外源基因轉(zhuǎn)移的細(xì)胞學(xué)方法和分子方法wdwhwn

1、小麥中外源基因轉(zhuǎn)移的細(xì)胞學(xué)方法和分子方法 首先可以通過(guò)引種解決本地區(qū)的蟲(chóng)害、環(huán)境脅迫造成產(chǎn)量下降的問(wèn)題。 其次選擇抗性好的品種做親本，與農(nóng)藝性狀較好的親本雜交，選擇農(nóng)藝性狀和抗性均較好的后代推廣。（品種間雜交，雜種優(yōu)勢(shì)利用） 遠(yuǎn)緣雜交（染色體工程） 誘變育種 生物技術(shù)育種：組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，細(xì)胞融合技術(shù)，外源DNA導(dǎo)入等。小麥抗病蟲(chóng)育種和抗環(huán)境脅迫育種的主要小麥抗病蟲(chóng)育種和抗環(huán)境脅迫育種的主要方法方法 要將野生親緣和潛在于更遠(yuǎn)緣物種的異源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到栽培小麥中可以用兩種主要方法：細(xì)胞遺傳學(xué)操縱（染色體工程) 和分子技術(shù) （遺傳工程)。外源基因?qū)胄←湹膬煞N方法外源基因?qū)胄←湹膬煞N方法 什

2、么是染色體工程？ 植物染色體工程的用途很廣, 其中最重要的是基因定位和異源基因的導(dǎo)入。用導(dǎo)入異源基因改良現(xiàn)有小麥品種是小麥育種的重要方向之一。 通過(guò)染色體工程有效地轉(zhuǎn)移外源基因, 并創(chuàng)造在育種中可利用的種質(zhì)材料, 大致經(jīng)過(guò)以下步驟: 種間或?qū)匍g雜交F1 或產(chǎn)生雙二倍體異附加系異代換系易位系。其中異附加系、異代換系和易位系統(tǒng)稱(chēng)為異染色體系, 易位系的育種利用價(jià)值最高。 雙二倍體是染色體工程中的重要基礎(chǔ)材料, 在其和小麥的回交后代中可以得到小麥的二體異附加系。二體異附加系是獲得代換系、端體附加系和易位系的基礎(chǔ), 易位系是把帶有目的基因的異源染色體片段整合到小麥染色體上的材料。整條染色體的細(xì)胞遺傳學(xué)

3、操縱整條染色體的細(xì)胞遺傳學(xué)操縱 附加系 細(xì)胞中添加異種染色體的系統(tǒng)稱(chēng)異附加系。培育此添加系統(tǒng)的方法多種多樣, 常規(guī)法、橋梁親本法、單倍體法、雙二倍回交法、雙重單體或多重單體附加法等均能創(chuàng)造異附加系。其中, 最常用的方法是獲得栽培物種與親緣物種間的雜種F1后, 用受體品種與F1 或由F1 加倍成的雙倍體回交一至數(shù)次, 從回交后代中選擇添加單體再經(jīng)自交產(chǎn)生添加二體。普通小麥（普通小麥（AABBDD） X 簇毛麥（簇毛麥（VV）2n=6x=42=21IIw 2n=2x=14=7IIv F1(ABDV) X 普通小麥（普通小麥（AABBDD） 2n=4x=28=21Iw+7Iv 2n=6x=42=21

4、IIw 回交，自交回交，自交 BCnFn 細(xì)胞學(xué)鑒定細(xì)胞學(xué)鑒定 21IIw+1II1v7v雜交回交法雜交回交法普通小麥（普通小麥（AABBDD） X 黑麥（黑麥（RR） 2n=4x=42=21IIw 2n=2x=14=7IIR F1(ABDR) 2n=4x=28=21Iw+7IR 不減數(shù)配子不減數(shù)配子 染色體加倍染色體加倍 雙二倍體雙二倍體 X 普通小麥普通小麥 （AABBDDRR） （AABBDD ）AABBDDR X 普通小麥普通小麥AABBDD 回交，自交回交，自交 21IIw+1II1R7R BCnFn 細(xì)胞學(xué)鑒定細(xì)胞學(xué)鑒定雙二倍體回交法圓錐小麥（圓錐小麥（AABB） X 簇毛麥（簇毛

5、麥（VV）2n=4x=28=14IIw2n=2x=14=7IIv F1(ABV) 2n=3x=31=14Iw+7Iv 不減數(shù)配子不減數(shù)配子 染色體加倍染色體加倍 雙二倍體雙二倍體 X 普通小麥普通小麥 （AABBVV） （AABBDD ）AABBDV X 普通小麥普通小麥AABBDD 回交，自交回交，自交 21IIw+1II1v7v BCnFn 細(xì)胞學(xué)鑒定細(xì)胞學(xué)鑒定橋梁親本法單倍體法 單倍體法有兩種，一種是花藥培養(yǎng)法，另一種是染色體消失法。 他們通過(guò)培養(yǎng)普通小麥與六倍體小黑麥、八倍體小偃麥的雜種1花藥，獲得了各種單倍體異附加系，加倍后從中選出了小麥雙體異附加系。 Barclay（1975）報(bào)道

6、了小麥分別與球莖大麥和玉米雜交，其后代中外源染色體自然消失的現(xiàn)象，并高頻率地獲得了小麥單倍體。李平路等（1998）首次將小麥玉米法應(yīng)用于小麥異附加系的選育中，用煙農(nóng)15-八倍體小濱麥、煙農(nóng)15-中間偃麥草的雜種后代分別與玉米雜交，成功地獲得了小麥-濱麥和小麥-中間偃麥草的單倍體異附加株。 某種植物的一對(duì)染色體被他種植物的一對(duì)染色體所代換而形成的新類(lèi)型稱(chēng)異代換系。 培育異代換系的方法也有不同幾種, 主要是利用單體或缺體與異附加系雜交進(jìn)行。代換系遠(yuǎn)緣雜種連續(xù)回交遠(yuǎn)緣雜種連續(xù)回交普通小麥（普通小麥（AABBDD） X 黑麥（黑麥（RR）2n=6x=42=21IIw 2n=2x=14=7IIR F1(

7、ABDR) X 普通小麥（普通小麥（AABBDD） 2n=4x=28=21Iw+7IR 2n=6x=42=21IIw 回交，自交回交，自交 BCnFn 細(xì)胞學(xué)鑒定細(xì)胞學(xué)鑒定 AABBDD-1A1A+1R1R AABBDD-7D7D+7R7R 單體單體1A X 二體附加系二體附加系(1R)2n=41=21IIw-1II1A+1I1A 2n=44=21IIw+1II1R F1 (2n=42=21IIw-1I1A+1I1R) (2n=43=21IIw+ 1I1R, 2n=42=21IIw-1I1A+1I1R) 選擇選擇2n=42的個(gè)體自交的個(gè)體自交 2n=42=21IIw-1II1A+1II1R單體

8、與附加二體雜交單體與附加二體雜交缺體缺體4D X 小偃麥八倍體小偃麥八倍體2n=41=21IIw-1II4D 2n=56=21IIw+7IIE F1 X 缺體缺體4D (2n=48=20IIw+7IE+1I4D) 2n=41=21IIw-1II4D BC1F1細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)篩選細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)篩選2n=41=21IIw-1I4D+1I4E自交自交 2n=42=21IIw-1II4D+1II4E缺體回交法缺體回交法異附加系和異代換系的鑒定1）染色體計(jì)數(shù)和染色體構(gòu)型分析2）染色體分帶：C-帶， N-帶3）生化標(biāo)記: 同工酶，蛋白質(zhì)4）分子標(biāo)記: RFLP, RAPD5）DNA分子原位雜交：GISH，

9、FISH6）形態(tài)標(biāo)記易位系 通過(guò)附加或代換異源染色體可以將有益基因引入栽培植物中, 但引入的染色體除攜帶有益基因外, 亦帶有不利基因。如能使異源染色體上攜帶的有益基因通過(guò)易位整合到栽培植物的染色體上, 就可以減少或消除不利基因的作用。這就需要建立易位系。所謂的易位系是指異源染色體與栽培植物染色體之間相互易位的植物。 在易位系中, 通過(guò)染色體易位達(dá)到了異源目的基因的轉(zhuǎn)移, 這便是建立易位系的動(dòng)機(jī)所在。 遠(yuǎn)緣雜交中經(jīng)常有自發(fā)易位產(chǎn)生, 但異種、屬間的染色體自然發(fā)生易位的頻率很低。實(shí)踐中, 易位系的建立就需人工誘發(fā)易位, 一般是用電離射線(xiàn)照射或化學(xué)誘變劑處理。輻射能使染色體隨機(jī)斷裂, 斷片常以各種不

10、同方式進(jìn)行重接, 產(chǎn)生各種染色體結(jié)構(gòu)變異, 導(dǎo)致易位。 小麥易位系的創(chuàng)建方法便是對(duì)攜有目標(biāo)基因的單體異附加系進(jìn)行輻射處理, 以這種基因的表型性狀為標(biāo)記, 在后代中選擇帶有這種基因而染色體數(shù)目仍為2n =42 的個(gè)體。因?yàn)槟康幕蛞艳D(zhuǎn)移到小麥染色體上, 這樣的個(gè)體就是易位系。易位系的鑒定 易位系一般來(lái)說(shuō)不發(fā)生染色體數(shù)目的變化, 因而它的鑒定要比鑒定異附加系和異代 換系困難得多。常規(guī)的染色體計(jì)數(shù)以及染色體帶型分析效果不佳, 特別是對(duì)不顯帶區(qū)段和小片段易位更是無(wú)能為力。目前, 一般采用同工酶分析或分子原位雜交技術(shù)對(duì)易位染色體進(jìn)行標(biāo)定。植物外源植物外源DNA的導(dǎo)入方法的導(dǎo)入方法 外源DNA的導(dǎo)入是指通

11、過(guò)某種特定的途徑將外源基因或外源DNA片段導(dǎo)入受體細(xì)胞，使之整合到受體細(xì)胞基因組中，而實(shí)現(xiàn)其功能表達(dá)的過(guò)程。 目前已經(jīng)建立了十多種外源DNA導(dǎo)入方法，按照技術(shù)屬性可將它們分為物理法、化學(xué)法、生物法： 1、物理法：基因槍法、電激法、微注射法、激光穿刺法、超聲波法、碳化硅纖維法等； 2、化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）法、磷酸鈣DNA共沉淀、脂質(zhì)體法等； 3、生物法：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法、浸漬法、病毒介導(dǎo)法等。 一、原理一、原理 農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，它們侵染植物后能誘發(fā)植物形成腫瘤。從一種致癌的農(nóng)桿菌中分離出了一種巨大質(zhì)粒（約200Kb），稱(chēng)為致癌質(zhì)粒，簡(jiǎn)稱(chēng)Ti質(zhì)粒。Ti質(zhì)粒上有一段D

12、NA被稱(chēng)為轉(zhuǎn)移DNA（簡(jiǎn)稱(chēng)TDNA），能轉(zhuǎn)移并整合到植物染色體上，其上攜帶的基因能在受體細(xì)胞中表達(dá)。Ti質(zhì)粒隨后被改造用作人工植物基因工程的載體。這種利用農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系，將外源目的基因或DNA片段插入Ti質(zhì)粒的TDNA中，并隨之導(dǎo)入受體植物細(xì)胞，而獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法，即為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。 第一節(jié)第一節(jié) 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法農(nóng)桿菌介導(dǎo)法nTi質(zhì)粒的必需組成元件，包括TDNA區(qū)域和致毒基因(Vir gene)nTDNA是Ti質(zhì)粒中唯一能夠與植物染色體整合的序列，而致病區(qū)中的一系列基因則起著輔助整合的作用。n與冠癭堿生成有關(guān)的是Vir區(qū)和T-DNA區(qū)，植物體內(nèi)不能合成冠癭堿，冠癭堿的合成為農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)

13、提供了必要的碳源和氮源。第二節(jié)第二節(jié) 基因槍法基因槍法基因槍法又稱(chēng)微彈轟擊法、粒子轟擊法、高速粒子噴射技術(shù)、彈道微靶點(diǎn)射擊，是一種借助高速金屬微粒將DNA分子引入活細(xì)胞的轉(zhuǎn)化技術(shù)。 原理原理 基因槍技術(shù)的基本原理是利用火藥爆炸、高壓放電或高壓氣體作驅(qū)動(dòng)力，將載有外源DNA的金（或鎢）粉等金屬微粒加速，射入受體細(xì)胞或組織，從而達(dá)到將外源DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞中的目的。 第三節(jié)第三節(jié) 聚乙二醇法聚乙二醇法 基本原理基本原理 聚乙二醇（PEG）是一種選擇性化學(xué)滲透劑，它可以使細(xì)胞膜之間或使DNA與細(xì)胞膜之間形成分子橋，促使相互間的接觸和粘連，并通過(guò)改變細(xì)胞膜表面的電荷，引起細(xì)胞膜透性變化，從而促進(jìn)外源大分子進(jìn)入原生質(zhì)體，因此稱(chēng)之為PEG誘導(dǎo)法。 第四節(jié)第四節(jié) 花粉管通道法花粉管通道法 一、基本原理一、基本原理 在受精及胚胎發(fā)育的初期是植物接受遠(yuǎn)緣