發(fā)酵食品工藝學實習pptx

1、發(fā)酵食品工藝學實習醋酸菌菌種的選育食品科學與工程16-2成員：陳卓 楊艷玲 馬嬌 孫盈盈 劉占明實習背景葡萄酒的變酸是由于醋酸桿菌進行發(fā)酵消耗酒精而產(chǎn)酸造成的。而醋酸桿菌沒有芽孢，不能運動，兼有好氧型菌種和厭氧型菌種，在液體培養(yǎng)基的表面容易形成菌膜。在變酸的葡萄酒與氧接觸時，容器壁會形成一個可見的環(huán)。當我們將此環(huán)上的菌落接種，進行增殖培養(yǎng)后，可以分離出產(chǎn)酸菌。參考文獻1醋酸菌的分離與鑒定以及紅茶菌培養(yǎng)的研究j_王碩2醋酸菌菌種的冷凍干燥保藏研究j_邵偉3醋酸菌篩選培養(yǎng)基的優(yōu)化和優(yōu)良醋酸菌分離的研究j_周幗萍4醋酸菌優(yōu)良菌株的篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化j_姜曉芝5醋酸菌與其發(fā)酵的機理_j包啟安6高產(chǎn)醋酸菌

2、的篩選及其形態(tài)生化特征研究j_張忠明7果醋釀造用優(yōu)良菌種的選育及果醋飲料的研制j_侯愛香8河溪香醋優(yōu)勢醋酸菌篩選j_黃群9黑加侖果醋優(yōu)良菌種篩選及其發(fā)酵工藝研究j嚴寶冬10基于固態(tài)培養(yǎng)基的醋酸菌擴大培養(yǎng)研究j_郇阿梅11葡萄酒中醋酸菌的生長存活與氧濃度的關系j_于清琴12宋河大曲中醋酸菌的分離鑒定及產(chǎn)酸特性j_侯小歌實習內(nèi)容1.對實驗原料樣品進行預處理，使其酸敗，致使樣品菌繁殖2.將樣品菌種擴大培養(yǎng)。將樣品加入無菌試管，裝入無菌水，振蕩均勻后進行梯度稀釋，取各梯度的樣品稀釋液分別涂布于溴甲酚紫顯色平板，涂布完成后30倒置培養(yǎng)48h左右。3.根據(jù)菌落不同形態(tài)進行純化接種。選取菌落數(shù)在30-50個

3、左右的平板，挑取該平板上的所有菌落轉入常規(guī)基礎培養(yǎng)基4.對純化后的菌株進行產(chǎn)酸定性實驗。5.對產(chǎn)酸菌株進行產(chǎn)酸能力定量實驗。實驗流程樣品富集培養(yǎng)培養(yǎng)稀釋分離純化斜面保藏定性定量菌種保藏樣品準備葡萄酒1.買來新鮮葡萄酒，測定其PH值。選擇葡萄酒時，酒精濃度要低。（醋酸菌能夠將酒精氧化生成乙酸。因此，乙醇是醋酸菌一個很好的碳源，但當酒精濃度很高時就會抑制醋酸菌的生長。De Ley et al. (1984)指出，培養(yǎng)基中含有5乙醇，檢測到只有58醋桿菌生長；當培養(yǎng)基中乙醇為13時，醋酸菌含量會減少到13。其中，只有20巴士醋桿菌，沒有紋膜醋桿菌。只有5的葡糖桿菌屬能夠在含有5乙醇的培養(yǎng)基上生長。但

4、是，周所周知，醋酸菌在乙醇含量為10-14（v/v）的培養(yǎng)基上仍夠能存活甚至生長。Vaughn (1955)指出醋酸菌能夠忍耐的最大酒精濃度是14和15（v/v）2.將買來的葡萄酒敞口置于室溫下。（醋酸菌在完全通氣的葡萄酒中生長的數(shù)量達108cfulml,而在溶解氧含量較低時，它們的生長能力較弱。根據(jù)Holt et al. (1994)，醋桿菌和葡糖桿菌的最適生長溫度是25-30，在37就觀察不到葡糖醋桿菌的生長。De Ory et al.（1998) 發(fā)現(xiàn)紋膜醋桿菌生長所能忍受的最高溫度是35。）3.過一段時間測定葡萄酒的PH,若PH值下降，說明有醋酸菌產(chǎn)生。當PH值達到5.5-6.3時，就

5、可以進行下一步實驗。（醋酸菌在完全通氣的葡萄酒中生長, 產(chǎn)生大量的醋酸1.28-3.75g/L使其PH 下降。醋酸菌生長的最適pH是5.5-6.3(Holt et al., 1994)。）參考文獻：梁曼 葡萄酒與醋酸菌于清琴 葡萄酒中醋酸菌的生長存活與氧濃度的關系富集培養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)基增值培養(yǎng)基：酵母膏1%，葡萄糖1%，0.02%的結晶紫0.5%，制霉素5mg/mL,PH5.5,0.1Mpa滅菌30min,待冷卻到70是時加3%（V/V）的無水乙醇。富集培養(yǎng)：在無菌條件下，吸取10mL的葡萄酒樣，加入90mL增值培養(yǎng)基中，25-30恒溫培養(yǎng)4小時。參考文獻：周幗萍 醋酸菌篩選培養(yǎng)基的優(yōu)化和優(yōu)良醋

6、酸菌分離的研究稀釋分離培養(yǎng)基培養(yǎng)基平板分離培養(yǎng)基：酵母膏1%，葡萄糖1%，碳酸鈣2%（165干熱滅菌30min）,無水乙醇3%，瓊脂1.8%，PH值自然。各取1mL的增值培養(yǎng)液，加入裝有9mL的無菌生理鹽水的試管中，制成濃度梯度為10-1的菌懸液，然后逐步稀釋到10-5，10-6，10-7，濃度梯度，吸取后三個濃度梯度的稀釋液各200uL，用涂布法接種于分離培養(yǎng)基平板上，每個濃度梯度涂布2或3個平板，30恒溫培養(yǎng)4天，重復上述操作，直至平板出現(xiàn)單菌落。參考文獻 ：醋酸菌篩選培養(yǎng)基的優(yōu)化和優(yōu)良醋酸菌分離的研究j_周幗萍純化培養(yǎng)基培養(yǎng)基分離純化平板培養(yǎng)基：酵母膏1g，葡萄糖1g，碳酸鈣2g,瓊脂2

7、g,水100mL,121滅菌20min，冷卻至70加入4mL無水乙醇和0.5mL0.02%結晶紫冰醋酸溶液。 挑取平板分離培養(yǎng)基中菌落長勢良好，菌落分布均勻，透明圈大而清晰且個數(shù)適中的一個平板中的單菌落，進行純化。參考文獻：高產(chǎn)醋酸菌的篩選及其形態(tài)生化特征研究j_張忠明 斜面保藏培養(yǎng)基1.斜面培養(yǎng)基1%酵母膏，1%葡萄糖，CaCO31.5%,瓊脂2%，pH5.5，分裝試管，加入95%無水乙醇4%(v/v)2.斜面保藏培養(yǎng)基1%酵母膏，1%葡萄糖，CaCO31%,瓊脂2%，pH4.5，分裝試管，加入95%無水乙醇2%(v/v)培養(yǎng)基要在121滅菌20min備用，選取菌落數(shù)在3050個左右的平板，

8、挑取該平板上的所有單菌落轉入斜面保藏培養(yǎng)基中，30 培養(yǎng)24 h 左右后保存于4 冰箱。參考文獻： 10基于固態(tài)培養(yǎng)基的醋酸菌擴大培養(yǎng)研究j_郇阿梅定性定量1.菌株形態(tài)特征:鏡下細胞呈短桿狀,革蘭陰性,無芽胞,單個或成對、成鏈排列,個體大小為（0.50.7)m (1.01.5)m。2.培養(yǎng)特征:在葡萄糖、酵母膏、乙醇、CaCO3平板培養(yǎng)基上生長旺盛,菌落圓形、油脂狀,表面光滑、凸起,邊緣整齊,培養(yǎng)2 d能產(chǎn)酸,使CaCO3溶解形成透明圈,繼續(xù)培養(yǎng)將乙酸氧化分解產(chǎn)生CO2 和水,菌落周圍出現(xiàn)白色透明圈。在斜面培養(yǎng)基上生長良好,培養(yǎng)2 d后呈油脂狀,并產(chǎn)酸。在10% ( v / v)乙醇的培養(yǎng)基上

9、、Hoyer2Frateur培養(yǎng)液中、30%葡萄糖培養(yǎng)基上均不生長。定性定量3.分別取在A1，A2，A3增殖培養(yǎng)基中,于32、轉速為120r/min的電熱氣浴搖床恒溫培養(yǎng)箱增殖培養(yǎng)了7d的培養(yǎng)液10ml,以轉速3000r/min離心,除去菌體,吸取5,ml無菌體的培養(yǎng)液,以10%濃度氫氧化鈉和0.1N氫氧化鈉中和至PH7.0,記錄各自消耗10%濃度氫氧化鈉和0.1N氫氧化鈉的毫升數(shù)。再將中和了的溶液煮沸,加入5%的氯化鐵溶液數(shù)滴,若形成紅褐色沉淀者確定有醋酸,并記錄開始形成紅褐色沉淀時,消耗氯化鐵溶液的滴數(shù),比較氫氧化鈉和氯化鐵溶液的消耗量,確定出最佳的增值培養(yǎng)基4.作出菌株生長曲線.菌種保藏

10、先將要保藏的醋酸菌接入增殖培養(yǎng)基中，30攝氏度，150r/min搖床培養(yǎng)48h-72h，使其中的菌體濃度達到108個/ml左右，然后取上述培養(yǎng)液10ml于90ml液體菌種保藏液中，密封，30攝氏度靜止培養(yǎng)8h-12h后，置于4-10攝氏度冰箱中保藏。實習難點與關鍵點難點難點1.常規(guī)醋酸菌篩選培養(yǎng)基的粘度小，倒平板時起產(chǎn)酸指示劑作用的碳酸鈣容易沉淀到皿底，培養(yǎng)基上層碳酸鈣含量很低，而醋酸菌是好氧菌，生長在培養(yǎng)基表面，所以較難觀察醋酸菌周圍的透明圈，這樣也就難以判斷各個菌株產(chǎn)酸的快慢和多少了。因此，培養(yǎng)基的優(yōu)化是一大難點。2.醋酸菌易變異，死亡，不易保存3.對葡萄酒種類的選用，因為在一些葡萄酒中醋

11、酸菌不能生長。4.葡萄酒在酸敗過程中通氣量的控制關鍵點關鍵點1、定性：產(chǎn)酸菌的菌種鑒定2、定量：產(chǎn)酸能力的確定，包括產(chǎn)酸多少與產(chǎn)酸快慢的測定3、采用固體培養(yǎng)基，因此溫度，水分活度，水分含量，溫度與傳熱性能，通氣與傳質性能，pH值等為關鍵控制點。擬定進程時間時間內(nèi)容內(nèi)容說明說明4月18日晚上實習開題以PPT形式說明4月24日-4月30日實習準備材料采買，場地器材準備5月1日-5月10日樣品準備葡萄酒酸敗處理5月11日-5月13日樣品富集培養(yǎng)5月13日-5月15日菌種選育樣品稀釋培養(yǎng)，純化分離，斜面保藏5月16日-5月23日產(chǎn)品分析菌種定性定量分析5月23日中期匯報檢查5月24日-5月30日組內(nèi)匯

12、總實習問題反饋，小組成員工作總結，實習總結報告6月28日實習總結PPT匯報答辯預期成果從酸敗葡萄酒中分離得到優(yōu)質菌株，經(jīng)測定后為葡萄糖桿菌屬(GLuconobacter)的氧化葡萄糖桿菌，該菌株產(chǎn)算量高，產(chǎn)脂量高，發(fā)酵風味理想，可以作為后來果醋的釀造。人員分工 成成員員分工分工楊艷玲楊艷玲馬嬌馬嬌劉占明劉占明陳卓陳卓孫盈盈孫盈盈富 集 培養(yǎng)純化打掃衛(wèi)生 定性定量分析材料的采買清 洗 儀器斜面保藏 稀釋分離 菌種保藏 樣品的準備實驗準備儀器儀器燒杯 量筒 大試管（帶塞） 小試管 濾紙錐形瓶（帶塞） 移液管 酒精燈 玻璃棒接菌環(huán) 接菌針 涂布棒 試管刷 電子分析天平 顯微鏡 移液槍 吹風機載玻片 蓋玻片 計菌