錄本形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，且柄部富含GC堿基對。 終點前大約有6 個連續(xù)的A，它轉(zhuǎn)錄成U。模板鏈5335富含AT區(qū)CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTGGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAA回文結(jié)構(gòu)富含GC區(qū)轉(zhuǎn)錄方向2022-6-28107v寡聚U序列可能提供信號使RNA聚合酶脫離模板。v依賴的終止子，必需在因子存在時，才發(fā)生終止作用。終止點前無寡聚U序列，回文對稱區(qū)不富含GC。2022-6-28108因子是一個堿性的蛋白,三個二聚體組成.與合成的RNA結(jié)合,移動到終止信號,再與RNA聚合酶結(jié)合,使之離開

33、摸板.2022-6-28109起始雙鏈DNA局部解開磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區(qū)到達基因終點延長階段53RNA 啟動子（promoter) 終止子(terminator)5RNA聚合酶5353553離開轉(zhuǎn)錄泡2022-6-281101.3 真核生物的轉(zhuǎn)錄2022-6-28111產(chǎn)物-鵝膏蕈堿對酶的作用酶類分布反應(yīng)條件I核仁核質(zhì)核質(zhì)rRNAmRNAtRNA不抑制低濃度抑制高濃度抑制低離子強度,要求Mg2+或Mn2+高離子強度高Mn2+濃度分子量都在50萬左右 真核生物RNA聚合酶2022-6-28112NNNHNNH2NH2SHSH作為代謝拮抗物抑制合成酶類或直接摻到核酸分子中，形成異常RNA或

34、DNA。NNNHNNH2NH2NNNHNNH2NH2OHNNHNHOOFNNNHNNH2NH2SH2022-6-281132022-6-281142022-6-281152022-6-281162022-6-281172022-6-281182022-6-281192022-6-28120 2.2 tRNA前體的加工：原核與真核生物的tRNA轉(zhuǎn)錄后都需要加工。包括：（1）由核酸內(nèi)切酶切除前體上3和5端上多余的核苷酸；（2）由核酸外切酶逐個在3切去附加序列，進行修剪。（3）3 端添加CCAOH序列，由核苷酰轉(zhuǎn)移酶催化。 （接受活化AA）（4）核苷的一些特定的堿基和戊糖進行修飾。 2022-6-2

35、81212022-6-28122v 原核與真核生物的rRNA轉(zhuǎn)錄后也都需要進行加工。原核：剛轉(zhuǎn)錄的rRNA為30S，先在特定的堿基上進行甲基化（核糖2-羥基）修飾，后逐步裂解（核酸酶的切割）。真核：45S（哺乳動物）、38S（果蠅）、37S（酵母）P16P23P516S23S5S（一般不含甲基化）28S18S5.8S2.3 rRNA前體的加工：45S或38S37S26S17S5.8S真核rRNA的甲基化程度比原核高（核糖2-羥基）rRNA原初轉(zhuǎn)錄物30S研究四膜蟲rRNA前體的拼接時發(fā)現(xiàn)ribozyme2022-6-281232022-6-281241.模板：DNA2.原料：核苷酸3.合成方向

36、：5 34.酶：依賴DNA的 RNA聚合酶5.堿基互補配對規(guī)律6.產(chǎn)物：多聚核苷酸鏈相同點：2.4 轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的區(qū)別2022-6-28125不同點：復(fù)制轉(zhuǎn)錄模板 兩股鏈均作為模板 模板鏈作為模板原料 dNTP NTP聚合酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶產(chǎn)物 子代DNA雙鏈 mRNA;tRNA;rRNA配對 A-T；G-C A-U；T-A;G-C引物 RNA引物 不需要引物 方式(特點) 半保留復(fù)制 不對稱轉(zhuǎn)錄2022-6-28126v兩個階段（1）其單鏈RNA可充當mRNA，利用寄主中的核糖體合成外殼蛋白和復(fù)制酶的亞基。（2）復(fù)制酶的亞基可與來自寄主細胞的亞基自動裝配成RNA復(fù)制酶，可進行RNA

37、的復(fù)制，以分子中單鏈RNA為模板（正鏈），復(fù)制出一條新的RNA鏈（負鏈），再復(fù)制出正鏈，與外殼蛋白組裝成新的噬菌體顆粒。 3 RNA的復(fù)制（噬菌體Q和灰質(zhì)炎病毒）v某些RNA病毒可以以自身RNA為模板進行復(fù)制。5 RNA-5 3 3 RNA+釋放釋放35 3 3 5 5 RNA+RNA+RNA-vRNA-及 RNA+的合成方向均為5 3不同的RNA病毒復(fù)制方式不同 P333。2022-6-281272022-6-28128逆轉(zhuǎn)錄病毒噬菌體Q狂犬病毒（帶有復(fù)制酶）呼腸孤病毒（帶有復(fù)制酶）逆轉(zhuǎn)錄酶2022-6-28129 1、正鏈RNA病毒（mRNA）：噬菌體Q、灰質(zhì)炎病毒等。 進入寄主細胞后，利

38、用寄主的翻譯系統(tǒng)，首先合成復(fù)制酶及有關(guān)的蛋白質(zhì)，然后進行病毒RNA的復(fù)制，最后由病毒RNA（+）和蛋白質(zhì)裝配成病毒顆粒。 2、負鏈RNA病毒（帶有復(fù)制酶）：狂犬病毒等 此類病毒帶有復(fù)制酶，侵入后，復(fù)制酶首先合成出正鏈RNA（mRNA），再以正鏈RNA為模板，合成負鏈RNA及蛋白質(zhì)，然后裝配。 3、雙鏈RNA病毒（帶有復(fù)制酶）：呼腸孤病毒等 以雙鏈RNA為模板，在復(fù)制酶作用下先轉(zhuǎn)錄正鏈RNA（mRNA），從而翻譯出蛋白質(zhì)，然后合成負鏈RNA，形成雙鏈RNA，再包裝。 4、 反轉(zhuǎn)錄病毒（含反轉(zhuǎn)錄酶）：白血病病毒、肉瘤病毒等致癌RNA病毒 正鏈RNA病毒，它們的復(fù)制需要經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄生成雙鏈DNA，在轉(zhuǎn)

39、錄出正鏈RNA，翻譯出蛋白質(zhì)，再包裝2022-6-281304 逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）2022-6-281314.2 病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄過程 （以前病毒cDNA形式整合到宿主細胞DNA中,隨細胞增殖而傳給子代，引起細胞惡性轉(zhuǎn)化） 病毒RNA RNA-DNA雜交分子 雙鏈DNA（前病毒cDNA） v 逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性： RNA指導的DNA聚合酶活性 DNA指導的DNA聚合酶活性 核糖核酸酶H的活性，專一水解RNA-DNA雜交 分子中的RNA，可沿53和3 5兩個方向起核 酸外切酶的作用。v逆轉(zhuǎn)錄酶也和DNA聚合酶一樣，沿53方向合成DNA，并要求有引物存在，還要求Mn2