發(fā)酵食品工藝學(xué)實(shí)習(xí)pptx

1、發(fā)酵食品工藝學(xué)實(shí)習(xí)醋酸菌菌種的選育食品科學(xué)與工程16-2成員：陳卓 楊艷玲 馬嬌 孫盈盈 劉占明實(shí)習(xí)背景葡萄酒的變酸是由于醋酸桿菌進(jìn)行發(fā)酵消耗酒精而產(chǎn)酸造成的。而醋酸桿菌沒(méi)有芽孢，不能運(yùn)動(dòng)，兼有好氧型菌種和厭氧型菌種，在液體培養(yǎng)基的表面容易形成菌膜。在變酸的葡萄酒與氧接觸時(shí)，容器壁會(huì)形成一個(gè)可見(jiàn)的環(huán)。當(dāng)我們將此環(huán)上的菌落接種，進(jìn)行增殖培養(yǎng)后，可以分離出產(chǎn)酸菌。參考文獻(xiàn)1醋酸菌的分離與鑒定以及紅茶菌培養(yǎng)的研究j_王碩2醋酸菌菌種的冷凍干燥保藏研究j_邵偉3醋酸菌篩選培養(yǎng)基的優(yōu)化和優(yōu)良醋酸菌分離的研究j_周幗萍4醋酸菌優(yōu)良菌株的篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化j_姜曉芝5醋酸菌與其發(fā)酵的機(jī)理_j包啟安6高產(chǎn)醋酸菌

2、的篩選及其形態(tài)生化特征研究j_張忠明7果醋釀造用優(yōu)良菌種的選育及果醋飲料的研制j_侯愛(ài)香8河溪香醋優(yōu)勢(shì)醋酸菌篩選j_黃群9黑加侖果醋優(yōu)良菌種篩選及其發(fā)酵工藝研究j嚴(yán)寶冬10基于固態(tài)培養(yǎng)基的醋酸菌擴(kuò)大培養(yǎng)研究j_郇阿梅11葡萄酒中醋酸菌的生長(zhǎng)存活與氧濃度的關(guān)系j_于清琴12宋河大曲中醋酸菌的分離鑒定及產(chǎn)酸特性j_侯小歌實(shí)習(xí)內(nèi)容1.對(duì)實(shí)驗(yàn)原料樣品進(jìn)行預(yù)處理，使其酸敗，致使樣品菌繁殖2.將樣品菌種擴(kuò)大培養(yǎng)。將樣品加入無(wú)菌試管，裝入無(wú)菌水，振蕩均勻后進(jìn)行梯度稀釋，取各梯度的樣品稀釋液分別涂布于溴甲酚紫顯色平板，涂布完成后30倒置培養(yǎng)48h左右。3.根據(jù)菌落不同形態(tài)進(jìn)行純化接種。選取菌落數(shù)在30-50個(gè)

3、左右的平板，挑取該平板上的所有菌落轉(zhuǎn)入常規(guī)基礎(chǔ)培養(yǎng)基4.對(duì)純化后的菌株進(jìn)行產(chǎn)酸定性實(shí)驗(yàn)。5.對(duì)產(chǎn)酸菌株進(jìn)行產(chǎn)酸能力定量實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)流程樣品富集培養(yǎng)培養(yǎng)稀釋分離純化斜面保藏定性定量菌種保藏樣品準(zhǔn)備葡萄酒1.買來(lái)新鮮葡萄酒，測(cè)定其PH值。選擇葡萄酒時(shí)，酒精濃度要低。（醋酸菌能夠?qū)⒕凭趸梢宜?。因此，乙醇是醋酸菌一個(gè)很好的碳源，但當(dāng)酒精濃度很高時(shí)就會(huì)抑制醋酸菌的生長(zhǎng)。De Ley et al. (1984)指出，培養(yǎng)基中含有5乙醇，檢測(cè)到只有58醋桿菌生長(zhǎng)；當(dāng)培養(yǎng)基中乙醇為13時(shí)，醋酸菌含量會(huì)減少到13。其中，只有20巴士醋桿菌，沒(méi)有紋膜醋桿菌。只有5的葡糖桿菌屬能夠在含有5乙醇的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。但

4、是，周所周知，醋酸菌在乙醇含量為10-14（v/v）的培養(yǎng)基上仍夠能存活甚至生長(zhǎng)。Vaughn (1955)指出醋酸菌能夠忍耐的最大酒精濃度是14和15（v/v）2.將買來(lái)的葡萄酒敞口置于室溫下。（醋酸菌在完全通氣的葡萄酒中生長(zhǎng)的數(shù)量達(dá)108cfulml,而在溶解氧含量較低時(shí)，它們的生長(zhǎng)能力較弱。根據(jù)Holt et al. (1994)，醋桿菌和葡糖桿菌的最適生長(zhǎng)溫度是25-30，在37就觀察不到葡糖醋桿菌的生長(zhǎng)。De Ory et al.（1998) 發(fā)現(xiàn)紋膜醋桿菌生長(zhǎng)所能忍受的最高溫度是35。）3.過(guò)一段時(shí)間測(cè)定葡萄酒的PH,若PH值下降，說(shuō)明有醋酸菌產(chǎn)生。當(dāng)PH值達(dá)到5.5-6.3時(shí)，就

5、可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。（醋酸菌在完全通氣的葡萄酒中生長(zhǎng), 產(chǎn)生大量的醋酸1.28-3.75g/L使其PH 下降。醋酸菌生長(zhǎng)的最適pH是5.5-6.3(Holt et al., 1994)。）參考文獻(xiàn)：梁曼 葡萄酒與醋酸菌于清琴 葡萄酒中醋酸菌的生長(zhǎng)存活與氧濃度的關(guān)系富集培養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)基增值培養(yǎng)基：酵母膏1%，葡萄糖1%，0.02%的結(jié)晶紫0.5%，制霉素5mg/mL,PH5.5,0.1Mpa滅菌30min,待冷卻到70是時(shí)加3%（V/V）的無(wú)水乙醇。富集培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，吸取10mL的葡萄酒樣，加入90mL增值培養(yǎng)基中，25-30恒溫培養(yǎng)4小時(shí)。參考文獻(xiàn)：周幗萍 醋酸菌篩選培養(yǎng)基的優(yōu)化和優(yōu)良醋

6、酸菌分離的研究稀釋分離培養(yǎng)基培養(yǎng)基平板分離培養(yǎng)基：酵母膏1%，葡萄糖1%，碳酸鈣2%（165干熱滅菌30min）,無(wú)水乙醇3%，瓊脂1.8%，PH值自然。各取1mL的增值培養(yǎng)液，加入裝有9mL的無(wú)菌生理鹽水的試管中，制成濃度梯度為10-1的菌懸液，然后逐步稀釋到10-5，10-6，10-7，濃度梯度，吸取后三個(gè)濃度梯度的稀釋液各200uL，用涂布法接種于分離培養(yǎng)基平板上，每個(gè)濃度梯度涂布2或3個(gè)平板，30恒溫培養(yǎng)4天，重復(fù)上述操作，直至平板出現(xiàn)單菌落。參考文獻(xiàn) ：醋酸菌篩選培養(yǎng)基的優(yōu)化和優(yōu)良醋酸菌分離的研究j_周幗萍純化培養(yǎng)基培養(yǎng)基分離純化平板培養(yǎng)基：酵母膏1g，葡萄糖1g，碳酸鈣2g,瓊脂2

7、g,水100mL,121滅菌20min，冷卻至70加入4mL無(wú)水乙醇和0.5mL0.02%結(jié)晶紫冰醋酸溶液。 挑取平板分離培養(yǎng)基中菌落長(zhǎng)勢(shì)良好，菌落分布均勻，透明圈大而清晰且個(gè)數(shù)適中的一個(gè)平板中的單菌落，進(jìn)行純化。參考文獻(xiàn)：高產(chǎn)醋酸菌的篩選及其形態(tài)生化特征研究j_張忠明 斜面保藏培養(yǎng)基1.斜面培養(yǎng)基1%酵母膏，1%葡萄糖，CaCO31.5%,瓊脂2%，pH5.5，分裝試管，加入95%無(wú)水乙醇4%(v/v)2.斜面保藏培養(yǎng)基1%酵母膏，1%葡萄糖，CaCO31%,瓊脂2%，pH4.5，分裝試管，加入95%無(wú)水乙醇2%(v/v)培養(yǎng)基要在121滅菌20min備用，選取菌落數(shù)在3050個(gè)左右的平板，

8、挑取該平板上的所有單菌落轉(zhuǎn)入斜面保藏培養(yǎng)基中，30 培養(yǎng)24 h 左右后保存于4 冰箱。參考文獻(xiàn)： 10基于固態(tài)培養(yǎng)基的醋酸菌擴(kuò)大培養(yǎng)研究j_郇阿梅定性定量1.菌株形態(tài)特征:鏡下細(xì)胞呈短桿狀,革蘭陰性,無(wú)芽胞,單個(gè)或成對(duì)、成鏈排列,個(gè)體大小為（0.50.7)m (1.01.5)m。2.培養(yǎng)特征:在葡萄糖、酵母膏、乙醇、CaCO3平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛,菌落圓形、油脂狀,表面光滑、凸起,邊緣整齊,培養(yǎng)2 d能產(chǎn)酸,使CaCO3溶解形成透明圈,繼續(xù)培養(yǎng)將乙酸氧化分解產(chǎn)生CO2 和水,菌落周圍出現(xiàn)白色透明圈。在斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,培養(yǎng)2 d后呈油脂狀,并產(chǎn)酸。在10% ( v / v)乙醇的培養(yǎng)基上

9、、Hoyer2Frateur培養(yǎng)液中、30%葡萄糖培養(yǎng)基上均不生長(zhǎng)。定性定量3.分別取在A1，A2，A3增殖培養(yǎng)基中,于32、轉(zhuǎn)速為120r/min的電熱氣浴搖床恒溫培養(yǎng)箱增殖培養(yǎng)了7d的培養(yǎng)液10ml,以轉(zhuǎn)速3000r/min離心,除去菌體,吸取5,ml無(wú)菌體的培養(yǎng)液,以10%濃度氫氧化鈉和0.1N氫氧化鈉中和至PH7.0,記錄各自消耗10%濃度氫氧化鈉和0.1N氫氧化鈉的毫升數(shù)。再將中和了的溶液煮沸,加入5%的氯化鐵溶液數(shù)滴,若形成紅褐色沉淀者確定有醋酸,并記錄開(kāi)始形成紅褐色沉淀時(shí),消耗氯化鐵溶液的滴數(shù),比較氫氧化鈉和氯化鐵溶液的消耗量,確定出最佳的增值培養(yǎng)基4.作出菌株生長(zhǎng)曲線.菌種保藏

10、先將要保藏的醋酸菌接入增殖培養(yǎng)基中，30攝氏度，150r/min搖床培養(yǎng)48h-72h，使其中的菌體濃度達(dá)到108個(gè)/ml左右，然后取上述培養(yǎng)液10ml于90ml液體菌種保藏液中，密封，30攝氏度靜止培養(yǎng)8h-12h后，置于4-10攝氏度冰箱中保藏。實(shí)習(xí)難點(diǎn)與關(guān)鍵點(diǎn)難點(diǎn)難點(diǎn)1.常規(guī)醋酸菌篩選培養(yǎng)基的粘度小，倒平板時(shí)起產(chǎn)酸指示劑作用的碳酸鈣容易沉淀到皿底，培養(yǎng)基上層碳酸鈣含量很低，而醋酸菌是好氧菌，生長(zhǎng)在培養(yǎng)基表面，所以較難觀察醋酸菌周圍的透明圈，這樣也就難以判斷各個(gè)菌株產(chǎn)酸的快慢和多少了。因此，培養(yǎng)基的優(yōu)化是一大難點(diǎn)。2.醋酸菌易變異，死亡，不易保存3.對(duì)葡萄酒種類的選用，因?yàn)樵谝恍┢咸丫浦写?/p>

11、酸菌不能生長(zhǎng)。4.葡萄酒在酸敗過(guò)程中通氣量的控制關(guān)鍵點(diǎn)關(guān)鍵點(diǎn)1、定性：產(chǎn)酸菌的菌種鑒定2、定量：產(chǎn)酸能力的確定，包括產(chǎn)酸多少與產(chǎn)酸快慢的測(cè)定3、采用固體培養(yǎng)基，因此溫度，水分活度，水分含量，溫度與傳熱性能，通氣與傳質(zhì)性能，pH值等為關(guān)鍵控制點(diǎn)。擬定進(jìn)程時(shí)間時(shí)間內(nèi)容內(nèi)容說(shuō)明說(shuō)明4月18日晚上實(shí)習(xí)開(kāi)題以PPT形式說(shuō)明4月24日-4月30日實(shí)習(xí)準(zhǔn)備材料采買，場(chǎng)地器材準(zhǔn)備5月1日-5月10日樣品準(zhǔn)備葡萄酒酸敗處理5月11日-5月13日樣品富集培養(yǎng)5月13日-5月15日菌種選育樣品稀釋培養(yǎng)，純化分離，斜面保藏5月16日-5月23日產(chǎn)品分析菌種定性定量分析5月23日中期匯報(bào)檢查5月24日-5月30日組內(nèi)匯

12、總實(shí)習(xí)問(wèn)題反饋，小組成員工作總結(jié)，實(shí)習(xí)總結(jié)報(bào)告6月28日實(shí)習(xí)總結(jié)PPT匯報(bào)答辯預(yù)期成果從酸敗葡萄酒中分離得到優(yōu)質(zhì)菌株，經(jīng)測(cè)定后為葡萄糖桿菌屬(GLuconobacter)的氧化葡萄糖桿菌，該菌株產(chǎn)算量高，產(chǎn)脂量高，發(fā)酵風(fēng)味理想，可以作為后來(lái)果醋的釀造。人員分工 成成員員分工分工楊艷玲楊艷玲馬嬌馬嬌劉占明劉占明陳卓陳卓孫盈盈孫盈盈富 集 培養(yǎng)純化打掃衛(wèi)生 定性定量分析材料的采買清 洗 儀器斜面保藏 稀釋分離 菌種保藏 樣品的準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備儀器儀器燒杯 量筒 大試管（帶塞） 小試管 濾紙錐形瓶（帶塞） 移液管 酒精燈 玻璃棒接菌環(huán) 接菌針 涂布棒 試管刷 電子分析天平 顯微鏡 移液槍 吹風(fēng)機(jī)載玻片 蓋玻片 計(jì)菌