X射線晶體衍射技術(shù)

1、蛋白質(zhì)晶體蛋白質(zhì)晶體X-射線衍射儀射線衍射儀Protein X-ray diffractometer型號(hào)：R-AXISIV+X射線晶體衍射技術(shù)在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定中的應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)現(xiàn)代分子生物學(xué)現(xiàn)代分子生物學(xué)引言X-射線衍射法是測(cè)定蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的極其重要方法。生物大分子X(jué)射線晶體學(xué)是揭示分子結(jié)構(gòu)與功能的科學(xué)。目前還沒(méi)有一種工具能夠用它直接觀察到蛋白質(zhì)內(nèi)部的原子和基團(tuán)的排列。雖然電子顯微鏡接近于看到大分子的輪廓。但是仍然僅限于揭露分子的大小、形狀、對(duì)稱性和聚集狀態(tài)等。通過(guò)X-射線衍射法（X-ray diffraction method）可間接地研究蛋白質(zhì)晶體的空間結(jié)構(gòu)。對(duì)晶體結(jié)構(gòu)的研究將幫

2、助人們從原子的水平上了解物質(zhì)。 發(fā)展歷史 1895年，倫琴(Rontgen)發(fā)現(xiàn)了X-ray; 1913年布拉格父子用X射線衍射法對(duì)氯化鈉、氯化鉀晶體進(jìn)行了測(cè)定，指出晶體衍射圖可以確定晶體內(nèi)部的原子（或分子）間的距離和排列。因此獲諾貝爾獎(jiǎng)。1951年，加利福尼亞理工學(xué)院的泡令和科里提出，-構(gòu)型的多肽鏈呈螺旋形，通過(guò)X射線確定，組成蛋白質(zhì)的都是L-型氨基酸。 1953年克里克、沃森在X射線衍射資料的基礎(chǔ)上，提出了DNA三維結(jié)構(gòu)的模型。獲1962年生理或醫(yī)學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)。1959年佩魯茨和肯德魯對(duì)血紅蛋白和肌血蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，解決了三維空間結(jié)構(gòu),獲1962年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng).1959年有機(jī)化學(xué)家豪普特曼

3、和卡爾勒建立了測(cè)定晶體結(jié)構(gòu)的純數(shù)學(xué)理論，特別在研究生物大分子如激素、抗生素、蛋白質(zhì)及新型藥物分子結(jié)構(gòu)方面起到了重要作用。因此獲1985年化學(xué)獎(jiǎng)。 X射線衍射技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究方面起到了推動(dòng)作用X-射線結(jié)構(gòu)分析法（X-光衍射法）X-射線是波長(zhǎng)很短的電磁波，約0.1-100。結(jié)構(gòu)分析用的是單色X-射線，其波長(zhǎng)在1數(shù)量級(jí)，相當(dāng)于分子中原子之間的距離。用于結(jié)構(gòu)分析用的儀器是X-射線儀。由X-射線管、濾波器、高壓系統(tǒng)（30-50KV)、真空系統(tǒng)(10-4-10-5 mmHg柱）和照相機(jī)組成。工作原理：由X-射線管產(chǎn)生的各種波長(zhǎng)的X-射線，經(jīng)過(guò)濾波器（如鎳片等）得到一定波長(zhǎng)的單色X-射線。單色X-射線通

4、過(guò)晶體，產(chǎn)生衍射線，用照相機(jī)記錄下來(lái)，得到衍射圖，然后，通過(guò)對(duì)衍射斑點(diǎn)的位置與強(qiáng)度的測(cè)定與計(jì)算，并參照化學(xué)分析的結(jié)果，就可確定晶體結(jié)構(gòu)。即：光學(xué)-實(shí)像，通過(guò)FT轉(zhuǎn)變?；驹碛肵-射線衍射法測(cè)定晶體結(jié)構(gòu)是根據(jù)晶體中原子重復(fù)出現(xiàn)的周期性結(jié)構(gòu)。當(dāng)X-射線穿過(guò)晶體的原子平面層時(shí)，只要原子層的距離d與入射角的X-射線波長(zhǎng)、入射角之間的關(guān)系能滿足布拉格(Bragg)方程式： 2d sin=n( n =1,2,3,) 則反射波可以互相疊加而產(chǎn)生衍射，形成復(fù)雜的衍射圖譜。不同物質(zhì)的晶體形成各自獨(dú)特的X-射線衍射圖。根據(jù)記錄下來(lái)的衍射圖譜，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的數(shù)學(xué)處理，可推知晶體中原子的分布和分子的空間結(jié)構(gòu)。dd平行光

5、束原子層晶體的衍射X射線晶體結(jié)構(gòu)分析是利用晶體的X射線衍射現(xiàn)象來(lái)測(cè)定晶體及分子的結(jié)構(gòu)。而X射線衍射可簡(jiǎn)單理解為當(dāng)一束平行的X射線投射到晶體上時(shí)，大部分入射線穿過(guò)晶體沿原方向前進(jìn)，而部分射線卻偏離了入射方向。X射線源入射線晶體衍射線Protein Structure By X-RayCrystallographyObtain Crystals ;Expose Crystals to X-rays ;Measure intensity of Diffraction; Compute Electron density at every position in the crystal (x,y,z)

6、;Place poly-peptide chain into electron density. X射線晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定原理x射線是一種電磁波，能直線傳播，使膠片感光。在晶體結(jié)構(gòu)分析中應(yīng)用的X射線是波長(zhǎng)在o1nm左右的電磁波由于這一波長(zhǎng)與晶體內(nèi)原子間的距離具有同一數(shù)量級(jí)以及晶體結(jié)構(gòu)內(nèi)分子排列的規(guī)則性，當(dāng)X射線入射到晶體上時(shí)晶體中的每一個(gè)原子都發(fā)射出次生的x射線，并相互干涉，形成一個(gè)衍射花樣。如果將這個(gè)過(guò)程與光學(xué)顯微鏡成像相比較兩者有相似之處。在顯微鏡下，一束平行的可見(jiàn)光入射到一個(gè)物體上，物體散射入射光，物鏡會(huì)聚散射光而成像。對(duì)于x射線來(lái)說(shuō)，由于還沒(méi)有一種材料可作為聚焦鏡因此不可能直接會(huì)聚散射光而形

7、成物像，看到晶體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)。但是晶體的衍射花樣與晶體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系，即衍射花樣內(nèi)衍射點(diǎn)的排列方式、點(diǎn)間距離的大小與晶體內(nèi)生物大分子的排列方式和重復(fù)周期大小有關(guān)，而衍射點(diǎn)的強(qiáng)度分布與生物大分子結(jié)構(gòu)本身的特點(diǎn)有關(guān)。因此，我們可以通過(guò)分析衍射點(diǎn)的排列方式和測(cè)量點(diǎn)間距離的大小來(lái)推算分子在晶體結(jié)構(gòu)中的排列方式和重復(fù)周期的大小，以及通過(guò)測(cè)量衍射點(diǎn)的強(qiáng)度，應(yīng)用一系列數(shù)學(xué)方法，借助電子計(jì)算機(jī)可測(cè)定分子內(nèi)每個(gè)原于在空間的坐標(biāo)，從而測(cè)定整個(gè)分子的結(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)。晶體結(jié)構(gòu)的基本知識(shí)日常所見(jiàn)的許多晶體，如：氯化鈉（離子晶體）、金剛石（原子晶體）等，外形都是非常有規(guī)則的。無(wú)論是那一類晶體，組成晶體的微粒在空間的

8、三個(gè)方向上，都是周期性排列的。晶體的空間結(jié)構(gòu)是由一組為數(shù)無(wú)限的、相互平行的、情況相同的平面點(diǎn)陣所組成。每一個(gè)點(diǎn)陣所構(gòu)成的單元叫晶胞。知道了晶體的晶胞就等于知道了整個(gè)晶體的空間結(jié)構(gòu)。X-射線結(jié)構(gòu)分析的主要根據(jù)是衍射線的方向和強(qiáng)度，即衍射圖上斑點(diǎn)的位置與黑度。 衍射線方向：確定晶胞的大小和形狀； 衍射線強(qiáng)度：確定晶胞中的原子排列。測(cè)定步驟培養(yǎng)大的、質(zhì)量好的晶體；進(jìn)行初步的x射線衍射分析；重原子衍生物的制備；衍射數(shù)據(jù)的測(cè)量和處理；相位的計(jì)算；電子密度圖的計(jì)算和解釋；分子模型的修正。獲得好的晶體是結(jié)構(gòu)分析中最關(guān)鍵的一步由于球狀蛋白分子量較大，而且表面基團(tuán)的構(gòu)象較不穩(wěn)定，欲獲得排列有序的晶體是比較難的。

9、所形成的晶體不可能是完美的堆砌，在分子之間形成許多大的孔或通道。這些通道常常由占晶體體積一半以上的溶劑分子所占有，這些溶劑分子的絕大部分在晶體中又是無(wú)序的。晶體的蛋白質(zhì)分子之間僅有少量的區(qū)域發(fā)生接觸，這些區(qū)域的相互作用也是較弱的相互作用，通常是通過(guò)一個(gè)或幾個(gè)溶劑分子層發(fā)生作用。這也是為什么由X射線晶體學(xué)測(cè)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與在溶液中測(cè)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)幾乎相同的主要原因。欲獲得晶體，蛋白質(zhì)分子的純度和均一性是能否獲得完好結(jié)晶的關(guān)鍵之一。重組DNA技術(shù)在這方面是一個(gè)很重要的突破。由高效表達(dá)克隆基因獲得的蛋白質(zhì)能夠快速獲得純化，并且只需很少的純化步驟就能得到均一的樣品。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)蛋白質(zhì)樣品要想使其能結(jié)

10、晶，至少需要97%的均一性。生物大分子的晶體培養(yǎng)要求 要進(jìn)行x射線晶體結(jié)構(gòu)分析，首先要得到適合于結(jié)構(gòu)分析的晶體。這里所謂“適合于”包括兩層意思：晶體內(nèi)部結(jié)構(gòu)要具有有序性是單晶，不是孿晶，否則無(wú)法得到具有結(jié)構(gòu)本身特點(diǎn)的衍射花樣；晶體要有一定的大小和形狀。因?yàn)榫w衍射線的強(qiáng)度大體上正比于晶體的體積，而反比于分子量的大小。 一般講分子量為50000左右的蛋白質(zhì)分子，需要0.3 mm3或者更大的晶體，才有可能作高分辨率的結(jié)構(gòu)分析。對(duì)于分子量更大的蛋白質(zhì)分子，那就需要更大的晶體。為了滿足上述要求，首先要使生物大分子結(jié)晶，然后設(shè)法長(zhǎng)大。蛋白質(zhì)結(jié)晶過(guò)程是一個(gè)有序化過(guò)程蛋白質(zhì)晶體培養(yǎng)一般規(guī)律蛋白質(zhì)結(jié)晶過(guò)程像其

11、他小分子物質(zhì)一樣，是一個(gè)有序化過(guò)程，即在溶液中處于隨機(jī)狀態(tài)的分子轉(zhuǎn)變成有規(guī)則排列狀態(tài)的固體。一般認(rèn)為要使這種有序化過(guò)程開(kāi)始必須要形成一定大小的晶核，并使分子不斷地結(jié)合到形成的晶核上。而一個(gè)蛋白質(zhì)溶液能開(kāi)始形成晶核，就必須使溶液達(dá)到過(guò)飽和，并保持一定的條件，使溶液中的分子失去自由運(yùn)動(dòng)的能量(平移、旋轉(zhuǎn)等)而結(jié)合到晶核上，形成新的穩(wěn)定的化學(xué)鍵(次級(jí)鍵)，使整個(gè)體系能量降低而形成晶體。過(guò)飽和溶液蛋白質(zhì)結(jié)晶要點(diǎn)蛋白質(zhì)的分子量很高，幾何形狀較復(fù)雜，表面帶多種電荷；分子間相互作用或相互結(jié)合的點(diǎn)很多，而可能形成有序排列的關(guān)鍵結(jié)合點(diǎn)和幾何匹配位置又很少；在外界條件(如PH、溫度、不同溶劑等)的影響下，分子構(gòu)象

12、容易產(chǎn)生某些變化；在蛋白質(zhì)結(jié)晶時(shí)必須保持在水合狀態(tài)，或者在生理pH和溫度條件下。要使生物大分子結(jié)晶和生長(zhǎng)出大的晶體最關(guān)鍵的是控制過(guò)飽和度的量和速度過(guò)飽和度要低，而速度要盡可能地慢。蛋白質(zhì)結(jié)晶技術(shù)- 懸滴法該法適用于微量的篩選結(jié)晶條件。每個(gè)蛋白質(zhì)溶液的樣品只需5u1或者10ul，平衡液只需lml。每次實(shí)驗(yàn)可根據(jù)需要設(shè)計(jì)，如可先配制一系列不同濃度的沉淀劑溶液，作為平衡液，然后轉(zhuǎn)移到各個(gè)封閉小室內(nèi)，與含有低于平衡液50的沉淀劑的蛋白質(zhì)懸滴液擴(kuò)散平衡。最后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出一種沉淀劑濃度作為最佳結(jié)晶條件。具體實(shí)驗(yàn)可采用16孔的塑料組織培養(yǎng)盒進(jìn)行、每個(gè)孔內(nèi)加入一定量的平衡液：每一個(gè)蛋白質(zhì)母液懸滴加在預(yù)先

13、硅化好的蓋玻片上，然后把蓋玻片倒蓋在小池上。為防止蒸發(fā)擴(kuò)散時(shí)漏汽，必須在蓋玻片與池邊緣間加少量凡士林密封。蓋片懸滴平衡液Hanging Droplet Method for Protein Crystallization 蛋白質(zhì)結(jié)晶技術(shù)-坐滴法坐滴法原理與懸滴法相同，不同之處僅為液滴體積增大，如50ul或更大。這種方法較易生長(zhǎng)出大的晶體，重復(fù)性較好，但是蛋白質(zhì)用量較大，適合于巳大體知道結(jié)晶條件，或者有足夠量的樣品可供使用。其缺點(diǎn)是晶體有時(shí)貼在容器底部而不易取出導(dǎo)致?lián)p壞晶體。蓋片蛋白質(zhì)溶液平衡液蛋白質(zhì)結(jié)晶技術(shù)-平衡透析微量擴(kuò)散小室法利用半透膜允許小分子透過(guò)而不允許大分子透過(guò)的性質(zhì)，來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶

14、液的離子強(qiáng)度或pH值，使蛋白質(zhì)溶液慢慢地接近過(guò)飽和度。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是：通過(guò)有控制的擴(kuò)散，改變結(jié)晶的條件，從而慢慢地到達(dá)晶核形成點(diǎn)。晶體的生長(zhǎng)亦可不斷地調(diào)整、已經(jīng)產(chǎn)生的沉淀或者微晶可通過(guò)外部條件的改變重新溶解。這種方法可以在低離子強(qiáng)度條件下應(yīng)用傳統(tǒng)的鹽析方法結(jié)晶，它既適用于大批量的結(jié)晶，亦可應(yīng)用于微量的結(jié)晶。較普遍使用的微量擴(kuò)散小室是用有機(jī)玻璃加工而成的、小室直徑23mm，高45mm。蛋白質(zhì)母液加在小室內(nèi)，上端封一半透膜，然后把小室放到相應(yīng)的平衡透析液內(nèi)。蛋白質(zhì)母液內(nèi)的條件通過(guò)半透膜與外部溶液平衡透析而改變。平衡液小室蛋白質(zhì)溶液橡皮環(huán)透析膜在蛋白質(zhì)晶體中可能出現(xiàn)的11種對(duì)稱類型表示在紙面上方表

15、示在紙面下方生物大分子的晶體特征 氨基酸、核苷酸、單糖的分子能以有序的晶體型式存在，并以氫鍵為特征，晶胞的大小一般為o5-2nm。這些簡(jiǎn)單的分子中的原子數(shù)目可達(dá)l02，它們是幾乎所有生物結(jié)構(gòu)的建造單元。目前。已經(jīng)測(cè)定了所有這些分子以及大量的衍生物的晶體結(jié)構(gòu)。 肽、類固醇、激素、維生素以及脂類等的一個(gè)分子中所含的原子數(shù)可達(dá)102-103從生物學(xué)的觀點(diǎn)看仍是很小的分子。但對(duì)于x射線晶體學(xué)來(lái)說(shuō)，已經(jīng)是非常復(fù)雜的了。這些分子在體內(nèi)的生物學(xué)過(guò)程的控制方面通常起著重要的作用。它們能以晶體或液晶等有序性型式存在，已經(jīng)得到了一些關(guān)于這些分子和它們的晶體結(jié)構(gòu)的資料。其晶胞大小為l-3nm。 纖維狀蛋白質(zhì)、球狀蛋

16、白質(zhì)、核酸和多糖等生物大分子的一個(gè)分子中或一個(gè)亞基中含有的原子數(shù)目可達(dá)102一105。這些生物大分子是現(xiàn)代晶體學(xué)研究最活躍的領(lǐng)域。它們能以纖維結(jié)構(gòu)、層狀結(jié)構(gòu)或晶體型式存在，晶胞的大小或鏈的周期一般可從幾個(gè)-20nm。 生物膜、核蛋白、染色體、核糖體及病毒等是更為復(fù)雜的生物學(xué)對(duì)象。它們是由大量生物分子如蛋白質(zhì)、核酸、脂類或糖類等結(jié)合或組裝而成的。在一個(gè)分子或一個(gè)亞基中的原子的數(shù)目可達(dá)102一108。它們能以纖維狀結(jié)構(gòu)、層狀結(jié)構(gòu)或晶體等有序性的型式存在晶胞的大小或鏈的周期可從幾個(gè)-幾十甚至幾百nm。生物大分子晶體衍射數(shù)據(jù)的收集和處理收集數(shù)據(jù)的方法和儀器設(shè)備也是多樣的，它們各有其自身的特點(diǎn)。因此，根

17、據(jù)不同的對(duì)象和要達(dá)到的目標(biāo)采用不同的數(shù)據(jù)收集方法，能達(dá)到事半功倍的效果。一般晶胞較小的，邊長(zhǎng)為幾納米的晶體用衍射儀收集數(shù)據(jù)為好，晶胞較長(zhǎng)超過(guò)10納米的或晶體壽命短的用照相底片法為好。為了測(cè)定出貢獻(xiàn)于衍射的每個(gè)原子的位置，需要知道每個(gè)衍射點(diǎn)的三個(gè)參數(shù)：波長(zhǎng)、振幅和衍射相位。波長(zhǎng)是由X射線光源性質(zhì)所決定的，結(jié)構(gòu)振幅可由所測(cè)量到的衍射強(qiáng)度求得。但相位則X射線衍射實(shí)驗(yàn)中被丟失了，這就是X射線晶體學(xué)中所謂的相位問(wèn)題。小分子晶體的相位問(wèn)題是通過(guò)一種叫做“直接法”的方法來(lái)解決的。對(duì)于生物大分子來(lái)說(shuō)，因?yàn)樯锎蠓肿泳w的衍射能力弱，衍射分辨率低，而且分子量很大，相應(yīng)的晶胞參數(shù)也大，衍射點(diǎn)的數(shù)目多，直接法不太適

18、用。解決生物大分子晶體衍射相位問(wèn)題的方法要比小分子晶體復(fù)雜和困難得多，常用的方法有多對(duì)同晶置換法、分子置換法、多波長(zhǎng)反常衍射法等。a ribbon representation of Klebsiella pneumoniae nitrogenase component 1 Protein Crystallization and X-ray diffraction X射線衍射技術(shù)在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定：1959年佩魯茨和肯德魯對(duì)血紅蛋白和肌血蛋白進(jìn)行了X射線衍射分析，解決了血紅蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)。 血紅蛋白的空間結(jié)構(gòu) 血紅蛋白的X射線衍射圖X射線衍射技術(shù)在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用 有些蛋

19、白質(zhì)像纖維素或尼龍一樣，既具有纖維狀又具有晶體狀：例如，絲心蛋白、角蛋白（毛發(fā)和皮膚里的蛋白質(zhì)）和膠原蛋白（腱和結(jié)締組織中的蛋白質(zhì)）。德國(guó)物理學(xué)家赫佐格通過(guò)顯示這些物質(zhì)能夠衍射X射線，從而證明了它們的結(jié)晶度。另一位德國(guó)物理學(xué)家布里爾分析了衍射圖，從而確定了多肽鏈中原子的間距。英國(guó)生物化學(xué)家阿斯特伯里等人利用X射線衍射進(jìn)一步了解了多肽鏈的結(jié)構(gòu)。精確地計(jì)算出相鄰原子之間的距離和相鄰的鍵所成的角度。認(rèn)為：絲心蛋白的鏈?zhǔn)峭耆煺沟?，即這些原子間鍵的角度能夠使它們幾乎排列在一條直線上。 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測(cè)定根據(jù)蛋白質(zhì)的狀態(tài)，測(cè)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的方法分為兩大類：（1）應(yīng)用X射線晶體衍射圖譜法（X-ray c

20、rystallography）和中子衍射法測(cè)定晶體中的蛋白質(zhì)分子構(gòu)象；（2）應(yīng)用核磁共振法（nuclear magnetic resonance，NMR）、園二色性光譜法、激光拉曼光譜法、熒光光譜法、紫外差光譜法和氫同位素交換法等測(cè)定溶液中的蛋白質(zhì)構(gòu)象。利用X射線晶體衍射法測(cè)定蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，結(jié)果比較可靠。但是，與溶液中的構(gòu)象相比，蛋白質(zhì)分子在晶體中的構(gòu)象是靜態(tài)的。所以，利用蛋白質(zhì)晶體不能測(cè)定不穩(wěn)定的過(guò)渡態(tài)的構(gòu)象。而且，很多蛋白質(zhì)很難結(jié)晶，或者很難得到用于結(jié)構(gòu)分析的足夠大的單晶。另外，X射線晶體衍射的工作流程較長(zhǎng)。X射線衍射技術(shù)在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用 用X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)分析法研究重要生物活性大分子的三維結(jié)構(gòu)、分子識(shí)別和作用機(jī)理，屬于新興的化學(xué)、生物和物理的交叉學(xué)科，屬于結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域，是當(dāng)代生命科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)一個(gè)分重要的分支，而X射線晶體結(jié)構(gòu)分析是結(jié)構(gòu)生物學(xué)最主要的研究手段。如：研究核糖體失活蛋白（RNA N-糖苷酶）系列，包括天花粉蛋白及其與一系列底物類似物的復(fù)合物以及b -苦瓜子蛋白等和甲醇脫氫酶系列：包括從三種不同細(xì)菌提取的甲醇脫氫酶，這是我國(guó)在國(guó)際上首次測(cè)定含新型輔基PQQ的酶的三維結(jié)構(gòu)。 甲醇脫氫酶H亞基的三維結(jié)構(gòu)飄帶圖 天花粉蛋白-NADPH復(fù)合物的結(jié)構(gòu) High-Throughput Crystallo