昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗科ppt課件

1、 酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)放射免疫放射免疫技術(shù)技術(shù)發(fā)光免疫發(fā)光免疫技術(shù)技術(shù)酶免疫技酶免疫技術(shù)術(shù)三大經(jīng)典標志技術(shù)酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)-三大經(jīng)典標志技術(shù)之一三大經(jīng)典標志技術(shù)之一三大經(jīng)典標志技術(shù)：三大經(jīng)典標志技術(shù)：抗原抗體反響的抗原抗體反響的特異性特異性+酶高效催化反響的酶高效催化反響的專注性專注性酶免疫技術(shù)的原理及特點酶免疫技術(shù)的原理及特點鄰苯二胺鄰苯二胺 OPDOPD四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺 TMBTMB5-5-氨基水楊酸氨基水楊酸5-ASA 5-ASA 2,2-2,2-氨基氨基- -二二(3-(3-乙基乙基- -苯并噻苯并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)銨鹽銨鹽 ABTS ABTS常用底物常用底物酶

2、免疫技術(shù)的中心酶免疫技術(shù)的中心組成部分組成部分 酶結(jié)合物酶結(jié)合物conjugateconjugate酶標志物酶標志物 經(jīng)過化學(xué)反響或免經(jīng)過化學(xué)反響或免疫學(xué)反響，讓酶與疫學(xué)反響，讓酶與抗體或抗原構(gòu)成的抗體或抗原構(gòu)成的結(jié)合物結(jié)合物 酶標志抗體或抗原酶標志抗體或抗原抗原要求純度高，抗原性完好抗原要求純度高，抗原性完好 抗體需求特異性好、效價高、抗體需求特異性好、效價高、親合力強以及比活性較高，能批親合力強以及比活性較高，能批量消費，易純化。量消費，易純化。 制備方法要制備方法要求求酶標志抗體或抗原酶標志抗體或抗原制備方法要制備方法要求求技術(shù)方法簡單、產(chǎn)率高，反復(fù)性技術(shù)方法簡單、產(chǎn)率高，反復(fù)性好好標志

3、反響不影響酶和抗原或抗體標志反響不影響酶和抗原或抗體的活性的活性酶標志物穩(wěn)定酶標志物穩(wěn)定 ，不構(gòu)成聚合物，不構(gòu)成聚合物酶標志抗體或抗原酶標志抗體或抗原制備方法制備方法戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法酶標志抗體或抗原酶標志抗體或抗原 改良過碘酸鈉法改良過碘酸鈉法純化及鑒純化及鑒定定標志完成后應(yīng)除去反響液中的游離標志完成后應(yīng)除去反響液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，防止游離酶及抗體或抗原聚合物，防止游離酶添加非特異顯色，以及游離抗體或添加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而降低特異性染色抗原起競爭作用而降低特異性染色強度強度 常用的純化方法：常

4、用的純化方法：葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠G-200/G-150G-200/G-150過柱層析純化過柱層析純化50%50%飽和硫酸銨沉淀提純飽和硫酸銨沉淀提純酶標志抗體或抗原酶標志抗體或抗原固相抗體或抗原是非均相酶免技術(shù)中將固相抗體或抗原是非均相酶免技術(shù)中將游離和結(jié)合的酶標志物迅速分別的最常游離和結(jié)合的酶標志物迅速分別的最常用方法用方法 固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結(jié)合固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結(jié)合到固相載體的外表到固相載體的外表 固相載體固相載體要求要求 結(jié)合抗體或抗原的容量大結(jié)合抗體或抗原的容量大 抗體或抗原結(jié)實地固定在其外表抗體或抗原結(jié)實地固定在其外表 不影響免疫反響性不影響免疫反響性 利

5、于反響充分進展利于反響充分進展 固相方法簡便易行，快速經(jīng)濟固相方法簡便易行，快速經(jīng)濟種類種類塑料制品塑料制品 微顆粒微顆粒膜載體膜載體 固相載體固相載體將抗原或抗體結(jié)合于固相載體將抗原或抗體結(jié)合于固相載體用用1%1%5%5%的牛血潔白蛋白或的牛血潔白蛋白或5%5%20%20%小牛血小牛血清消除固相載體外表未結(jié)合的位點，消除非清消除固相載體外表未結(jié)合的位點，消除非特異性吸附特異性吸附包被包被coatingcoating封鎖封鎖blockinblocking g包被與封鎖包被與封鎖酶酶免免疫疫技技術(shù)術(shù)酶免疫組化酶免疫組化酶免疫測定酶免疫測定均均 相相非均相非均相固相酶免疫測定固相酶免疫測定液相酶免

6、疫測定液相酶免疫測定組織切片或其它標本中抗原的定位組織切片或其它標本中抗原的定位 液體標本中抗原或液體標本中抗原或抗體的定性和定量抗體的定性和定量用于小分子激素和半抗原如藥物的測定用于小分子激素和半抗原如藥物的測定 酶標志物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，酶標志物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標志酶的活性會發(fā)生改動，不用分別結(jié)合標志酶的活性會發(fā)生改動，不用分別結(jié)合和游離酶標志物，經(jīng)過測定標志酶的活性和游離酶標志物，經(jīng)過測定標志酶的活性的改動，而確定抗原或抗體的含量。的改動，而確定抗原或抗體的含量。原原理理均相酶免疫測定均相酶免疫測定最具代表性的兩種技術(shù)最具代表性的兩種技術(shù)酶放大免疫測定技酶放大免疫測定技

7、術(shù)術(shù)EMITEMITenzyme-mutiplied enzyme-mutiplied immunoassay immunoassay techniquetechnique克隆酶供體免疫分析克隆酶供體免疫分析 CEDIACEDIAcloned enzyme cloned enzyme donor immunoassay donor immunoassay 均相酶免疫測定均相酶免疫測定與均相與均相不同之不同之處處需分別游離與結(jié)合的酶標志物需分別游離與結(jié)合的酶標志物非均相酶免疫測定非均相酶免疫測定底物顯色底物顯色定性或定定性或定量的分析量的分析原原理理包被包被反響反響參與待參與待測抗體測抗體或或抗

8、原和抗原和酶標抗酶標抗原原或抗體或抗體洗滌洗滌使結(jié)合使結(jié)合在固相在固相上上的抗原的抗原抗體復(fù)抗體復(fù)合物合物與未結(jié)與未結(jié)合的分合的分別別1234一、根本原理一、根本原理固相的抗原或固相的抗原或抗體抗體 酶標志物酶結(jié)酶標志物酶結(jié)合物合物 酶反響的酶反響的底物底物 三個必要試三個必要試劑劑 二、方法類型及反響原理二、方法類型及反響原理雙抗體夾心法雙抗體夾心法方法：用知抗體包被，參與待檢血清，方法：用知抗體包被，參與待檢血清，再加酶標抗體，加底物顯色再加酶標抗體，加底物顯色運用：運用： 二價或二價以上的較大分子抗二價或二價以上的較大分子抗原測定原測定 常用于檢測乙型肝炎外表抗原常用于檢測乙型肝炎外表抗

9、原和和e e抗原等抗原等ELISAELISA檢測抗原的方法檢測抗原的方法雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法測抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE EE EE EELISAELISA檢測抗原的方法檢測抗原的方法競爭法測抗原競爭法測抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE E2 2、加待檢物、加待檢物抗原與酶標抗抗原與酶標抗原競爭與抗體原競爭與抗體結(jié)合結(jié)合3 3、加酶作用、加酶作用的底物不顯色的底物不顯色或顯色弱或顯色弱3 3、加酶作用、加酶作用的底物顯色的底物顯色1 1、知抗體包、知抗體包被于載體外表被于載體外表1 1、知抗體包、知抗體包被于載體外表被于載體外表2 2

10、、加待測物、加待測物和酶標抗原，和酶標抗原，酶標抗原與抗酶標抗原與抗體結(jié)合體結(jié)合E E1 1、間接法、間接法方法方法 用知抗原包被，參與待測血清，再加酶標用知抗原包被，參與待測血清，再加酶標的抗人的抗人IgGIgG抗抗體或二抗加底物顯色?？箍贵w或二抗加底物顯色。優(yōu)點優(yōu)點 一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體運用運用 常用于常用于HCVHCV抗體、抗體、HIVHIV抗體和梅毒螺旋體抗抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定體等的測定ELISAELISA檢測抗體的方法檢測抗體的方法間接法測抗體間接法測抗體- -E EE EE EE EE EE EE EE EE E2 2

11、、雙抗原夾心法、雙抗原夾心法原理：類似雙抗體夾心法原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似操作步驟：類似 運用：乙型肝炎外表抗體運用：乙型肝炎外表抗體ELISAELISA檢測抗體的方法檢測抗體的方法ELISAELISA檢測抗體的方法檢測抗體的方法4 4、捕獲法、捕獲法 運用：運用： 病原體急性感染診斷中的病原體急性感染診斷中的IgMIgM型抗型抗體體 甲型肝炎甲型肝炎HAV-IgMHAV-IgM抗體抗體 乙型肝炎病毒中心乙型肝炎病毒中心HBc-IgMHBc-IgM抗體抗體ELISAELISA檢測抗體的方法檢測抗體的方法原理：原理：抗人抗人IgMIgM鏈抗體包鏈抗體包被被捕獲待測標本中捕獲待測標本中IgMIgM類抗體類抗體參與特異性抗原和酶參與特異性抗原和酶標志特異性抗原的抗標志特異性抗原的抗體體 底物顯色底物顯色 捕獲法原理捕獲法原理+ +- -E EE EE EE EE E 1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM2 2、加待測物、加待測物特異性特異性IgMIgM與與非特異性非特異性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM結(jié)合結(jié)合3 3、加特異性、加特異性抗原，與特異抗原，與特異性抗體結(jié)合性抗體