第五章 其他分離方法

1、1:39:04第第5章章 其它色譜方法其它色譜方法1:39:04紙層析和柱層析法紙層析和柱層析法薄層色譜薄層色譜高效毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳超臨界流體色譜1:39:05紙層析紙層析1:39:05一、紙層析分離過程一、紙層析分離過程 紙層析也屬于色譜分析法。但與其它色譜方法不同的是在分離過程中一般不使用動(dòng)力源。 紙層析流動(dòng)相的移動(dòng)是依靠毛細(xì)作用。 將試樣點(diǎn)在色譜濾紙或?qū)游霭宓囊欢?，并將該端浸在作為流?dòng)相的溶劑（常稱之為展開劑）中，隨著溶劑向上的移動(dòng)，經(jīng)過試樣點(diǎn)時(shí)，帶動(dòng)試樣向上運(yùn)動(dòng)。Rf 值相差越大，分離效果越好 1:39:05二、操作技術(shù)1.層析紙和層析板特制的色層濾紙。按需要剪裁成長(zhǎng)條形（或筒

2、型）。層析板是用專門的涂布器把漿狀的吸附劑（硅膠或氧化鋁，200250目）均勻地涂在長(zhǎng)條形玻璃板上（厚度0.150.5mm）。干燥后即可使用。1:39:052.展開劑 由一種或多種溶劑按一定比例組成。如用紙層析分離氨基酸時(shí)，常用的展開劑組成和配比為：正丁醇：乙酸：水=4：1：1。1:39:053. 點(diǎn)樣 用微量注射器或玻璃毛細(xì)管吸取一定量試樣點(diǎn)在原點(diǎn)上。試樣點(diǎn)的直徑一般應(yīng)小于5mm?？刹⑴劈c(diǎn)多個(gè)試樣同時(shí)展開。1:39:054.顯色、檢測(cè) 有些組份在紫外光照射下產(chǎn)生熒光，可在紫外燈下用鉛筆將組份斑點(diǎn)描繪出來。常用的顯色方法有噴灑顯色劑、碘蒸氣熏或氨水熏等。1:39:05三、特點(diǎn)及應(yīng)用三、特點(diǎn)及應(yīng)

3、用 平板色譜簡(jiǎn)單、方便、及操作費(fèi)用低，平板色譜簡(jiǎn)單、方便、及操作費(fèi)用低， 可以在一塊層析板上同時(shí)展開多個(gè)試樣及可以在一塊層析板上同時(shí)展開多個(gè)試樣及將多條濾紙同時(shí)展開。將多條濾紙同時(shí)展開。 采用方形薄層板還可以方便的進(jìn)行二維展采用方形薄層板還可以方便的進(jìn)行二維展開，即按一般方法展開后，改變方向和展開開，即按一般方法展開后，改變方向和展開劑再次展開，進(jìn)一步改善分離效果。劑再次展開，進(jìn)一步改善分離效果。 試樣一般不需要經(jīng)過預(yù)處理即可分離。試樣一般不需要經(jīng)過預(yù)處理即可分離。 1:39:05 缺點(diǎn)： 分離效率較低，不適用揮發(fā)性試樣分離。定性定量不便。 應(yīng)用：應(yīng)用：平板色譜法在染料、農(nóng)藥、醫(yī)藥、有機(jī)酸堿類

4、化合物、糖類化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)及中草藥中有效成分的分離分析中經(jīng)常被使用。也可以用于無機(jī)離子的分離。還經(jīng)常作為高效液相色譜的一種預(yù)試方法。1:39:05柱層析1:39:05柱層析：是吸附色譜的一種，它利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)吸附能力的差異，用溶劑將混合物的組分逐一洗脫分離的一種分離方法。 微型柱層析實(shí)驗(yàn)1:39:05實(shí)例實(shí)例:n凝膠過濾層析純化細(xì)胞色素C1:39:05一、目的要求一、目的要求1.學(xué)習(xí)和掌握凝膠過濾層析分離蛋白質(zhì)的原理與方法。2.通過凝膠過濾柱層析對(duì)細(xì)胞色素C進(jìn)行純化1:39:05二、原理二、原理n凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分

5、離物質(zhì)的分子大小不同來進(jìn)行分離。1:39:051:39:05n優(yōu)點(diǎn)：a. 條件溫和 b.操作簡(jiǎn)便 c. 損失少回收率高 d. 層析柱可反復(fù)使用n凝膠的類型：Sephadex: 交聯(lián)葡聚糖 Sepharose：瓊脂糖凝膠 Bio-Gel ABio-Gel P：聚丙烯酰胺凝膠分子篩Sephacryl：用N，N-亞甲雙丙烯酰胺交聯(lián)的葡聚糖凝膠G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200吸水量（g/g干凝膠）1.01.52.55.07.510.015.020.0工作范圍（肽與蛋白）D70015003時(shí), 形成雙電層，在高電場(chǎng)的作用下引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度電滲流。1

6、:39:064. 分離過程分離過程 電場(chǎng)作用下，柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。 帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流兩種速度的矢量和。 正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出； 中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出； 陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反，電滲流 電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場(chǎng)力大小不一樣也同時(shí)被相互分離。1:39:065.5.分離類型分離類型八種分離類型八種分離類型(1)(1) 毛細(xì)管區(qū)帶電泳毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZECZE） 最普遍、最基本的一種分離模式。(2) (2) 毛細(xì)管凝膠電泳（毛細(xì)管凝膠

7、電泳（CGECGE） 將聚丙烯酰胺在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高?？煞蛛x測(cè)定蛋白質(zhì)、DNA等。1:39:06(3) (3) 毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜（毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜（MECC） 在緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。在電場(chǎng)力的作用下，膠束在柱中移動(dòng)。由于電泳流和電滲流的方向相反，且電滲流 電泳 ，則帶負(fù)電的膠束以較慢的速度向負(fù)極方向移動(dòng)，中性試樣分子在膠束相和溶液（水相）兩相間分配，疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時(shí)間長(zhǎng)。可用來分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范

8、圍。1:39:06二、儀器裝置二、儀器裝置 電壓：030KV。 分離柱不涂敷任何固定液， 紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器（可檢測(cè)到：10-1910-21 mol/L）1:39:06三、影響柱效的因素及改進(jìn)方法三、影響柱效的因素及改進(jìn)方法熱效應(yīng)熱效應(yīng)：焦耳熱仍是影響柱效的主要因素。采用外部冷卻的方法散熱，擇合適的電壓和電解質(zhì)也是提高柱效的有效途徑。選擇合適的電解質(zhì)降低電阻，電流低于200微安，一般幾十微安。電滲流控制電滲流控制：電滲流的大小和方向依賴于毛細(xì)管壁與溶液間電勢(shì)的極性和大小。使用添加劑可以改變電滲流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低電滲流；加入乙腈則可以增大電滲流。加入反轉(zhuǎn)劑。則可以改

9、變電滲流的方向。1:39:06四、主要特點(diǎn)和應(yīng)用四、主要特點(diǎn)和應(yīng)用高分辨率：理論塔板數(shù)高達(dá)數(shù)百萬塊，甚至數(shù)千萬塊。高靈敏度：可檢測(cè)出低至10-21 mol/L濃度的物質(zhì)。高分析速度：可在3分鐘內(nèi)分離30種陰離子；1.7分鐘分離19種陽離子;4分鐘可分離10種蛋白質(zhì).試樣用量少：僅需幾nL（10-9 L）的試樣儀器簡(jiǎn)單，操作成本低：分析一個(gè)試樣僅需幾毫升流動(dòng)液。不足之處：不足之處：進(jìn)樣不夠方便。應(yīng)用范圍相對(duì)較窄。分析陰離子時(shí)，由陰極進(jìn)樣，在陽極檢測(cè)。但電滲流方向與陰離子受電場(chǎng)力作用移動(dòng)方向相反，出峰時(shí)間較長(zhǎng)。1:39:06超臨界流體色譜一、一、超臨界流體色譜的特點(diǎn)與原理超臨界流體色譜的特點(diǎn)與原理

10、feature and principle of SFC二二、超臨界流體色譜儀的結(jié)構(gòu)流程、超臨界流體色譜儀的結(jié)構(gòu)流程structure and general process of SFC 三、超臨界流體色譜的應(yīng)用三、超臨界流體色譜的應(yīng)用application of SFCsupercritical fluid chromatograph, SFC1:39:06Berger(產(chǎn)地：美國(guó)產(chǎn)地：美國(guó))超臨界流體色譜儀超臨界流體色譜儀(SFC) 技術(shù)參數(shù)技術(shù)參數(shù) 1.流量0-70ml/min2.改性劑0-100%3.多階程序升溫4.壓力程序主要特點(diǎn)主要特點(diǎn)1.分析速度比HPLC提高3-10倍2.溶劑

11、成本是HPLC的1/3-1/403.可以連接氣相的FID檢測(cè)器,也可連接液相的UV,DAD等檢測(cè)器，更有MS檢測(cè)器4.杰出的手性化合物分離能力5.精密的超臨界流體控制技術(shù)1:39:06JASCO(產(chǎn)地：產(chǎn)地： 日本日本)超臨界色譜儀超臨界色譜儀(SFC) 技術(shù)參數(shù)技術(shù)參數(shù) 1.流量范圍:0.001-10ml/min 2.最高壓力:30MPa 主要特點(diǎn)主要特點(diǎn)1.與泵一體的泵頭制冷裝置設(shè)計(jì)便于操作 2.獨(dú)有的SSQD系統(tǒng),確保了被輸送介質(zhì)的流速穩(wěn)定 3.泵頭電子冷卻裝置保持泵頭溫度低于 4 4.系統(tǒng)控制單元包括各種操作模式,如加入有機(jī)改性試劑 1:39:06一、一、超臨界流體色譜的特點(diǎn)與原理pr

12、inciple and character of supercritical fluid chromatography1.1.概述概述 超臨界流體超臨界流體：在高于臨界壓力與臨界溫度時(shí)，物質(zhì)的一種狀態(tài)。性質(zhì)介于液體和氣體之間。 超臨界流體色譜(SFC)，80年代快速發(fā)展，具有液相、氣相色譜不具有的優(yōu)點(diǎn):（1 1）可處理高沸點(diǎn)、不揮發(fā)試）可處理高沸點(diǎn)、不揮發(fā)試樣；樣；（2 2）比）比LCLC有更高的柱效和分離有更高的柱效和分離效率效率。1:39:062. 超臨界流體性質(zhì)（1 1）性質(zhì)介于液體和氣體之間）性質(zhì)介于液體和氣體之間; ; 具有氣體的低黏度、液體的高密度，擴(kuò)散系數(shù)位于兩具有氣體的低黏度、

13、液體的高密度，擴(kuò)散系數(shù)位于兩者之間。者之間。（2 2）可通過改變超臨界流體的密度（程序改變）調(diào)節(jié)組分）可通過改變超臨界流體的密度（程序改變）調(diào)節(jié)組分分離（類似于氣相色譜的程序升溫，液相色譜中的梯度淋分離（類似于氣相色譜的程序升溫，液相色譜中的梯度淋洗）。洗）。 超臨界流體的密度與壓力有關(guān)。超臨界流體的密度與壓力有關(guān)。1:39:063.原理 SFC的流動(dòng)相的流動(dòng)相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細(xì)管壁）上的高聚物；可使用液相色譜的柱填料。填充柱SFC和毛細(xì)管柱SFC； 分離機(jī)理：分離機(jī)理：吸附與脫附。組分在兩相間的分配系數(shù)不同而被

14、分離； 通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的壓力（調(diào)節(jié)流動(dòng)相的密度），調(diào)整組分保留值；1:39:06壓力效應(yīng)： SFC的柱壓降大（比毛細(xì)管色譜大30倍），對(duì)分離有影響（柱前端與柱尾端分配系數(shù)相差很大，產(chǎn)生壓力效應(yīng)）； 超臨界流體的密度受壓力在臨界壓力處最大，超過該點(diǎn)，影響小，超過臨界壓力20%，柱壓降對(duì)分離的影響小； 壓力效應(yīng)：在SFC中，壓力變化對(duì)容量因子產(chǎn)生顯著影響，超流體的密度隨壓力增加而增加，密度增加提高溶劑效率，淋洗時(shí)間縮短。 CO2流動(dòng)相，當(dāng)壓力改變：7.09.0106 Pa，則： C16H34的保留時(shí)間 25min 5min。1:39:06程序升壓1:39:07二、二、超臨界流體色譜的結(jié)構(gòu)與流程in

15、strument structure and the general process of SFC1.1.結(jié)構(gòu)流程結(jié)構(gòu)流程 1:39:072.主要部件（1）SFC的高壓泵的高壓泵 無脈沖的注射泵；通過電子壓力傳感器和流量檢測(cè)器，計(jì)算機(jī)控制流動(dòng)相的密度和流量； （2）SFC的色譜柱和固定相的色譜柱和固定相 可以采用液相色譜柱和交聯(lián)毛細(xì)管柱； SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細(xì)管壁）上的高聚物；專用的毛細(xì)管柱SFC；1:39:07主要部件（3 3）流動(dòng)相流動(dòng)相 SFC的流動(dòng)相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3 CO2應(yīng)用最廣泛；無色、無味、無毒、易得、對(duì)各類有機(jī)物溶解性好，在紫外光區(qū)無吸收；缺點(diǎn)：極性太弱；加少量甲醇等改性；（4 4）檢測(cè)器）檢測(cè)器 可采用液相色譜