甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶基因的煙草轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

1、甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶基因的煙草轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定摘要：本工作利用已構(gòu)建的pET(CmPP)質(zhì)粒為模板，再擴(kuò)增甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶基因CmPP，然后通過(guò)酶切克隆到質(zhì)粒pBI121中，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI121(CmPP)，并將其轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。通過(guò)農(nóng)桿菌侵染的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法和多重PCR鑒定，獲得了陽(yáng)性CmPP轉(zhuǎn)基因煙草植株。關(guān)鍵詞：甲基戊糖梭菌，膜整合焦磷酸酶，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因煙草Tobacco transformation of the membrane-integral pyrophosphatase gene of Clostridium methylp

2、entosum and identification of the transgenic tobacco plantsAbstract: In this work, using the constructed plasmid pET(CmPP) as DNA template, the membrane-integral pyrophosphatase gene CmPP of Clostridium methylpentosum was re-amplified, and subcloned into the plasmid pBI121 by enzyme digestion to cre

3、ate the plant expression vector pBI121(CmPP) that was further transformed into the Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404. Through the leaf disc transformation by Agrobacterium infection and multiple PCR identification, the positive transgenic tobacco plants of CmPP gene were obtained.Keywords: Cl

4、ostridium methylpentosum, membrane-integral pyrophosphatase, Agrobacterium transformation, transgenic tobacco1 前言膜整合焦磷酸酶（簡(jiǎn)稱(chēng)膜PPase）是焦磷酸（PPi）儲(chǔ)備能量轉(zhuǎn)移和利用的動(dòng)員蛋白，用以維持陽(yáng)離子梯度進(jìn)而幫助細(xì)胞在脅迫條件下存活1-4，與生物體的逆境適應(yīng)密切相關(guān)5-10。膜PPase根據(jù)其轉(zhuǎn)運(yùn)離子的特異性可分為Na+-PPase、Na+,H+-PPase和H+-PPase三個(gè)亞家族，其中以Na+-PPase作為膜PPase的進(jìn)化始祖，它們?cè)诟呒?jí)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)鍵殘基上具有高

5、度的保守性11,12。另外，膜PPase根據(jù)其活性是否需要K+激活而總體上可劃分為K+依賴(lài)型和K+非依賴(lài)型兩大類(lèi)13。具有H+泵活性的膜H+-PPase廣泛存在于包括古生菌、真細(xì)菌、植物和原生動(dòng)物在內(nèi)的生物三界中，發(fā)現(xiàn)最早，研究得最早和最多2，特別是近十五年來(lái)在構(gòu)建抗逆生物尤其是植物方面的應(yīng)用已十分引人矚目，過(guò)表達(dá)H+-PPase的各種轉(zhuǎn)基因植物在諸多逆境條件（如高鹽、干旱、磷或氮營(yíng)養(yǎng)虧缺等）下表現(xiàn)出增強(qiáng)的抗性或耐受性14-20。相比較，其它兩個(gè)亞家族PPase（Na+-PPase和Na+,H+-PPase）幾年前或最近僅在原核生物（主要是一些極端環(huán)境（如高鹽、缺氧）下的古生菌和細(xì)菌）中發(fā)現(xiàn)3

6、,4，不僅暗示出它們對(duì)原始生物體應(yīng)對(duì)早期地化環(huán)境（當(dāng)前還有遺存）的重要性，同時(shí)也一致性印證了H+-PPase對(duì)現(xiàn)世植物適應(yīng)逆境的關(guān)鍵作用。它們具有Na+泵活性和直接的排Na+作用以及在創(chuàng)建抗鹽轉(zhuǎn)基因生物的巨大應(yīng)用潛力。但是，關(guān)于它們的功能驗(yàn)證和應(yīng)用研究目前還幾乎沒(méi)有明確的報(bào)道。本工作特地針對(duì)人腸道甲基戊糖梭菌的膜整合PPase（CmPP，推測(cè)是Na+,H+-PPase亞家族成員），將其基因轉(zhuǎn)化到煙草中以分析它在轉(zhuǎn)基因煙草的抗鹽效果，為后續(xù)進(jìn)一步將它應(yīng)用于主要農(nóng)作物的抗逆（鹽）基因工程打下必要的基礎(chǔ)。2材料與方法2.1 實(shí)驗(yàn)材料植物實(shí)驗(yàn)材料：煙草品種為Nicotiana tabacum Xant

7、hi，種子由本實(shí)驗(yàn)室提供，取其一個(gè)月大的無(wú)菌苗葉片作為轉(zhuǎn)化外植體。宿主菌及載體：本工作所用大腸桿菌菌株DH5、植物載體pBI121、根癌農(nóng)桿菌LBA4404均為本實(shí)驗(yàn)室保存。2.2 主要試劑和耗材2.2.1 生化和分子生物學(xué)試劑限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DreamTaq DNA聚合酶等購(gòu)于Thermo Scientific Fermentas公司。蛋白胨、酵母提取粉等購(gòu)于生工生物技術(shù)有限公司。氨芐青霉素購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司。常用試劑盒如膠純化試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒，溶液純化試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒由北京天根公司提供。2.2.2 激素與抗生素（1）a-萘乙酸(NAA)：

8、用95%的酒精溶解后，加水定容，配制成0.2mg/mL的母液，用0.22m濾膜過(guò)濾滅菌后于4保存。（2）6-芐氨基嘌呤(6-BA)：用2M的氫氧化鈉溶解后，加水定容，配制成2mg/mL的母液，用0.22m濾膜過(guò)濾滅菌后保存于4。（3）羧芐青霉素(Car)：儲(chǔ)存濃度為250mg/mL，稱(chēng)取2.5g的藥品溶解在無(wú)菌水中，定容到l0mL后用0.22m濾膜過(guò)濾滅菌，保存在-20。（4）鏈霉素(Str)：125mg/mL，將1.25克藥品溶解于無(wú)菌水中，定容至l0mL后用0.22m濾膜過(guò)濾滅菌，-20保存。（5）卡那霉素(Kan)：100mg/mL，稱(chēng)取1g的藥品溶解到無(wú)菌水中，定容到l0mL后用0.2

9、2m的濾膜小心過(guò)濾滅菌，-20保存。2.2.3 培養(yǎng)基的配制（1）YEB培養(yǎng)基（用于農(nóng)桿菌的培養(yǎng)）：配制1L，加酵母提取物1g、蛋白胨5 g、牛肉膏5 g、蔗糖5 g、硫酸鎂0.5 g，將pH調(diào)為7.0，每升固體培養(yǎng)基加20g瓊脂粉，高壓滅菌后備用。（2）MS培養(yǎng)基（用于煙草的培養(yǎng)），按表4.1配制6種母液：表4.1MS培養(yǎng)基母液的配制母液成分用量（g）定容（mL）每升用量（mL）母液1（50倍）NH4NO38.2510020KNO39.5MgSO47H2O1.85母液2（100倍）無(wú)水CaCl23.322410010母液3（100倍）KH2PO41.710010母液4（100倍）Na2EDT

10、A0.37310010FeSO47H2O0.278母液5（1000倍）H3BO30.621001MnSO4H2O1.69ZnSO47H2O0.86KI0.083Na2MO42H2O0.025CuSO45H2O0.0025CoCl26H2O0.0025母液6（200倍）肌醇201005甘氨酸0.4煙酸0.1鹽酸吡哆醇(VB6)0.1鹽酸硫胺素(VB1)0.02注：將藥品分別用少量蒸餾水溶解后，混勻，加蒸餾水并定容至所需體積；1L培養(yǎng)基中需加入30g蔗糖，固體培養(yǎng)基每升加7g瓊脂粉；固體和液體培養(yǎng)基的pH均為5.8。（3）LB（Luria-Bertain）培養(yǎng)基，用于大腸桿菌的培養(yǎng)。配制方法（1

11、L）：稱(chēng)取10 g蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化鈉，溶于900 mL去離子水中，用5 M的NaOH 調(diào)節(jié)pH值至7.0-7.2，用去離子水定容至1 L。分裝后于121 高溫高壓滅菌30 min后室溫保存，開(kāi)封后4 保存。如果是固體培養(yǎng)基則調(diào)整pH值后按15 g/L加入適量瓊脂粉再定容和滅菌。2.3 實(shí)驗(yàn)方法2.3.1 植物基因組DNA的提取參照TIANGEN公司的新型植物基因組DNA提取的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：（1）材料處理：稱(chēng)取100 mg新鮮植物組織或干重組織20 mg，加入少量液氮研磨充分。把400L LP1緩沖液和6L 濃度為10 mg/mL RNase A加入到材料中，振蕩旋渦1

12、 min，在室溫下放置10 min。（2）加入130L緩沖液LP2，充分混勻，旋渦振蕩1 min。（3）12,000 rpm離心5 min，將上清移至新的離心管中。（4）把1.5倍體積的緩沖液LP3（使用前已加入無(wú)水乙醇）加到離心管中，立刻振蕩15 sec，混勻，振蕩后也許會(huì)有絮狀沉淀出現(xiàn)。（5）把上一步得到的溶液連同絮狀沉淀一起都加一個(gè)新的吸附柱CB3中，12,000 rpm的轉(zhuǎn)速，室溫下離心30 sec，將廢液倒掉，并把吸附柱CB3放入干凈的收集管中。（6）把600L的漂洗液PW加入到CB3中（使用前經(jīng)檢查已加入無(wú)水乙醇），12,000 rpm的轉(zhuǎn)速，室溫下離心30 sec，將廢液倒掉，并

13、把吸附柱CB3放入干凈的收集管中。注意：如果漂洗后吸附柱膜依然呈現(xiàn)綠色，要將500L的無(wú)水乙醇加入到吸附柱CB3中加入，12,000 rpm的轉(zhuǎn)速，室溫下離心30 sec，將廢液倒掉，并把吸附柱CB3放入干凈的收集管中。（7）重復(fù)操作（6）。（8）將CB3吸附柱放回到收集管中，12,000 rpm離心2 min，將廢液倒掉。把CB3吸附柱靜止放在室溫下幾分鐘，徹底晾干漂洗液。（9）把CB3吸附柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管中，向吸附柱中央懸空加入適量水。室溫下放置25 min后，12,000 rpm離心2 min，把洗脫下來(lái)的溶液收集到離心管中。2.3.2 煙草種子的消毒及無(wú)菌苗的培養(yǎng)（1）將適量煙

14、草種子置于滅過(guò)菌的1.5mL離心管中，用無(wú)菌水沖洗干凈；（2）加入適量75%的乙醇，對(duì)種子進(jìn)行表面消毒30s，其間不斷用槍頭吹吸；（3）用無(wú)菌水沖洗一次；（4）向離心管中加入適量10%的雙氧水，對(duì)煙草種子進(jìn)行徹底消毒10min，其間不斷用槍頭吹吸；（5）用無(wú)菌水沖洗5次，吸出多余的水，將離心管置于超凈工作臺(tái)吹干；（6）將種子轉(zhuǎn)接到MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)23周，培養(yǎng)條件為：溫度26，光照強(qiáng)度1500 Lux，16h光照/8h黑暗。（7）剩余的種子封裝好放于4保存?zhèn)溆谩?.3.3 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（1）-80 保存的農(nóng)桿菌LBA4404解凍后，取少量于YEB培養(yǎng)基(含125 mg/L Str)

15、平板上劃線，28 培養(yǎng)2天左右。（2）挑取單菌落接種于3mL YEB培養(yǎng)基(含125 mg/L Str)，28 ，180 rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。（3）按1:100的比例取過(guò)夜培養(yǎng)物接種于新鮮YEB培養(yǎng)基(含125 mg/L Str)中，28，180 rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.45左右。（4）將菌液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的50 mL離心管中，冰浴30 min，4 ，5000 rpm離心5 min。（5）用10 mL冰冷的0.15 mol/L的NaCl溶液懸浮沉淀4 ，5000 rpm離心5min，棄盡上清。（6）冰浴中用1mL 0.02mol/L的CaCl2溶液（含終濃度15 %的甘油）輕輕懸起細(xì)胞，即

16、用、或100 L/管分裝好后液氮速凍并于-80 保存?zhèn)溆谩?.3.4 CmPP植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建2.3.4.1 插入片段CmPP(SS)的制備（1）片段CmPPSm的擴(kuò)增擴(kuò)增體系如下：組分體積(L)10×Pfu Buffer with Mg2+52.5×dNTP Mix (2 mM each)4引物CmPP-5Sm (25 M)1引物Tt7Dw-Rv (25 M)1模板：適當(dāng)濃度的pET(CmPP)質(zhì)粒1Pfu DNA 聚合酶（5 U/L）0.5無(wú)菌水37.5程序：步驟溫度（）時(shí)間循環(huán)數(shù)預(yù)變性955 min1變性9430 s1退火4930 s延伸725 min變性9430

17、s35退火5630 s延伸725 min最后延伸7210 min1膠回收PCR產(chǎn)物，純化后片段取名為CmPPSm。（2）用SacI完全酶切CmPPSm，膠回收約2.1kb的片段（不要0.2kb的小片段），取名為CmPP(SS)，作為插入片段。2.3.4.2 載體片段pBI121(SS)的制備（1）將植物載體pBI121轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，搖菌，提取質(zhì)粒，取1 L用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。（2）將植物載體pBI121的DNA用SmaI、SacI雙酶切完全（切出來(lái)兩個(gè)片段12.9kb、1.9kb），膠回收約12.9kb的大片段，取名為pBI121(SS)。2.3.4.3 連接、轉(zhuǎn)化及鑒定（1）將

18、片段pBI121(SS)和CmPP(SS)進(jìn)行連接組分體積（L）pBI121(SS)10（2000 ng）CmPP(SS)13（與載體DNA的摩爾比（1:1 10:1）10×T4 DNA連接緩沖液3T4 DNA連接酶1 ddH2O3輕輕混勻，22 孵育30 min2 h，取5L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a。注：PCR產(chǎn)物的5平端能跟載體SmaI酶切的平端連接，PCR產(chǎn)物的3端經(jīng)SacI酶切的粘性末端能跟載體SacI酶切的粘性末端連接。（2）菌落PCR鑒定：隨機(jī)從轉(zhuǎn)化平板中挑取單菌落，做菌夜PCR，用基因本身引物引物CmPP-5Nd、CmPP-3Sc；PCR大小約2.1kb；陽(yáng)性重組載體取名為

19、pBI121(CmPP)。（3）提取pBI121(CmPP)的質(zhì)粒，取1L用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后進(jìn)行酶切鑒定（SmaI、SacI分別單切，大小約為15Kb；XbaI/SacI雙酶切會(huì)產(chǎn)生兩片段12.9kb，2.1kb）。2.3.5 質(zhì)粒pBI121(CmPP)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化子鑒定（1）農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞LBA4404 100L于冰上解凍后，加入質(zhì)粒pBI121(CmPP)，輕輕混勻，冰浴30 min。（2）37 水浴5min，冰浴2 min。（3）于超凈工作臺(tái)上加入800 L 28保溫的新鮮YEB培養(yǎng)基，28 , 110 rpm培養(yǎng)35h。（4）1000 rpm 離心30s。（5

20、）棄上清，用100L YEB培養(yǎng)基重懸菌體，涂布于含抗生素（50 mg/L Kan和125 mg/L Str）的YEB平板上，靜置30 min后，于28 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天左右。（6）轉(zhuǎn)化子鑒定：隨機(jī)挑取YEB平板上的農(nóng)桿菌單菌落進(jìn)行菌液PCR。2.3.6 用于轉(zhuǎn)化煙草的農(nóng)桿菌的培養(yǎng)（1）挑取已鑒定的pBI121(CmPP)轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌LBA4404的陽(yáng)性克隆，于3 mL YEB培養(yǎng)基（50 mg/L Kan和125 mg/L Str），28 、180 rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。（2）按1:100的比例取過(guò)夜培養(yǎng)物接種于新鮮50mL YEB培養(yǎng)基（50 mg/L Kan和125 mg/L Str）中，

21、28 、180 rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.45左右。（3）將菌液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的100 mL離心管中，4 、12000 rpm離心5 min。（4）用1/2 MS培養(yǎng)基溶液懸浮沉淀，并將懸浮液全部轉(zhuǎn)移至100 mL預(yù)先滅好菌的藍(lán)蓋試劑瓶中，置于超凈臺(tái)備用。2.3.7 煙草葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因煙草的無(wú)菌培養(yǎng)（1）將煙草無(wú)菌苗的優(yōu)質(zhì)葉片用滅過(guò)菌的小刀切去中脈和葉緣，把剩下的葉片切成0.60.8cm × 0.60.8cm的大小均勻的小葉片。（2）將切好的葉片用滅過(guò)菌的鑷子小心的轉(zhuǎn)移到制備好的農(nóng)桿菌菌液中，不斷的輕輕緩慢侵染振蕩5min。（3）用滅過(guò)菌的鑷子小心的將小葉盤(pán)夾到事先備好的無(wú)菌水

22、中，輕輕洗去表面的多余菌液。（4）用鑷子將葉盤(pán)夾到滅菌過(guò)的濾紙上，吸干殘留在葉片上的無(wú)菌水及菌液。（5）將小葉片轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS固體培養(yǎng)基 + 1mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA）上，培養(yǎng)基表面先加上一層事先滅好菌的濾紙，把葉片的正面向上，小心放到濾紙上，用封口膜把培養(yǎng)皿封好，于28暗培養(yǎng)3天。（6）濾菌培養(yǎng)：將葉盤(pán)從共培養(yǎng)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到濾菌培養(yǎng)基（MS固體培養(yǎng)基+1mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA+500 mg/L Car）上，在26、光照強(qiáng)度1500 Lux、16h光照/8h黑暗的條件下培養(yǎng)5天。（7）選擇培養(yǎng)：將外植體從濾菌培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基（MS固體培

23、養(yǎng)基+1mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA+100mg/L Kan）上，在26、光照強(qiáng)度1500 Lux、16h光照/8h黑暗的條件下培養(yǎng)20天。（8）繼代培養(yǎng)：把長(zhǎng)出大量愈傷組織的優(yōu)質(zhì)的抗性外植體用小刀小心分割成小塊后，用滅過(guò)菌的鑷子轉(zhuǎn)入到繼代培養(yǎng)基（MS固體培養(yǎng)基+1mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA+100mg/L Kan+300 mg/L Car）中，在26、光照強(qiáng)度1500 Lux、16h光照/8h黑暗的條件下培養(yǎng)。（9）生根培養(yǎng)：等到篩選的抗性芽長(zhǎng)到l。21.5cm的時(shí)候，切下抗性下，并轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基（MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+100 mg/L

24、Car）上誘導(dǎo)生根，在26、光照強(qiáng)度1500 Lux、16h光照/8h黑暗的條件下培養(yǎng)25天左右，獲得具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因煙草植株。2.3.8 CmPP轉(zhuǎn)基因煙草植株的鑒定（1）按2.3.1的方法提取卡那霉素抗性煙草轉(zhuǎn)化再生植株的基因組DNA。（2）PCR檢測(cè)：采用3對(duì)引物，對(duì)煙草轉(zhuǎn)化再生植株進(jìn)行鑒定，引物對(duì)：CmPPm-Fw/CmPPm-Rv，CmPPm-Fw/NosTer-Rv，35SPro-Fw/CmPPm-Rv。反應(yīng)體系如下：組分體積(L)10×Easy Taq Buffer with Mg2+2.52.5×dNTP Mix (2 mM each)2-Fw (2

25、5 M)0.5-Rv (25 M)0.5模板：基因組DNA（10 pg 1g）0.5Easy Taq酶（5 U/L）0.25無(wú)菌水18.75程序：步驟溫度( )時(shí)間循環(huán)數(shù)預(yù)變性955 min1變性9430 s30退火溫度5530 s延伸721min 40s最后延伸7210 min13 結(jié)果3.1 CmPP植物轉(zhuǎn)化載體的制備以質(zhì)粒pET(CmPP)為模板，采用Pfu高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶大小正確，約為2.3kb（圖1 A）。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后，電泳檢測(cè)濃度約為25ng/L（圖1 B）。對(duì)回收后的PCR產(chǎn)物用SacI酶切完全，膠回收約2.1kb的片段（圖1 C），取名為C

26、mPP(SS)，另外酶切會(huì)產(chǎn)生一個(gè)約0.2kb的微弱小片段。 A B C 圖 1 CmPP基因酶切片段的制備A：CmPP再擴(kuò)增；B：膠回收CmPP擴(kuò)增產(chǎn)物；C：SacI酶切CmPP擴(kuò)增產(chǎn)物提取植物載體pBI121的質(zhì)粒DNA，由于該載體拷貝數(shù)較低，所以提出的質(zhì)粒濃度較低，約20 ng/L（圖2 A）。將質(zhì)粒pBI121用EcoRI進(jìn)行單酶切鑒定，酶切后大小約為15kb；用SmaI/SacI、XbaI/SacI進(jìn)行雙酶切鑒定，均切出兩個(gè)片段12.9kb、1.9kb；結(jié)果驗(yàn)證了pBI121質(zhì)粒的正確性，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖2 B）。取一定量的pBI121質(zhì)粒，用SmaI和SacI雙酶切完全（圖2 C

27、），膠回收12.9kb的片段，取名為pBI121(SS)，電泳檢測(cè)回收后的濃度較低，約為10ng/L（圖2 D）。A B C D圖2 載體pBI121酶切片段的制備A：pBI121質(zhì)粒的提取；B：pBI121酶切鑒定；C：SmaI和SacI雙酶切pBI121；D：雙酶切產(chǎn)物回收檢測(cè)將酶切片段pBI121(SS)和CmPP(SS)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行菌液PCR，挑取的4個(gè)克隆有1個(gè)是陽(yáng)性，條帶大小正確，約為2.1kb（圖3 A）。將鑒定出的陽(yáng)性克隆搖菌并提取質(zhì)粒（圖3 B）。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定：SmaI、SacI分別單切（大小約為15kb），XbaI

28、/SacI雙酶切產(chǎn)生兩片段12.9kb、2.1kb（圖3 C），結(jié)果說(shuō)明了重組質(zhì)粒pBI121(CmPP)的正確性。對(duì)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的菌落進(jìn)行菌液PCR，所挑選的2個(gè)菌落均為陽(yáng)性，條帶大小正確，約為2.1kb（圖3 D）。A B C D圖3 植物載體pBI121(CmPP)的構(gòu)建和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化A：pBI121(CmPP)菌液PCR鑒定；B：pBI121(CmPP)質(zhì)粒提取；C：pBI121(CmPP)酶切鑒定；D： pBI121(CmPP)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子PCR鑒定3.2 CmPP基因的煙草葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化及無(wú)菌培養(yǎng)煙草小葉片在共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS固體培養(yǎng)基+1mg/L 6-BA、0.1 mg/L NA

29、A）上于28暗培養(yǎng)3天后，由于沒(méi)有光照，葉片微微泛黃，葉片吸取了培養(yǎng)基中的水分后，表面積比暗培養(yǎng)之前變大。將葉盤(pán)從共培養(yǎng)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到濾菌培養(yǎng)基（MS固體培養(yǎng)基+1mg/L 6-BA，0.1 mg/L NAA+500 mg/L Car）上，在26、光照強(qiáng)度1500 Lux、16h光照/8h黑暗的條件下培養(yǎng)5天（圖4 A）。將外植體從濾菌培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基（MS固體培養(yǎng)基+1mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA+100mg/L Kan）上，在26、光照強(qiáng)度1500 Lux、16h光照/8h黑暗的條件下培養(yǎng)。在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天左右，農(nóng)桿菌無(wú)污染，但煙草外植體只出現(xiàn)零星小芽；到20天

30、左右，煙草外植體出現(xiàn)大量綠色小芽，農(nóng)桿菌依然能夠很好地得到抑制（圖4 B）。將長(zhǎng)出大量愈傷組織的抗性外植體分割成小塊后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基（MS固體培養(yǎng)基+1mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA+100mg/L Kan+300 mg/L Car）中，在26、光照強(qiáng)度1500 Lux、16h光照/8h黑暗的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)20天左右，抗性芽長(zhǎng)至l1.5cm（圖4 C）。將莖較長(zhǎng)的抗性芽切下并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+100 mg/L Car）上誘導(dǎo)生根，在26、光照強(qiáng)度1500 Lux、16h光照/8h黑暗的條件下培養(yǎng)25天左右，獲得具有卡那霉素抗性的煙草轉(zhuǎn)化再

31、生植株（圖4 D）。圖4 CmPP基因轉(zhuǎn)化煙草的培育過(guò)程A：濾菌培養(yǎng)；B：選擇培養(yǎng)；C：繼代培養(yǎng)；D：生根培養(yǎng)3.3 CmPP轉(zhuǎn)基因煙草植株的鑒定選取17株CmPP轉(zhuǎn)化煙草再生植株（1-17）和野生型植株（WT），按2.3.1的方法提取基因組DNA，取1L電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖5 A所示。以所提基因組DNA為模板，用EasyTaq酶及3對(duì)引物鑒定轉(zhuǎn)基因植株：引物CmPPm-Fw、CmPPm-Rv分別為CmPP基因內(nèi)部的上、下游引物，引物35SPro-Fw為載體pBI121上CaMV 35S啟動(dòng)子引物，NosTer-Rv為載體pBI121上Nos終止子引物。由引物CmPPm-Fw/CmPPm-Rv的

32、擴(kuò)增結(jié)果可以看出，野生型、轉(zhuǎn)化再生植株的3號(hào)、7號(hào)、15號(hào)在500bp左右有較弱的條帶，而其它株系的目的條帶較亮，且大小正確（530bp）（圖5 B）。由引物CmPPm-Fw/NosTer-Rv的擴(kuò)增結(jié)果可以觀察到，野生型煙草在1600bp左右無(wú)條帶，轉(zhuǎn)化再生植株中的3號(hào)、7號(hào)、15號(hào)在1600bp左右有較弱的條帶，而其它株系的目的條帶雖然亮度不一，但均較亮，且大小正確（1600bp）（圖5 C）；另外，由引物35SPro-Fw /CmPPm-Rv的擴(kuò)增結(jié)果可以看到，野生型煙草在1200bp左右無(wú)條帶，轉(zhuǎn)基因煙草中的3號(hào)、7號(hào)、15號(hào)在1200bp左右有較弱的條帶，而其它株系的目的條帶雖然亮度

33、不一，但均較亮，且大小正確（1200bp）（圖5 D）。圖5 CmPP轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR鑒定。WT為野生型對(duì)照，117為17個(gè)CmPP轉(zhuǎn)基因株系。A：煙草基因組DNA提取；B：引物CmPPm-Fw/CmPPm-Rv PCR鑒定：C：引物CmPPm-Fw/NosTer-Rv PCR鑒定；D：引物35SPro-Fw /CmPPm-Rv PCR鑒定綜合上述結(jié)果，3對(duì)不同引物對(duì)野生型和CmPP基因轉(zhuǎn)化煙草的鑒定結(jié)果一致，所選的17個(gè)基因轉(zhuǎn)化再生株系，除3號(hào)、7號(hào)、15號(hào)不是陽(yáng)性外，其余的14個(gè)均為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系，說(shuō)明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的pBI121(CmPP)轉(zhuǎn)化煙草的陽(yáng)性率較高，達(dá)到了82.35%。4.

34、 討論提高植物抗鹽性一直以來(lái)都是植物逆境分子生物學(xué)和基因工程的主要研究領(lǐng)域，有著廣闊的應(yīng)用前景，而挖掘各種來(lái)源的抗鹽功能基因并對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證則是其重心之一。具有Na+泵活性和直接排Na+作用的兩類(lèi)亞家族PPase（Na+-PPase和Na+,H+-PPase）在創(chuàng)建抗鹽轉(zhuǎn)基因生物方面具有巨大應(yīng)用潛力，但目前還幾乎沒(méi)有關(guān)于它們的功能驗(yàn)證和應(yīng)用研究報(bào)道。本工作以實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的pET(CmPP)質(zhì)粒為模板，再擴(kuò)增得到甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶（推測(cè)是Na+,H+-PPase成員）的基因CmPP，構(gòu)建了其植物表達(dá)載體pBI121(CmPP)。通過(guò)農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化和多重PCR鑒定，最終獲得了陽(yáng)性CmPP

35、轉(zhuǎn)基因煙草植株。我們下一步工作是對(duì)CmPP轉(zhuǎn)基因煙草植株的當(dāng)代和子代植株進(jìn)行綜合抗鹽性分析，目的是為將它以后用于主要農(nóng)作物的抗鹽基因工程提供借鑒。參考文獻(xiàn)1 Holm N.G., and Baltscheffsky H., 2011, Links between hydrothermal environments, pyrophosphate, Na+, and early evolution J. Orig. Life Evol. Biosph., 41(5): 483-493.2 Serrano A., Pérez-Castiñeira J.R., Baltscheff

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