工科碩士答辯學(xué)術(shù)匯報(bào)PPT

1、xxxxxxxxx菌菌菌菌菌菌XXXXXX酶酶酶酶酶酶基因工程菌的構(gòu)建與發(fā)酵優(yōu)化基因工程菌的構(gòu)建與發(fā)酵優(yōu)化基因工程菌的構(gòu)建與發(fā)酵優(yōu)化基因工程菌的構(gòu)建與發(fā)酵優(yōu)化基因工程菌的構(gòu)建與發(fā)酵優(yōu)化基因工程菌的構(gòu)建與發(fā)酵優(yōu)化碩士學(xué)位論文答辯碩士學(xué)位論文答辯碩士學(xué)位論文答辯碩士學(xué)位論文答辯碩士學(xué)位論文答辯碩士學(xué)位論文答辯堿性果膠酶堿性果膠酶 (PGL,E.C. 4.2.2.2)可在高可在高pH條件下以反式消去作用斷條件下以反式消去作用斷開(kāi)果膠聚合物主鏈開(kāi)果膠聚合物主鏈,裂解產(chǎn)物為裂解產(chǎn)物為4:5不飽和的寡聚半乳糖醛酸不飽和的寡聚半乳糖醛酸堿性果膠酶概述堿性果膠酶概述堿性果膠酯裂解酶主要來(lái)源于細(xì)菌和霉菌堿性果膠

2、酯裂解酶主要來(lái)源于細(xì)菌和霉菌,其其中細(xì)菌以中細(xì)菌以Bacillus和和Erwinia為主為主紡織行業(yè)紡織行業(yè)不同來(lái)源的不同來(lái)源的PGL分子量差別較大分子量差別較大,范圍為范圍為23-74kDa,最適最適pH 為為8-11,其生化特性的差異可其生化特性的差異可能是多種形式果膠存在的原因能是多種形式果膠存在的原因其他領(lǐng)域其他領(lǐng)域食品行業(yè)食品行業(yè)紡織品前處理的酶法工藝流程紡織品前處理的酶法工藝流程l 生物法節(jié)能、水,低污染l 提高產(chǎn)品質(zhì)量l 環(huán)境污染和能源危機(jī)l 紡織工業(yè)高污染、高能耗SingeingDesizing ScouringBleaching退漿退漿 精練精練角質(zhì)和果膠質(zhì)角質(zhì)和果膠質(zhì)漂白漂

3、白淀粉酶淀粉酶/PVA降解酶降解酶角質(zhì)酶角質(zhì)酶/堿性果膠酶堿性果膠酶過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化氫酶上漿上漿堿性果膠酶概述堿性果膠酶概述國(guó)內(nèi)外堿性果膠酶基因工程菌研究情況國(guó)內(nèi)外堿性果膠酶基因工程菌研究情況宿主宿主載體載體培養(yǎng)策略培養(yǎng)策略發(fā)酵發(fā)酵時(shí)間時(shí)間(h)DCW(g L-1)PGL 酶活酶活(U ml-1)生產(chǎn)生產(chǎn)強(qiáng)度強(qiáng)度(U L-1h-1)參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)P. pastoris X-33Invitrogen搖瓶發(fā)酵120N.S.20 to0.2(Liu et al., 2006)P. pastoris GS 115 Invitrogen山梨醇和甲醇混合流加低溫誘導(dǎo) 961431593 to16.7(W

4、ang et al., 2010)E. coli BL21 (DE3)pET22b(+)DO-stat 甘油流加培養(yǎng)溫度37 oC13837 a,b, ex2.8(Matsumoto et al., 2002)E. coli Turner (DE3) plac IpET28a(+)搖瓶發(fā)酵誘導(dǎo)溫度20 oC60N.S.360 b,in6.0(Zhao et al., 2007)E. coli JM109pHsh分批發(fā)酵溫度誘導(dǎo)型菌株252022 ex0.9(Zhuge et al., 2007)畢赤酵母畢赤酵母 發(fā)酵周期長(zhǎng) 工藝流程復(fù)雜 低溫誘導(dǎo)能耗高原核表達(dá)體系原核表達(dá)體系 酶活水平高 工藝

5、流程簡(jiǎn)單 發(fā)酵周期短異源蛋白異源蛋白分泌表達(dá)分泌表達(dá)目的蛋白目的蛋白自身特性自身特性過(guò)程過(guò)程控制控制策略策略表達(dá)表達(dá)系統(tǒng)系統(tǒng)特性特性培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成流加策略流加策略誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)方法重組大腸桿菌的分泌表達(dá)重組大腸桿菌的分泌表達(dá)異源蛋白異源蛋白分泌表達(dá)分泌表達(dá)目的蛋白目的蛋白自身特性自身特性過(guò)程過(guò)程控制控制策略策略表達(dá)表達(dá)系統(tǒng)系統(tǒng)特性特性培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成流加策略流加策略誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)方法重組大腸桿菌的分泌表達(dá)重組大腸桿菌的分泌表達(dá)生物量比產(chǎn)率分泌比率After胞外胞外PGL胞內(nèi)胞內(nèi)PGL包涵體包涵體胞外胞外PGL胞內(nèi)胞內(nèi)PGL包涵體包涵體Before研究思路研究思路大腸桿菌大腸桿菌枯草芽孢桿

6、菌枯草芽孢桿菌搖瓶水平搖瓶水平發(fā)酵罐水平發(fā)酵罐水平搖瓶水平搖瓶水平1. 堿性果膠酶基因在大堿性果膠酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)腸桿菌中的克隆與表達(dá)2. 影響重組大腸桿菌胞影響重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)外生產(chǎn)PGL的關(guān)鍵因素的關(guān)鍵因素3.1 重組大腸桿菌兩階重組大腸桿菌兩階段甘油流加策略的研究段甘油流加策略的研究3.2 流加培養(yǎng)過(guò)程誘導(dǎo)流加培養(yǎng)過(guò)程誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的研究時(shí)機(jī)的研究4. 堿性果膠酶基因在堿性果膠酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)枯草芽孢桿菌中的表達(dá)5. 重組堿性果膠酶重組堿性果膠酶粗酶性質(zhì)的初步研究粗酶性質(zhì)的初步研究原核宿主表達(dá)體系原核宿主表達(dá)體系菌體量菌體量比生產(chǎn)比生產(chǎn)分泌比率分泌比率1. 堿性果

7、膠酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)堿性果膠酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)Digestion and ligationATGpET20b(+)/pglpglFnew-S/Fnew-APCRATGTAABacillus sp. WSHB04-02 genomic DNApgl 1.2 KbPGL基因PCR擴(kuò)增片段鑒定 重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證(bp)20001000750 1 M 26371208(bp)20001000750 1 M 1. 小結(jié)小結(jié)發(fā)酵上清SDS-PAGE電泳分析PL(43kDa)116.043 kDa PGL(kDa)66.245.035.025.018.41 M 將PGL-1638序列

8、進(jìn)行測(cè)序,得到Bacillus sp. WSHB04-02的PGL相關(guān)1638 bp的基因,將其CDS部分(1263 bp)在NCBI進(jìn)行BALST分析,表明本研究克隆到的PGL基因與Bacillus subtilis SO113(NCBI Accession NO. X74880)的該基因同源性為98%,具有14個(gè)差別核苷酸. 將載體pET-20b(+)/pgl轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3),得到基因工程菌E. coli BL21(DE3) (pET-20b(+)/pgl) ,且測(cè)序結(jié)果和SDS-PAGE結(jié)果證實(shí)了該表達(dá)載體中所插入基因編碼的氨基酸序列完全正確 .研究思路研究思路大腸

9、桿菌大腸桿菌枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌搖瓶水平搖瓶水平發(fā)酵罐水平發(fā)酵罐水平搖瓶水平搖瓶水平1. 堿性果膠酶基因在大堿性果膠酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)腸桿菌中的克隆與表達(dá)2. 影響重組大腸桿菌胞影響重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)外生產(chǎn)PGL的關(guān)鍵因素的關(guān)鍵因素3.1 重組大腸桿菌兩階重組大腸桿菌兩階段甘油流加策略的研究段甘油流加策略的研究3.2 流加培養(yǎng)過(guò)程誘導(dǎo)流加培養(yǎng)過(guò)程誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的研究時(shí)機(jī)的研究4. 堿性果膠酶基因在堿性果膠酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)枯草芽孢桿菌中的表達(dá)5. 重組堿性果膠酶重組堿性果膠酶粗酶性質(zhì)的初步研究粗酶性質(zhì)的初步研究原核宿主表達(dá)體系原核宿主表達(dá)體系菌體生長(zhǎng)菌體生長(zhǎng)目的蛋白表達(dá)量

10、目的蛋白表達(dá)量分泌比率分泌比率2.1 初始培養(yǎng)基的選擇Culture mediaDCW(gcell L-1)Extracellular activity (U ml-1)Specific productivity (U gcell-1)Secretion capability (%)LB4.87.91.637.92YT5.810.41.732.6SOC7.413.71.842.6TB11.528.72.554.8SB12.125.92.153.9l 采用在TB培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基,胞外PGL酶活到達(dá)28.75 U ml-1,分別是LB培養(yǎng)基的3.6倍和SB培養(yǎng)基的1.1倍.TB培養(yǎng)基和SB培養(yǎng)

11、基中,比生產(chǎn)率(胞外酶活/DCW)和分泌率(胞外酶活/總酶活)基本相當(dāng),LB、2YT和SOC培養(yǎng)基稍低 .2. 影響重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)影響重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)PGL的關(guān)鍵因素的關(guān)鍵因素酵母粉:蛋白胨安琪酵母粉(g)蛋白胨試劑(g)DCW (gcell L-1)PGL酶活(U ml-1)1 : 036018.18.73 : 1278.223.79.32 : 12410.927.512.71 : 11816.422.914.21 : 21221.819.713.91 : 3924.516.511.90 : 103213.89.9氮源含氮量添加克數(shù)(g)干重 (gcell L-1)PGL酶活 (U

12、 ml-1)氮源種類對(duì)照-112.2526.38分子級(jí)對(duì)照-213%2810.215.8分子級(jí)胰蛋白胨12%307.83.7試劑級(jí)工業(yè)級(jí)蛋白胨10%368.44.3工業(yè)級(jí)蛋白胨試劑11%329.913.8試劑級(jí)大豆蛋白胨9%4011.110.3試劑級(jí)安琪酵母10%368.718.1工業(yè)級(jí)酵母浸膏7%519.19.7試劑級(jí)牛肉浸膏8%4511.37.32試劑級(jí)2.2 氮源對(duì)工程菌生長(zhǎng)與產(chǎn)酶情況的影響2. 影響重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)影響重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)PGL的關(guān)鍵因素的關(guān)鍵因素l 以安琪酵母粉和大豆蛋白胨為組合碳源,維持總氮量不變,考察不同配比對(duì)菌體生長(zhǎng)與PGL合成的影響.確定氮源組成為:安琪酵

13、母粉24 g L-1 、蛋白胨試劑11 g L-1. Optimal carbon source :glycerol Optimal optical concentration :10 g L-1 2. 影響重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)影響重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)PGL的關(guān)鍵因素的關(guān)鍵因素2.4 碳源對(duì)工程菌生長(zhǎng)與產(chǎn)酶情況的影響Extracellular PGL activity , DCW , Specific productivity .l 以甘油、葡萄糖為碳源時(shí),菌體干重分別達(dá)到11.5 和13.1 g L-1,胞外酶活分別為28.1和 28.8 U ml-1,顯著高于其他三種碳源.l 但以葡萄糖為

14、碳源時(shí)工程菌產(chǎn)酶不穩(wěn)定.l 10 g L-1甘油較適合菌體生長(zhǎng)和PGL的胞外分泌,胞外PGL酶活與DCW分別為34.2 U mL-1 和13.6 g L-1.l 繼續(xù)增加甘油含量對(duì)菌體生長(zhǎng)和PGL合成影響不明顯.Metal ionsAdding Mode(OD600)Concentration (mM)Extracelullar PGL(U ml-1)Intracelullar PGL(U ml-1)Biomass(OD600)Con-trol00113.53.625.4 Ca2+00.197.93.214.410.61114.510.920.4 5128.813.419.920142.514

15、.820.1Fe3+00.195.93.018.80.61107.211.323.55110.710.821.620130.913.121.2Mg2+00.183.94.710.20.61101.310.614.95105.911.013.120120.612.610.52. 影響重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)影響重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)PGL的關(guān)鍵因素的關(guān)鍵因素2.3 金屬離子對(duì)重組大腸桿菌生長(zhǎng)與PGL合成的影響 在接種同時(shí)加入Ca2+ 等微量金屬元素(0.1 mM),對(duì)菌體生長(zhǎng)造成明顯影響,PGL產(chǎn)量也隨之降低. 在OD=0.6時(shí), 加入20 mM的Fe3+ 或Mg2+對(duì)PGL胞外積累具有促進(jìn)作用,與對(duì)

16、照相比分別提高15.4%和6.2%,但菌濃分別下降16.5%與19.7%. Ca2+的促進(jìn)作用最為明顯, 濃度升高作用越為顯著,添加1mM、5mM和20mM ,PGL胞外酶活分別提升0.17%、13.5%和25.5%.2.4 誘導(dǎo)條件重組PGL胞外生產(chǎn)的影響2. 影響重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)影響重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)PGL的關(guān)鍵因素的關(guān)鍵因素 PGL productivity was the highest at around 50 M of IPTGExtracellular PGL activity , intracellular PGL activity , DCW . 22 oC誘導(dǎo)時(shí) ,P

17、GL胞外酶活僅8.5 U ml-1,分泌率為47.7%,均為5者中最低. 30 oC時(shí),細(xì)胞干重13.6 g L-1,分別是22 oC和26 oC 誘導(dǎo)的1.57倍和1.22倍. 然而,高生物量并沒(méi)有帶來(lái)高產(chǎn)量. 26 oC誘導(dǎo)達(dá)到蛋白合成與轉(zhuǎn)運(yùn)最佳平衡,胞外酶活65.8U ml-1,是 30 oC時(shí)的1.39倍,胞外分泌率達(dá)66.4%. IPTG對(duì)菌體生長(zhǎng)有一定抑制作用,與對(duì)照相比,菌體干重下降約15%. 當(dāng)IPTG濃度超過(guò)20 M,PGL總酶活反而降低. 添加50 M IPTG時(shí),PGL總酶活最高,達(dá)到165.82 U mL-1,胞外分泌率76.8%. Induction at 26 le

18、d to a better coordination between protein synthesis and translocation IPTG添加濃度對(duì)PGL分布的影響 隨IPTG濃度由0升至400 M,相同生物量對(duì)應(yīng)的不溶性包涵體逐漸增加. 其濃度為50 M時(shí),可溶目的蛋白比例較高. 條帶1,2,3 (cs):胞外組分 條帶5,6,7 (si):胞內(nèi)與周質(zhì)可溶組分 條帶8,9,10 (ii):胞內(nèi)與周質(zhì)不溶組分2. 影響重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)影響重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)PGL的關(guān)鍵因素的關(guān)鍵因素v 為提高重組為提高重組E. coli BL21(DE3)發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的產(chǎn)量和胞發(fā)酵生產(chǎn)堿

19、性果膠酶的產(chǎn)量和胞外分泌率外分泌率,在搖瓶中優(yōu)化了重組大腸桿菌生產(chǎn)堿性果膠酶的關(guān)在搖瓶中優(yōu)化了重組大腸桿菌生產(chǎn)堿性果膠酶的關(guān)鍵因素鍵因素,確定了其胞外表達(dá)的最適條件確定了其胞外表達(dá)的最適條件.發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體干重達(dá)發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體干重達(dá)11.8 g L-1,PGL 胞外酶活達(dá)胞外酶活達(dá)165.8 U mL-1 ,胞外分泌率為胞外分泌率為76.8%.v 最適培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基為:安琪酵母粉安琪酵母粉24 g L-1、蛋白胨試劑、蛋白胨試劑11 g L-1、甘油、甘油 10 g L-1、K2HPO4 72 mM、KH2PO4 17 mM.v 最適誘導(dǎo)條件為最適誘導(dǎo)條件為:誘導(dǎo)溫度為誘導(dǎo)溫度為26 oC

20、,添加添加0.05 mM IPTG誘導(dǎo)表誘導(dǎo)表達(dá)達(dá)48 h.v 在在OD600=0.6時(shí)添加一定濃度時(shí)添加一定濃度Ca 2+、Fe 3+與與 Mg 2+,對(duì)對(duì)PGL的可的可溶表達(dá)具有促進(jìn)作用溶表達(dá)具有促進(jìn)作用.2. 小結(jié)小結(jié)研究思路研究思路大腸桿菌大腸桿菌枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌搖瓶水平搖瓶水平發(fā)酵罐水平發(fā)酵罐水平搖瓶水平搖瓶水平1. 堿性果膠酶基因在大堿性果膠酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)腸桿菌中的克隆與表達(dá)2. 影響重組大腸桿菌胞影響重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)外生產(chǎn)PGL的關(guān)鍵因素的關(guān)鍵因素3.1 重組大腸桿菌兩階重組大腸桿菌兩階段甘油流加策略的研究段甘油流加策略的研究3.2 流加培養(yǎng)過(guò)程誘導(dǎo)流

21、加培養(yǎng)過(guò)程誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的研究時(shí)機(jī)的研究4. 堿性果膠酶基因在堿性果膠酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)枯草芽孢桿菌中的表達(dá)5. 重組堿性果膠酶重組堿性果膠酶粗酶性質(zhì)的初步研究粗酶性質(zhì)的初步研究原核宿主表達(dá)體系原核宿主表達(dá)體系菌體生長(zhǎng)菌體生長(zhǎng)目的蛋白表達(dá)量目的蛋白表達(dá)量分泌比率分泌比率3.1 重組大腸桿菌兩階段甘油流加策略的研究重組大腸桿菌兩階段甘油流加策略的研究指數(shù)流加策略DCW () , glycerol feeding rate (), glycerol () ,acetate()7.7 g L-113.9 g L-1 指數(shù)流加9 h后甘油殘留濃度達(dá)到13.9 g L-1.誘導(dǎo)期乙酸積累量高達(dá)7.7

22、 g L-1. 當(dāng)其濃度高于2.0 g L-1時(shí),會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)與重組蛋白的合成. 初始甘油濃度為10 g L-1 ,培養(yǎng)溫度為37 oC. 當(dāng)DO反彈甘油耗盡后, 進(jìn)行指數(shù)流加, set=0.20 h-1. 當(dāng)細(xì)胞干重達(dá)到15 g L-1,加入 0.05 mM IPTG,同時(shí)將培養(yǎng)溫度降至26 oC,開(kāi)始誘導(dǎo)PGL表達(dá).set=0.2h146.2 g L-133.8 U mL-1 菌濃大幅提升，指數(shù)流加9小時(shí)菌體干重攀升至46.2 g L-1. 但PGL胞外酶活在18處達(dá)到峰值,僅為33.8 U mL-1.3.1 重組大腸桿菌兩階段甘油流加策略的研究重組大腸桿菌兩階段甘油流加策略的研究指數(shù)流

23、加策略DCW () , glycerol feeding rate (), glycerol () ,acetate() 當(dāng)誘導(dǎo)開(kāi)始后,實(shí)際比生長(zhǎng)速率(exp) 明顯低于設(shè)定比生長(zhǎng)速率(set).若在誘導(dǎo)期采用低速流加以減緩營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的累積,可能有助于提高重組PGL的胞外產(chǎn)量. 30 h時(shí)細(xì)胞干重達(dá)到峰值41.3g L-1,比指數(shù)流加降低10.5%. 誘導(dǎo)期甘油與乙酸積累水平顯著降低,分別維持在1.0 g L-1 和 0.7 g L-1以下.DCW () , glycerol feeding rate (), glycerol () ,acetate()3.1 重組大腸桿菌兩階段甘油流加策略的研

24、究重組大腸桿菌兩階段甘油流加策略的研究?jī)呻A段流加策略set=0.2h112 ml h-10.7 g L-11.0 g L-143.1 g L-1 誘導(dǎo)前(菌體生長(zhǎng)階段),指數(shù)流加,set=0.20 h-1. 當(dāng)細(xì)胞干重達(dá)到15 g L-1,加入 0.05 mM IPTG,同時(shí)將培養(yǎng)溫度降至26 oC,開(kāi)始誘導(dǎo)PGL表達(dá). 誘導(dǎo)后(PGL表達(dá)階段) ,甘油流加速率為恒定的12 ml h-1. 高密度誘導(dǎo)時(shí),菌體生長(zhǎng)沒(méi)有受到明顯影響,最大細(xì)胞干重為44.6 g L-1 . 生長(zhǎng)后期誘導(dǎo)雖然對(duì)菌體生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響,但胞外產(chǎn)酶能力卻為三者中最低,胞外酶活僅為93.72 U mL-1. 菌體干重、胞外酶

25、活與胞內(nèi)酶活分別為41.0 g L-1 、 257.8 U mL-1 和 114.1 U mL-1. 在中密度誘導(dǎo)時(shí),PGL合成水平最高,總酶活在培養(yǎng)20 h至48 h的過(guò)程中大幅攀升,峰值為371.9U mL-1. 在細(xì)胞生長(zhǎng)初期誘導(dǎo),菌體生長(zhǎng)受到明顯抑制,發(fā)酵21h達(dá)到最高菌濃21.7 g L-1. 嚴(yán)重的生長(zhǎng)抑制導(dǎo)致PGL合成水平大幅下降,發(fā)酵24小時(shí)胞外酶活為114.9U mL-1.257.8 U mL-141.0 g L-13.2 流加培養(yǎng)過(guò)程誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的研究流加培養(yǎng)過(guò)程誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的研究371.9 U mL-1BiomassExtracellular PGLTotal PGLlow ce

26、ll density ( 7.5 g L-1),intermediate (15 g L-1), high ( 30 g L-1)v 針對(duì)指數(shù)流加過(guò)程中出現(xiàn)的針對(duì)指數(shù)流加過(guò)程中出現(xiàn)的,誘導(dǎo)后甘油殘留、乙酸大量積累現(xiàn)象誘導(dǎo)后甘油殘留、乙酸大量積累現(xiàn)象,采用采用甘油兩階段流加策略甘油兩階段流加策略.v 為進(jìn)一步緩解誘導(dǎo)對(duì)微生物產(chǎn)生的負(fù)面作用為進(jìn)一步緩解誘導(dǎo)對(duì)微生物產(chǎn)生的負(fù)面作用,分別在重組菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)分別在重組菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)前期、中期與末期起始誘導(dǎo)前期、中期與末期起始誘導(dǎo),考察了不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)重組大腸桿菌分泌考察了不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)重組大腸桿菌分泌表達(dá)表達(dá)PGL的影響的影響.v 誘導(dǎo)前誘導(dǎo)前(菌體生長(zhǎng)階

27、段菌體生長(zhǎng)階段),控制溫度為控制溫度為37 ,待甘油耗盡待甘油耗盡,開(kāi)始指數(shù)流加甘油開(kāi)始指數(shù)流加甘油(set=0.2 h-1), 直到菌體干重達(dá)到直到菌體干重達(dá)到15 g L-1;誘導(dǎo)后誘導(dǎo)后(PGL高表達(dá)階段高表達(dá)階段),將溫將溫度降低為度降低為26 ,同時(shí)加入同時(shí)加入0.05 mM IPTG,以以12 mL h-1的速率進(jìn)行甘油流的速率進(jìn)行甘油流加加,以通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速控制以通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速控制DO為為30%.v 發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵結(jié)束時(shí)PGL 總酶活達(dá)到總酶活達(dá)到371.86 U mL-1,生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到7.1 U mL-1 h-1,胞外分泌比為胞外分泌比為69.3%.實(shí)現(xiàn)了實(shí)現(xiàn)了

28、PGL 的高產(chǎn)量和高生產(chǎn)強(qiáng)度分泌表達(dá)的高產(chǎn)量和高生產(chǎn)強(qiáng)度分泌表達(dá),是大是大腸桿菌體系中已報(bào)道最高水平腸桿菌體系中已報(bào)道最高水平.3. 小結(jié)小結(jié)研究思路研究思路大腸桿菌大腸桿菌枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌搖瓶水平搖瓶水平發(fā)酵罐水平發(fā)酵罐水平搖瓶水平搖瓶水平1. 堿性果膠酶基因在大堿性果膠酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)腸桿菌中的克隆與表達(dá)2. 影響重組大腸桿菌胞影響重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)外生產(chǎn)PGL的關(guān)鍵因素的關(guān)鍵因素3.1 重組大腸桿菌兩階重組大腸桿菌兩階段甘油流加策略的研究段甘油流加策略的研究3.2 流加培養(yǎng)過(guò)程誘導(dǎo)流加培養(yǎng)過(guò)程誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的研究時(shí)機(jī)的研究4. 堿性果膠酶基因在堿性果膠酶基因在枯草芽孢桿

29、菌中的表達(dá)枯草芽孢桿菌中的表達(dá)5. 重組堿性果膠酶重組堿性果膠酶粗酶性質(zhì)的初步研究粗酶性質(zhì)的初步研究原核宿主表達(dá)體系原核宿主表達(dá)體系菌體生長(zhǎng)菌體生長(zhǎng)目的蛋白表達(dá)量目的蛋白表達(dá)量分泌比率分泌比率PlasmidPromoterCharacteristicsSignal PeptideReplicon(Bacillus)CopyNumberpMA0911 PHpaII from pUB110ConstitutiveSamyX from Bacillus amyloliquefasciensfrom pUB110 Rolling-circle 30-50pHT43Pgracconsisting of

30、groE & laO operator with lacInduced by IPTGSamyQ from Bacillus amyloliquefasciensfrom pBS72 ThetaLow pP43NMKPHpaII&P43 compoundConstitutiveSnprB gene from B.subtilis 168from pUB110Rolling-circle30-504. 堿性果膠酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)堿性果膠酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá) Nde I / Sal I digestion LigationNde ISal ISP of PGLpgl(sp)128

31、1 bpPGL8372 bppMAN-S/pMAN-APCRBacillus sp. WSHB04-02 genomic DNApMA/pgl(sp)4. 堿性果膠酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)堿性果膠酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)Kpn I / Hind III digestionLigationKpn IHind IIIRBS from pP43NMKpgl(sp)1283 bppNMK-KHS/pNMK-KHAPCRBacillus sp. WSHB04-02 genomic DNApP43NMK/pgl(sp)4. 堿性果膠酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)堿性果膠酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)P

32、st I / Hind III digestionLigationPst I Hind IIIRBS from pP43NMKpgl1247 bpRBSpP43NMK/pglpNMK-PHS/pNMK-PHAPCRBacillus sp. WSHB04-02 genomic DNA4. 堿性果膠酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)堿性果膠酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)Linearized at Aat II+Fast PCR Clone Kit9274 bpAat IIBam HIpgl1241 bppHT43-S/pHT43-APCRBacillus sp. WSHB04-02 genomic DNA

33、4. 堿性果膠酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)堿性果膠酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)4. 小結(jié)小結(jié)116.0 4 1 M 0 2 3(kDa)66.245.035.025.018.443 kDa PGLbp20001000750 1 2 3 4 M 1273 PGL基因瓊脂糖凝膠電泳圖700050040002000 1000 6672 1273 M1 1 2 3 4 M 21000750枯草芽孢桿菌表達(dá)載體酶切電泳驗(yàn)證0: B. subtilis WB600/pMA;1: B. subtilis WB600/pMA/pgl(sp);2: B. subtilis WB600/pP43NMK/pgl(s

34、p); 3: B. subtilis WB600/pP43NMK/pgl ;4: B. subtilis 168/pHT43/pgl; 枯草芽孢桿菌重菌株發(fā)酵上清SDS-PAGE分析4. 小結(jié)小結(jié)B. subtilis StrainPGL Activity(U mL-1)OD600(45h)WB600/pMA/pgl(sp)28.7 27.3168/pHT43/pgl1.7 8.4WB600/pP43NMK/pgl 0.610.1WB600/pP43NMK/pgl(sp)2.3 13.9WB600/pMA0.4 23.8 質(zhì)粒pP43NMK含有PHpaII與P43復(fù)合啟動(dòng)子,具有較高的啟動(dòng)強(qiáng)度

35、,拷貝數(shù)較高,為30-50.但質(zhì)粒自身可能存在隱性問(wèn)題,本實(shí)驗(yàn)室采用該質(zhì)粒進(jìn)行其他蛋白表達(dá)時(shí)均未成功. 原因有待進(jìn)一步探究,猜想可能的原有有: pHT43雖含有Theta復(fù)制子,具有較好的分離穩(wěn)定性,但胞內(nèi)拷貝數(shù)偏低,為10以下,目的蛋白不易大量表達(dá). 該質(zhì)粒含有氯霉素抗性,無(wú)法在宿主WB600中應(yīng)用,本研究選擇B. subtilis 168作為該質(zhì)粒宿主,但與WB600相比,B. subtilis 168自身產(chǎn)生的蛋白酶種類與數(shù)量較多,外源蛋白可能受到了比較嚴(yán)重的蛋白酶降解,從而無(wú)法積累.研究思路研究思路大腸桿菌大腸桿菌枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌搖瓶水平搖瓶水平發(fā)酵罐水平發(fā)酵罐水平搖瓶水平搖瓶水平1. 堿性果膠酶基因在大堿性果膠酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)腸桿菌中的克隆與表達(dá)2. 影響重組大腸桿菌胞影響重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)外生產(chǎn)PG