《法醫(yī)物證鑒定動物DNA種屬鑒定技術(shù)規(guī)范》

1、ICS點擊此處添加ICS號點擊此處添加中國標準文獻分類號DB34安徽省地方標準DB 34/ XXXXXXXXX法醫(yī)物證鑒定動物DNA種屬鑒定技術(shù)規(guī)范點擊此處添加標準英文譯名點擊此處添加與國際標準一致性程度的標識XXXX - XX - XX發(fā)布XXXX - XX - XX實施安徽省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB/ XXXXXXXXX前 言本技術(shù)規(guī)范按照GB/T 1.1-2009給出的規(guī)則起草。 請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別這些專利的責任。 本技術(shù)規(guī)范由安徽省司法廳提出。 本技術(shù)規(guī)范由安徽省市場監(jiān)督管理局歸口。 本技術(shù)規(guī)范起草單位：安徽新萊蒂克司法鑒定中心、安徽仁吉康生物

2、技術(shù)有限責任公司、安徽省司法鑒定協(xié)會。 本技術(shù)規(guī)范主要起草人：張黎黎、鮑加琪、趙莎莎、王陳成、余春曉、王彪、許云斐、劉慧。法醫(yī)物證鑒定動物DNA種屬鑒定技術(shù)規(guī)范1 范圍本技術(shù)規(guī)范規(guī)定了安徽省司法鑒定機構(gòu)法醫(yī)DNA實驗室進行DNA種屬鑒定的基本要求、檢驗程序、質(zhì)量控制、鑒定意見和鑒定文書。本技術(shù)規(guī)范適用于安徽省法醫(yī)DNA實驗室對含有DNA的生物檢材（包括但不限于血液、毛發(fā)、羽毛、組織、骨骼、牙齒等）的物種來源進行確認，確認范圍為獸類（包括人）、鳥類、爬行類、兩棲類。2 規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，

3、其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GA/T 382-2014 法庭科學(xué)DNA實驗室建設(shè)規(guī)范GA/T 383-2014 法庭科學(xué)DNA實驗室檢驗規(guī)范SF/Z JD0105008-2018 法醫(yī)物證鑒定線粒體DNA檢驗規(guī)范SF/T 0069-2020 法醫(yī)物證鑒定實驗室管理規(guī)范SN/T 4626-2016 DNA條形碼物種鑒定操作規(guī)程CNAS-CL08:2018 司法鑒定/法庭科學(xué)機構(gòu)能力認可準則CNAS-CL08-A002:2018 司法鑒定/法庭科學(xué)機構(gòu)能力認可準則在法醫(yī)物證 DNA 鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用說明3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1 法醫(yī)物證鑒定鑒定人運用法醫(yī)物證學(xué)

4、的科學(xué)技術(shù)或者專門知識，對各類生物檢材進行鑒別和判斷并提供鑒定意見的活動。3.2 DNA種屬鑒定DNA種屬鑒定指的是通過DNA序列分析對生物檢材的種屬來源進行鑒定。廣義上的種屬鑒定包括動植物的類屬確定，狹義的種屬鑒定指的是動物的生物檢材的種屬來源鑒定，即確定檢材是否屬于人體所有，有時還要確定檢材屬于何種動物。3.3 遺傳標記遺傳標記是指在DNA序列分析中用作標記的基因，也稱為標記基因。3.4 線粒體 DNA 線粒體DNA（Mitochondrial DNA, mtDNA）是指位于線粒體中的DNA，呈雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，有編碼區(qū)和非編碼區(qū)。常用的遺傳標記有控制區(qū)、12SrRNA、16SrRNA、細胞色

5、素c氧化酶亞基（Cytochrome c oxidase subunit I gene, CO I）以及細胞色素b（Cytochrome b, Cyt b）等。3.5 BLAST比對BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）是基于局部序列比對，對數(shù)據(jù)庫進行快速搜索，其特點是僅搜索序列之間高度相似的區(qū)域，可以兼顧到搜索的精確性和搜索速度，是目前應(yīng)用最廣泛的序列相似性搜索工具之一。 BLAST 的運行方式是先用目標序列建立數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫里面的每一條序列為目標序列，然后用查詢序列與數(shù)據(jù)庫中的目標序列做兩兩序列局部比對，從而得到全部比對結(jié)果。包括BLASTN和BL

6、ASTP，BLASTN是將給定的核酸序列與核酸數(shù)據(jù)庫中的序列進行比較；BLASTP是使用蛋白質(zhì)序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列進行比較。本規(guī)范應(yīng)用的是BLASTN。3.6 基因序列相似度基因序列相似度（Sequence similarity）是指進行序列比對時，檢測序列與目標序列之間相同DNA堿基數(shù)與檢測序列全部堿基數(shù)的比值。3.7 MSPMSP（Maximum-scoring segment pair）代表在數(shù)據(jù)庫中進行Blast檢索時，與被檢測序列相似度最高的序列。3.8 系統(tǒng)發(fā)育樹系統(tǒng)發(fā)育樹（Phylogenetic trees）是表明被認為具有共同祖先的各物種間演化關(guān)系的樹。4 基本要求4.

7、1 鑒定機構(gòu)應(yīng)具有從事法醫(yī)物證的執(zhí)業(yè)范圍，且應(yīng)滿足如下要求： a) 對所有影響鑒定結(jié)果的人員崗位規(guī)定相應(yīng)的能力要求，包括教育、資質(zhì)、培訓(xùn)、專業(yè)知識、技能等，并保留相關(guān)記錄；制定適宜的培訓(xùn)計劃并組織實施； b) 依據(jù)鑒定方法和要求對鑒定人以及參與鑒定工作的人員進行監(jiān)督，以評價其鑒定工作的符合性和滿意程度；監(jiān)督的結(jié)果應(yīng)作為培訓(xùn)需求評價的依據(jù)之一； c) 具有能識別樣本的標識系統(tǒng)，并確保樣本在鑒定過程期間能得到持續(xù)的識別； d) 建立樣本的運輸、接收、處置、保護、存儲、保留和/或清理的規(guī)定，應(yīng)對接收、內(nèi)部傳遞、處置、保留、返還和清理等過程進行記錄，確保記錄的完整性和可追溯性。 4.2 鑒定人應(yīng)具有法

8、醫(yī)物證鑒定執(zhí)業(yè)資格，熟悉并掌握線粒體DNA檢驗的方法和原理，并能正確評價結(jié)果。 4.3 鑒定活動應(yīng)包括檢驗（采樣、DNA提取和純化、DNA定量分析、DNA測序、遺傳信息分析）、鑒定意見判斷、鑒定文書撰寫等環(huán)節(jié)。鑒定活動完畢后，應(yīng)將各個環(huán)節(jié)的記錄進行歸檔。5 檢驗程序5.1 采樣要求5.1.1 含有DNA的生物檢材（包括但不限于血液、毛發(fā)、羽毛、組織、骨骼、牙齒等）均可采集。5.1.2 樣本應(yīng)分別包裝，注明編號、采樣日期等。5.1.3 樣本采集后應(yīng)及時進行實驗或冷凍保存（注：冷凍保存溫度為-20，時間不超過3個月）。5.2 DNA 提取和純化按照GA/T 383-2014中附錄A的方法執(zhí)行。5.

9、3 DNA 定量分析按照GA/T 383-2014中6.16.3的方法執(zhí)行。5.4 MtDNA測序根據(jù)需要，可選擇單個或多個遺傳標記，通過Primer數(shù)據(jù)庫獲取通用引物，或自行設(shè)計引物進行PCR擴增和測序。本技術(shù)規(guī)范提供了兩個通用引物的體系示例供參考，操作如下：a) PCR 擴增PCR 擴增體系：反應(yīng)組分原濃度終濃度10× PCR Buffer10×1×MgCl2（mmol/L）251.25dNTPs（mmol/L）100.2Taq 酶（U/L）20.05引物（mol/L）1.250.25模板DNA（ng/L）5-251-5ddH2O12SrRNA引物對：F：5&

10、#39;-AAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3'R：5'-GAGGGTGACGGGCGGTGTGT-3'CO I引物對：F：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'R：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'PCR 擴增條件：95，5 min；95 30 s，55 40 s，72 30 s，35 個循環(huán)；72，7 min。b) 測序利用遺傳分析儀對PCR產(chǎn)物進行雙向測序，得到DNA序列信息。5.5 遺傳信息分析5.6.1 BLAST比對獲得的DNA序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的在

11、線序列Blast工具()，在數(shù)據(jù)庫進行搜索。5.6.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 根據(jù)Blast搜索結(jié)果，當MSP有多個物種序列時，下載這些物種的基因序列，同時下載遠源物種的基因序列作為外群序列。利用專業(yè)分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。6 質(zhì)量控制從事DNA種屬鑒定的實驗室至少應(yīng)該包括以下質(zhì)量控制措施： 6.1 對照設(shè)置 為保證DNA測序結(jié)果的準確性，要求每次實驗過程中均設(shè)置陽性對照和陰性對照。陽性對照：PCR擴增添加Control DNA作為陽性對照。陰性對照包括：（1）提取試劑的空白對照，用于監(jiān)控從提取到分析環(huán)節(jié)是否存在污染；（2）PCR試劑的空白

12、對照，用于監(jiān)控從擴增到分析環(huán)節(jié)是否存在外源DNA污染。6.2 雙向測序 為避免潛在的異質(zhì)性影響和保證結(jié)果的可靠性，宜進行正、反鏈雙向測序。 6.3 污染防控 根據(jù)CNAS-CL08-A002:2018法醫(yī)物證DNA實驗室的相關(guān)要求，從事DNA種屬鑒定實驗室應(yīng)采取（但不限于）以下措施以防止污染：a)檢材在實驗室工作區(qū)間的單向流動；b)做好實驗人員的自身防護，如使用個人防護裝備，包括作業(yè)服、一次性使用手套、一次性使用口罩和一次性使用發(fā)罩，并根據(jù)具體情況及時更換；c)做好設(shè)備、設(shè)施的定期清理和消毒；d)具備實驗區(qū)的外部屏障，能有效阻止無關(guān)人員未經(jīng)許可進入實驗區(qū)。 7 鑒定意見7.1 根據(jù) DNA 檢驗結(jié)果的遺傳信息分析進行鑒定意見判斷。 7.2 鑒定意見判斷可參考以下原則： a） 當檢測序列與MSP的基因序列相似度為99-100%，且MSP所代表動物為單個物種時，可認為MSP所代表動物與檢材所屬動物為同一種； b） 當檢測序列與MSP的基因序列相似度為99-100%，且MSP所代表動物為多個物種時，