基因工程復習內(nèi)容整理

1、第二章 基因操作的主要原理1、核酸凝膠電泳的原理及分類？在生理條件下，核酸分子中的磷酸基團是離子化的，所以DNA和RNA實際上呈多聚陰離子狀態(tài)。將DNA、RNA放到電場中，它就會由負極正極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。分子量較小的DNA分子，比分子量較大的分子具有更緊密的構(gòu)型，所以其電泳遷移率也就比同等分子量的松散型的開環(huán)DNA分子或線性DNA分子要快些。分類：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、脈沖電場凝膠電泳。2、影響DNA遷移率的因素有那些？DNA分子量大??；DNA的構(gòu)象；凝膠的濃度。3、EB的作用原理。一種具扁平分子的核酸染料，可插入到DN

2、A或RNA分子的堿基之間。在300nm紫外燈照射下發(fā)射出熒光。4、核酸分子雜交所依據(jù)的原理是什么？有那幾種雜交方式？帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當它們混合在一起時，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。雜交方式有:DNA/DNA印跡雜交Southern Blotting；RNA/RNA印跡雜交Northern blotting；斑點印跡雜交和狹線印跡雜交；菌落或噬菌斑雜交。5、細菌轉(zhuǎn)化的技術(shù)方法。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、化學轉(zhuǎn)化法、電穿孔法。6、Sanger的雙脫氧鏈終止法的技術(shù)路線？利用了DNA聚合酶的兩種特性：第一，它能夠利用單鏈的DNA做模板，合成出準確的DNA互補鏈；第二，

3、DNA聚合酶能夠利用2,3-雙脫氧核苷酸做底物，使之參入到寡核苷酸連的3末端，從而終止鏈的生長。技術(shù)路線：見書7.化學修飾法的技術(shù)路線：見P71，參考技術(shù)圖8.PCR的原理：雙鏈DNA分子在高溫下解鏈成兩條單鏈DNA，然后DNA聚合酶在有一對寡核苷酸引物的存在的情況下，以單鏈DNA為模板利用反應(yīng)混合物中的dNTPs合成新生的DNA互補鏈。并且，每一條新生鏈上都具有了新的引物結(jié)合位點。然后反應(yīng)混合物再經(jīng)過上述過程，即可有合成新鏈。如此反復循環(huán)，即可實現(xiàn)特定區(qū)段DNA的迅速大量擴增。9.簡并引物：一類由多種寡核苷酸組成的混合物，彼此之間僅有一個或數(shù)個核苷酸的差異。Taq聚合酶：有5®3D

4、NA聚合酶活性；無3®5外切酶活性；最適聚合酶溫度72，連續(xù)保溫30min具有相當活力，選擇72延伸；變性溫度：95使其在整個擴增循環(huán)中保持足夠活性。Pfu聚合酶：耐熱；有5®3DNA聚合酶活性和35外切酶活性；精確度：pfu >Taq，但pfu擴增效率通常比Taq酶略差反向PCR：是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段，對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。10.盒式取代誘變的原理：利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒取代野生型基因中的相應(yīng)序列。這種寡核苷酸盒是由兩條合成的寡核苷酸組成的，當它們退火時，會按設(shè)計要求產(chǎn)生出需要的粘性

5、末端。Kunkel定點誘變： 將待突變的基因克隆入RF-M13 DNA載體上，導入具有dUTP酶（dut-）和N-尿嘧啶脫糖苷酶（ung-）雙缺陷的大腸桿菌（dut-，ung-）菌株中。 dUTP酶缺陷導致細胞內(nèi)dUTP水平上升，并在DNA復制時，部分取代dTTP進入DNA新生鏈中。又由于ung缺陷使摻入DNA的dUTP殘基不能除去。由這種大腸桿菌菌株產(chǎn)生的M13單鏈DNA大約有1%的T被U所取代，然后進行DNA定點誘變。 雙鏈DNA導入正常的大腸桿菌中，其尿嘧啶N-糖基化酶除去DNA鏈上的尿嘧啶堿基。結(jié)果原來的M13模板鏈被降解，只有突變鏈因不含U，被保留下來。這種方法產(chǎn)生的M13噬菌體中含

6、有突變DNA的比例大大增加。重組PCR定點誘變：詳見P9811.凝膠阻滯實驗原理：DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合后分子量變大，改變了遷移率，由此判斷DNA是否與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合。競爭DNA的作用：反應(yīng)體系中加入超量的非標記競爭DNA，用于研究DNA與蛋白質(zhì)作用的專一性。12.DNaseI印跡試驗原理：詳見P115，參考技術(shù)圖13.甲基化干擾試驗原理：根據(jù)DMS（硫酸二甲酯）能夠使G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理。第三章1、限制性內(nèi)切酶識別DNA的特點？什么是同裂酶，什么是同尾酶？型酶：分子量較大，反應(yīng)需Mg2+、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。 這類酶有特異的識別位

7、點但沒有特異的切割位點，而且切割是隨機的，所以在基因工程中應(yīng)用不大；型酶（狹義的限制性內(nèi)切酶）：分子量較?。?05 Da），只有一種多肽，通常以同源二聚體的形式存在。反應(yīng)只需Mg2+的存在，并且具有以下兩個特點，識別位點是一個回文對稱結(jié)構(gòu)，并且切割位點也在這一回文對稱結(jié)構(gòu)上。 許多型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重組。（1）基本特點在DNA雙鏈的特異性識別序列部位，切割DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂。兩個單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對的因此，斷裂的結(jié)果形成的DNA片斷，也往往具有互補的單鏈延伸末端。（2）識別順序和酶切位點 識別-8個相連的核苷酸

8、 對稱性 限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是5-P和3-OH （3）末端種類 3-端突起，個數(shù)為2或4個核苷酸 5-端突起，個數(shù)為2或4個核苷酸 平齊末端 非互補的粘性末端，切點在識別順序之外的型酶：這類酶可識別特定堿基順序，并在這一順序的3端2426bp處切開DNA，所以它的切割位點也是沒有特異性的。同裂酶：定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶特點： 識別相同順序，切割形成相同的末端 同尾酶：來源各異，識別的靶序列不同，但產(chǎn)生相同的粘性末端2、說明有哪些因素會影響內(nèi)切酶活力的？什么是星號活力？1）DNA的純度:污染的蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高濃度的鹽

9、離子等都有可能抑制核酸內(nèi)切酶活力。（2）DNA的甲基化程：基因克隆中采用失去甲基化酶的大腸桿菌菌株制備質(zhì)粒DNA。（3）酶切消化的反應(yīng)溫度大多數(shù)核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)溫度在37，有些酶例外。（4）DNA的分子結(jié)構(gòu)：DNA分子的不同結(jié)構(gòu)對核酸內(nèi)切酶的活性有很大影響（5）核酸內(nèi)切酶的緩沖液（-20保存）主要成分： 氯化鎂、氯化鈉、氯化鉀，Tris-HCl，-巰基乙醇，二硫蘇糖醇（DTT）Mg2：酶發(fā)揮活性必需，不正確的Mg2和NaCl會影響對特異序列的識別。Tris-HCl：保證酶反應(yīng)的pH，一般在pH 7.4條件下功能最佳巰基乙醇：保持某些酶的穩(wěn)定性；甘油的影響（星號活性）例：EcoR在正常情況下識別

10、GAATTC，但是如果甘油濃度超過5（V/V），識別序列發(fā)生變化，可在AATT或PuPuATPyPy序列處發(fā)生切割。3、試舉例說明什么是同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法？見書上圖。4、什么是Klenow片段，如何進行DNA末端標記？Klenow片段:由大腸桿菌DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產(chǎn)生出來的分子量為76×103dal的大片段分子。仍具有53的聚合酶活性和35 的外切酶活性，失去了全酶的53外切酶活性。 具有 3隱蔽末端的帶標記得的DNA片斷 5GATCT3 3 A5 在反應(yīng)物中加入Klenow聚合酶-32p-dGTP，一道溫育后生成： 5GATCT3 3 *GA5

11、 或是同時加入-32p-dATP dGTP 5GATCT3 3 *AGA55、T4 DNA取代合成法標記DNA的方法n 在反應(yīng)過程中，通過T4 DNA聚合作用，反應(yīng)物中的-32p-dNTP逐漸地取代了被外切活性刪除掉的DNA片段上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。n 3外切酶活力可以切割ds DNA和ss DNA，ds DNA>ss DNA，要控制降解時間。（圖見書上）6、反轉(zhuǎn)錄酶的作用方式n 鏈具有聚合酶活性和RNase H活性n 鏈具有以RNA-DNA雜交分子為底物的53脫氧核酸外切酶活性7、T7 DNA聚合酶的特點n 1978年，S. Tabor從感染了T7噬菌體的大腸桿菌寄主細胞中

12、純化出來的一種核酸酶。n 加工形式的T7 DNA聚合酶系：T7噬菌體編碼的基因5蛋白質(zhì)，另一種是大腸桿菌編碼的硫氧還蛋白。n 基因5蛋白質(zhì)：具有聚合酶活性和35外切酶活性；硫氧還蛋白：增強基因5蛋白質(zhì)與模板引物的結(jié)合力n 具有53的聚合酶活性和很高的單鏈及雙鏈的3 5核酸外切酶活性。8、DNA末端轉(zhuǎn)移酶的特點n 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，從小牛胸腺中純化出來的一種小分子量的堿性蛋白質(zhì)，在二甲胂酸緩沖液中，能催化脫氧核苷三磷酸進行53方向的聚合作用，逐個地將脫氧核苷酸分子加到線性DNA分子的3-OH末端。n 不需要模板，可以用含有的3-OH DNA片段為引物，在3-OH端加入核苷酸達幾百個。 n 它

13、作用的底物可以是具有3-OH末端的單鏈DNA，也可以是具有3-OH突出末端的雙鏈DNA，平末端不是有效底物，如果用Co代替Mg做為輔助因子，可以成為有效底物。 9、堿性磷酸酶的作用n 來自于大腸桿菌或小牛腸，該酶用于脫去DNA（RNA）5末端的磷酸基團，使5-P成為5-OH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。當需要5端同位素標記或為了避免DNA片段自身連接（或環(huán)化）時可進行脫磷酸反應(yīng)。 10、T4多核苷酸激酶特點T4多核苷酸激酶：由T4噬菌體的pseT基因編碼的一種蛋白質(zhì)，最初從T4噬菌體感染的E. coli中分離出來。n 作用：催化-磷酸從ATP分子轉(zhuǎn)移給DNA或者RNA的末端，不受底物分子鏈的

14、長短限制。n 正向反應(yīng)（forward reaction）堿性磷酸酶處理DNA的5端使其脫磷酸暴露出5-OH，多核苷酸激酶將-32P-ATP的-32P轉(zhuǎn)移到5-OH，實現(xiàn)末端標記。11、簡述一種核酸內(nèi)切酶和一種核酸外切酶的作用特點外切酶III（Exo III）ds DNA1、一般特點： 來自于E.coli，分子量28,000 kD 2、催化反應(yīng)類型 （1）外切酶活性：35，產(chǎn)生5-單磷酸核苷酸和具各種結(jié)構(gòu)的 ds-DNA，pH 7.6-8.5 , 外切酶活性特點 反應(yīng)底物：互補ds-DNA 堿基釋放速度：C>>AT>>G 反應(yīng)產(chǎn)物：5-單磷酸核苷和具缺口或5-端突起的d

15、s-DNA，過渡反應(yīng)將導致DNA降解（2）核酸酶H活性：除去DNA-RNA雜交分子中的RNA分子，pH 7.6-8.5（3）3-磷酸酶活性：除去3-磷酸基后形成3-OH端，有利于DNA聚合酶反應(yīng)，pH 6.8-7.4 （4）內(nèi)切酶活性：在無嘌呤或無嘧啶處將DNA鍵切開，pH 7.6-8.5 內(nèi)切酶見第一題。第4章 基因克隆的質(zhì)粒載體1. 什么是載體（vector）？答：載體（vector）是由在細胞中能夠自主復制的DNA分子構(gòu)成的一種遺傳成分，通過實驗手段可使其它的DNA片段連接在它的上面，進行復制。2、 作為基因工程的載體，必須具備哪些性能？質(zhì)粒載體必須具備的基本條件是什么？答：作為基因工程

16、的載體，必須具備以下性能：1、分子較小，可攜帶比較大的DNA片段。 2、能獨立于染色體而進行自主復制并且是高效的復制。 3、要有盡可能多種限制酶的 切割位點，但每一種限制酶又要最少的切割位點（多克隆位點 multiple cloning sites，MCS） 。 4、有適合的標記，易于選擇。 5、有時還要求載體要能啟動外源基因進行轉(zhuǎn)錄及表達，并且盡可能是高效的表達。 6、從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實驗室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復制等等。 質(zhì)粒載體必須具備的基本條件是： 1、具有至少一個復制起點； 2、具有抗菌素抗性，以便為寄主細胞提供易于檢測的表型性狀做為選擇信號，而且在有關(guān)的

17、限制酶位點上插入外源DNA后形成的質(zhì)粒有一個選擇標記； 3、具有若干限制酶切單一位點（MCS）； 4、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)，低分子量的質(zhì)粒易于操作，克隆外源片斷后（不超過15kb）仍能有效的轉(zhuǎn)化給受體細胞同時低分子量的質(zhì)粒對限制酶具有多重識別位點的幾率也較低；較高的拷貝數(shù)可獲得大量的克隆基因。3、 氯化銫密度梯度離心的原理是什么？答：1、質(zhì)粒DNA占總DNA的1%2%； 2、在細胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細菌染色體易斷裂成線性片斷，而質(zhì)粒DNA分子量小，結(jié)構(gòu)緊密仍保持完整的狀態(tài)；染色劑溴化乙錠（EB）能摻入到DNA鏈的堿基中，導致鏈的解旋；而且形成的EB-DNA復合物中，E

18、B含量越高，密度會越低。3、 堿裂解法的原理是什么？解釋其中相關(guān)試劑的作用？答：堿裂解法的原理： 1、共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片斷在拓撲學上存在差異； 2、pH值在12.012.5范圍內(nèi)時，線性的DNA會被變性而共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會被變性； 3、在冷卻或恢復中性pH值使DNA復性的過程中，線性染色體會形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準確迅速復性，通過離心法去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，用乙醇沉淀，便可以獲得質(zhì)粒DNA。相關(guān)試劑的作用： 葡萄糖：有利于PH的調(diào)節(jié)。 T ris-HCl ：緩沖液，調(diào)節(jié)PH。 EDTA：二價金屬離子的少量存在，抑制核酸酶的活性

19、，從而保護質(zhì)粒DNA免被降解。 NaOH：提供高的PH環(huán)境，使線性缺口的質(zhì)粒DNA和線性的染色體DNA片段被選擇性地變性。 SDS：使細胞裂解，釋放出質(zhì)粒及染色體的DNA。 醋酸鈉：降低反應(yīng)混合物的PH值，起到了中和作用，使現(xiàn)行的質(zhì)粒及染色體DNA復性，并聚集成不可溶的網(wǎng)絡(luò)聚合物；同時，高濃度的醋酸鈉亦會引起蛋白質(zhì)-SDS復合物和高分子量的RNA分子發(fā)生沉淀。 苯酚：抽提去除蛋白質(zhì)污染物。 乙醇：沉淀并收集質(zhì)粒DNA。5、表達型的質(zhì)粒載體有什么特點？體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體和穿梭質(zhì)粒載體各有什么特點？答：表達性的質(zhì)粒載體的特點：待表達的真核基因編碼序列被克隆在緊挨于啟動子下游的多克隆位點上，

20、而且必須是其編碼的蛋白質(zhì)氨基末端這一頭靠近啟動子方向插入，才能在啟動子控制下進行有效的轉(zhuǎn)錄。體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體的特點：在pUC質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，有來自噬菌體的啟動子，即T7啟動子和SP6啟動子，為RNA聚合酶的附著作用提供特異的識別位點。穿梭質(zhì)粒載體的特點：具有兩種不同復制起點和選擇記號，可在兩種不同的寄主細胞存活和復制。6、ColE 1質(zhì)粒載體有什么特點？答：ColE 1質(zhì)粒載體的特點如下：多拷貝的質(zhì)粒，能產(chǎn)生細菌素，但含有對細菌素的免疫基因，在其分子結(jié)構(gòu)上對核酸內(nèi)切限制酶EcoR I也只存在有一個識別位點，這種質(zhì)粒除了編碼有大腸桿菌E1基因之外，為了其自身存活的需要，還編碼有使寄主

21、細胞具有對大腸桿菌素E1免疫性的基因。7、pBR322質(zhì)粒載體有什么特點？答：pBR322質(zhì)粒載體的特點如下：（1）具有較小的分子量：它的分子量為4363bp?？寺≥d體的分子量大小不要超過10kb。（2）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。（pBR322 DNA分子中總共有24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識別位點。其中7種內(nèi)切酶的識別位點在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2種識別位點在于這個基因的啟動區(qū)內(nèi)，所以9個限制酶切位點插入外源片斷可以導致tetr基因的失活；另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識別位點。）（3）具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴增之后每個細胞中可積累1000300

22、0個拷貝。8、pUC質(zhì)粒載體有什么特點？答：pUC質(zhì)粒載體的特點如下：第一：具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù)： 僅保留了pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復制起點；在操作過程中復制起點內(nèi)部發(fā)生了自發(fā)突變造成了基因rop的缺失，它是控制質(zhì)粒的特殊因子，從而使拷貝數(shù)增加，平均每個細胞500700個拷貝。第二：適用于組織化學檢測重組體： 具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ基因，所編碼的-肽鏈可參與-互補作用，用X-gal顯色對重組子進行鑒定，而pBR322質(zhì)粒的重組子要進行兩步的選擇。（補充：藍白篩選：lacZ基因編碼-半乳糖苷酶的肽鏈，即其N端，可以與宿主細胞中的C端互補形成完整的-半乳糖苷酶互

23、補作用，-半乳糖苷酶可以在X-gal和IPTG的作用下產(chǎn)生藍色物質(zhì)，形成藍色菌落）第三：具有多克隆位點MCS區(qū)段 方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。第五章 噬菌體載體和柯斯載體一、舉例說明噬菌體載體的載體類型。其中cos位點的作用是什么？ 噬菌體載體的主要類型1、插入式載體n 一種只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點的 派生載體。只能插入較小分子量的外源（10kb），廣泛用于cDNA及小片段DNA的克隆n cI基因插入失活 如gt10、NM1149等載體，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位點。外源基因插入后將導致cI基因的失活。cI基因失活后將導致噬菌體不能溶源化，產(chǎn)生

24、清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。 n Lac Z基因插入失活：如charon16A，gt 11載體，在非必需區(qū)段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR位點，插入失活后利用X-gal法篩選（蘭白篩選）。2、替換型載體（取代型載體）n 具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的DNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。可以克隆較大分子量的外源，克隆高等真核生物DNAn Charon 4A載體是用Lac 5（乳糖操縱子的大部分系列，包括完整的Lac Z）替換入噬菌體的中間區(qū)段，同時將Lac 5作為選擇標記.使用時用EcoRI水解，去掉中間的片段，再與欲克隆片段在體外進行重組、包裝。而后

25、，感染E.coli使之在E.coli內(nèi)繁殖，并裂解E.coli，形成空斑n NM781:在NM781替換型載體中，可取代的EcoR片段，編碼有一個supE基因（大腸桿菌突變體tRNA基因），這種NM781噬菌體感染細胞后，寄主細胞lacZ基因的琥珀突變被抑制，因此能在X-gal瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出藍色的噬菌斑。如果這個具有supE基因的EcoR片段被外源DNA取代了，那么所形成的重組體噬菌體，在上述指示培養(yǎng)基上只能產(chǎn)生出無色的噬菌斑3.凱倫噬菌體載體 在噬菌體基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，既有插入型又有替換型；在基因工程實驗中的用途十分廣泛 承受外源DNA的能力：幾個kb到23kb cos位點的兩個作用：(

26、1)使進入細菌的DNA分子成為環(huán)狀 ，這是插入細菌基因組的先決條件。(2)作為識別位點，由內(nèi)切酶將滾環(huán)復制的多聯(lián)體DNA切開二、簡述重組體DNA的體外包裝過程，并說明可容納外源基因的大小？ 1.重組體DNA的體外包裝：在A蛋白（有終止復制功能），E蛋白（是包裝蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重組體DNA轉(zhuǎn)入頭部。在體外試管中完成上述反應(yīng)，利用D基因突變和E基因突變。n E基因琥珀突變（Eam）不能形成任何頭部，積累大量的尾部n D基因琥珀突變（Dam），重組體DNA不能進入頭部，成熟作用在頭部前體階段被終止，因而它感染的宿主中有大量頭部前體蛋白積累。n 使用具有c857突變基因的噬菌體

27、的溶源大腸桿菌：BHB2690（Dam）和BHB2685（Eam）菌株培養(yǎng)獲得頭部和尾部n c857是溫度敏感性阻遏基因，32為溶源狀態(tài)，4445誘發(fā)，溶菌的S基因突變，因而不會溶菌。n 大量收集頭部尾部蛋白，在體外與重組DNA包裝2.由于噬菌體包裝時，當DNA的長度短于野生型的75%或超過105%時，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生型DNA（48KB）的75%105%左右的，要求載體DNA和外源DNA長度上限是51kb，必需基因為28kb，外源極限在23kb。三. 柯斯質(zhì)粒載體的特點1、具有噬菌體的特性； 插入合適長度外源基因后，可以在體外被包裝成噬菌體，可以高效的感染大腸桿菌，進

28、入細胞后環(huán)化，并且不形成子代噬菌體2、具有質(zhì)粒載體的特性； 含有質(zhì)粒復制子，進入寄主后可以象質(zhì)粒一樣復制， 抗菌素抗性標記可以進行篩選 3、具有較高容量的克隆能力； 分子量較小，一般4-6kb，因此插入的載體上并且可以被成功包裝的外源可以達到45kb 最低極限，如果柯斯質(zhì)粒有5kb，外源必需要至少30kb 4、具有與同源性序列的質(zhì)粒進行重組的能力 在同一個宿主中的柯斯質(zhì)粒和質(zhì)粒會形成共合體。 四. M13載體系列的優(yōu)點1、在這類載體的基因組中有一條飾變的-半乳糖苷酶基因片段（Hind片段），其中插入了一段具有密集的多克隆位點的序列；2、M13載體系列是應(yīng)用基因工程技術(shù)成對地構(gòu)建的，可有效地克隆

29、雙鏈DNA分子中的每一條鏈。 (1)具有多克隆位點(MCS)，方便克隆。 (2)許多M13載體的多克隆位點與質(zhì)粒載體pUC序列的多克隆位點是相同的，在克隆位點選擇上更為方便。3、可以定向地克隆DNA片段 克隆在M13 RF DNA分子上的雙鏈DNA片段，到了子代噬菌體便成了單鏈的形式。所以如果要同時分離分子中的雙鏈，則需要兩種獨立的克隆。根據(jù)M13的生物學特性知道，M13子代噬菌體中總是只含有（）鏈，所以M13載體克隆的外源DNA片段在子代噬菌體中究竟是含有DNA分子中的哪條鏈，則完全取決于外源克隆時的取向。這樣一來，為分別分離外源分子的兩條鏈帶來一定的麻煩，解決這一問題的一個行之有效的方法就是定向克隆技術(shù)五. 噬菌粒載體的特點n 具有質(zhì)粒的復制起點、選擇性標記、多克隆位點等，方便DNA的操作，可在細胞內(nèi)穩(wěn)定存在；n 具有單鏈噬菌體的復制起點，在輔助噬菌體幫助下，可進行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。輔助噬菌粒載體特點