豬胰臟制備優(yōu)質(zhì)ppt課件

1、動(dòng)物胰蛋白酶的制備及活力的測(cè)定一、生物大分子制備概述 生物大分子主要是指蛋白質(zhì)、多糖和核酸，這三類(lèi)物質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)根底。在自然科學(xué)，尤其是生命科學(xué)高度開(kāi)展的今天，蛋白質(zhì)、多糖和核酸等生物大分子的構(gòu)造與功能的研討是探求生命奧妙的中心課題，而生物大分子構(gòu)造與功能的研討，必需首先處理生物大分子的制備問(wèn)題，沒(méi)有可以到達(dá)足夠純度的生物大分子的制備任務(wù)為前題，構(gòu)造與功能的研討就無(wú)從談起。然而生物大分子的分別純化與制備是一件非常細(xì)致而困難的任務(wù)，有時(shí)制備一種高純度的蛋白質(zhì)、酶或核酸，要付出長(zhǎng)期和艱苦的努力。 生物資料的組成極其復(fù)雜，經(jīng)常包含有數(shù)百種 乃至幾千種化合物。 生物大分子在生物資料中的含量極微。

2、只需萬(wàn)分之一、幾十萬(wàn)分之 一，甚至幾百萬(wàn)分之一。分別純化的步驟繁多，流程又長(zhǎng)，有的目 的產(chǎn)物要經(jīng)過(guò)十幾步、幾十步的操作才干到達(dá)所需純度的要求。例 如由腦垂體組織獲得某些激素的釋放因子，要用幾噸甚至幾十噸的 生物 資料，才干提取出幾毫克的樣品。 生物大分子一旦分開(kāi)了生物體內(nèi)的環(huán)境時(shí)就極易失活。因此分別過(guò) 程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。過(guò) 酸、過(guò)堿、高溫、猛烈的攪拌、強(qiáng)輻射及本身的自溶等都會(huì)使生物 大分子變性而失活，所以分別純化時(shí)一定要選用最適宜的環(huán)境和條 件。 生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進(jìn)展的，溫度、pH值、離子強(qiáng) 度等各種參數(shù)對(duì)溶液中各種組成的綜合影響，很難準(zhǔn)確估

3、計(jì)和判 斷。 與化學(xué)產(chǎn)品的分別制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點(diǎn)： 1.確定要制備的生物大分子的目的和要求，是進(jìn)展科研、消費(fèi)還是要發(fā)現(xiàn)新的物質(zhì)。 2.建立相應(yīng)的可靠的分析測(cè)定方法，這是制備生物大分子的關(guān)鍵，由于它是整個(gè)分別純化過(guò)程的“眼睛。 3.經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)備性實(shí)驗(yàn)，掌握生物大分子目的產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)。 4.生物資料的破碎和預(yù)處置。 5.分別純化方案的選擇和探求，這是最困難的過(guò)程 6.生物大分子制備物的均一性即純度的鑒定，要求到達(dá)一維電泳一條帶，二維電泳一個(gè)點(diǎn)，或HPLC和毛細(xì)管電泳都是一個(gè)峰。 7.產(chǎn)物的濃縮，枯燥和保管。 生物大分子的制備通常可按以下步驟進(jìn)展：二、生物大分子制

4、備的前處置一 生物資料的選擇制備生物大分子，首先要選擇適當(dāng)?shù)纳镔Y料。資料的來(lái)源無(wú)非是動(dòng)物、植物和微生物及其代謝產(chǎn)物。從工業(yè)消費(fèi)角度選擇資料，應(yīng)選擇含量高、來(lái)源豐富、制備工藝簡(jiǎn)單、本錢(qián)低的原料。從科研任務(wù)的角度選材，那么只須思索資料的選擇符合實(shí)驗(yàn)預(yù)定的目的要求即可。除此之外，選材還應(yīng)留意植物的季節(jié)性、地理位置和生長(zhǎng)環(huán)境等。選動(dòng)物資料時(shí)要留意其年齡、性別、營(yíng)養(yǎng)情況、遺傳素質(zhì)和生理形狀等。動(dòng)物在饑餓時(shí)，脂類(lèi)和糖類(lèi)含量相對(duì)減少，有利于生物大分子的提取分別。選微生物資料時(shí)要留意菌種的代數(shù)和培育基成分等之間的差別，例如在微生物的對(duì)數(shù)期，酶和核酸的含量較高，可獲得較高的產(chǎn)量。 資料選定后要盡能夠堅(jiān)持新穎，

5、盡快加工處置，動(dòng)物組織要先除去結(jié)締組織、脂肪等非活性部分，絞碎后在適當(dāng)?shù)娜軇┲刑崛?，假設(shè)所要求的成分在細(xì)胞內(nèi)，那么要先破碎細(xì)胞。植物要先去殼、除脂。微生物資料要及時(shí)將菌體與發(fā)酵液分開(kāi)。生物資料如暫不提取，應(yīng)冰凍保管。動(dòng)物資料那么需深度冷凍保管。 二 細(xì)胞的破碎 1機(jī)械法： 1) 研磨將剪碎的動(dòng)物組織置于研缽或勻漿器中，參與少量石英砂研磨或勻漿，即可將動(dòng)物細(xì)胞破碎，這種方法比較溫暖，適宜實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用。工業(yè)消費(fèi)中可用電磨研磨。細(xì)菌和植物組織細(xì)胞的破碎也可用此法。2) 組織搗碎機(jī)這是一種較猛烈的破碎細(xì)胞的方法，為了防止發(fā)熱和升溫過(guò)高，通常是轉(zhuǎn)10秒20秒，停10秒20秒，可反復(fù)多次。 2物理法： 1)

6、 反復(fù)凍融法 將待破碎的細(xì)胞冷至15到20，然后放于室溫(或40)迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)構(gòu)成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。2) 超聲波處置法此法是借助超聲波的振動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。破碎微生物細(xì)菌和酵母菌時(shí)，時(shí)間要長(zhǎng)一些，處置的效果與樣品濃度和運(yùn)用頻率有關(guān)。運(yùn)用時(shí)留意降溫，防止過(guò)熱。3) 壓榨法這是一種溫暖的、徹底破碎細(xì)胞的方法。在1000 105Pa2000105Pa 的高壓下使幾十毫升的細(xì)胞懸液經(jīng)過(guò)一個(gè)小孔忽然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。這是一種較理想的破碎細(xì)胞的方法，但儀器用較高。 4) 冷熱交替法 從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可用此法。在90左右維

7、持?jǐn)?shù)分鐘，立刻放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎。 3化學(xué)與生物化學(xué)方法：自溶法 將新穎的生物資料存放于一定的pH和適當(dāng)?shù)臏囟认?，?xì)胞構(gòu)造在本身所具有的各種水解酶如蛋白酶和酯酶等的作用下發(fā)生溶解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來(lái)，此法稱(chēng)為自溶法。運(yùn)用時(shí)要特別小心操作，由于水解酶不僅可以使細(xì)胞壁和膜破壞，同時(shí)也能夠會(huì)把某些要提取的有效成分分解了。2 溶脹法 細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在浸透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞膜脹破釋放出細(xì)胞內(nèi)含物。 3) 酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37，pH8，處置15分鐘，可以專(zhuān)注性

8、地將細(xì)胞壁分解，釋放出細(xì)胞內(nèi)含物，此法適用于多種微生物。例如從某些細(xì)菌細(xì)胞提取質(zhì)粒DNA時(shí)，可采用溶菌酶來(lái)自蛋清破細(xì)胞壁，而在破酵母細(xì)胞時(shí)，常采用蝸牛酶來(lái)自蝸牛，將酵母細(xì)胞懸于0.1mmol/L 檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖液(pH=5.4)中，加1蝸牛酶，在30處置30分鐘，即可使大部分細(xì)胞壁破裂，好像時(shí)參與0.2疏基乙醇效果會(huì)更好。此法可以與研磨法結(jié)合運(yùn)用。4) 有機(jī)溶劑處置法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS十二烷基硫酸鈉等外表活性劑處置細(xì)胞，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也可以與研磨法結(jié)合運(yùn)用。 三 生物大分子的提取 “提取是在分別純化之前將經(jīng)過(guò)預(yù)處置或破碎的細(xì)胞置于溶劑中，使

9、被分別的生物大分子充分地釋放到溶劑中，并盡能夠堅(jiān)持原來(lái)的天然形狀不喪失生物活性的過(guò)程。 1水溶液提?。?蛋白質(zhì)和酶的提取普通以水溶液為主。稀鹽溶液和緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)和酶最常用的溶劑。用水溶液提取生物大分子應(yīng)留意的幾個(gè)主要影響要素是：鹽濃度即離子強(qiáng)度： 絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在低離子強(qiáng)度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中參與少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比在純水時(shí)大大添加，稱(chēng)為“鹽溶景象。但中性鹽的濃度添加至一定時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度又逐漸下降，直至沉淀析出，稱(chēng)為“鹽析景象。鹽溶景象的產(chǎn)生主要是少量離子的活動(dòng)，減少了偶極分子之間極性基團(tuán)的靜電吸引力，添加了溶質(zhì)和溶劑分子間

10、相互作用力的結(jié)果。所以低鹽溶液常用于大多數(shù)生化物質(zhì)的提取。通常運(yùn)用0.02 mol/L 0.05 mol/L 緩沖液或0.09 mol/L 0.15 mol/L NaCl 溶液提取蛋白質(zhì)和酶。不同的蛋白質(zhì)極性大小不同，為了提高提取效率，有時(shí)需求降低或提高溶劑的極性。向水溶液中參與蔗糖或甘油可使其極性降低，添加離子強(qiáng)度如參與KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4可以添加溶液的極性。2) pH值：蛋白質(zhì)、酶與核酸的溶解度和穩(wěn)定性與pH值有關(guān)。過(guò)酸、過(guò)堿均應(yīng)盡量防止，普通控制在pH=68范圍內(nèi)，提取溶劑的pH應(yīng)在蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點(diǎn)的兩側(cè)。堿性蛋白質(zhì)選在偏酸一側(cè)，酸性

11、蛋白質(zhì)選在偏堿的一側(cè)，以添加蛋白質(zhì)的溶解度，提高提取效果。例如胰蛋白酶為堿性蛋白質(zhì)，常用稀酸提取，而肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質(zhì)，那么常用稀堿來(lái)提取。3) 溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質(zhì)和酶，提取時(shí)普通在05的低溫操作。但少數(shù)對(duì)溫度耐受力強(qiáng)的蛋白質(zhì)和酶，可提高溫度使雜蛋白變性，有利于提取和下一步的純化。2有機(jī)溶劑提取 一些和脂類(lèi)結(jié)合比較結(jié)實(shí)或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的有機(jī)溶劑提取。常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等。 其中正丁醇在0時(shí)在水中的溶解度為10.5，40時(shí)為6.6，同時(shí)又器具有較強(qiáng)的親脂性，因此常用

12、來(lái)提取與脂結(jié)合較牢或含非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)、酶和脂類(lèi)。 三、生物大分子的分別純化 1. 沉淀法 沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過(guò)程。沉淀法即溶解度法操作簡(jiǎn)便，本錢(qián)低廉，不僅用于實(shí)驗(yàn)室中，也用于某些消費(fèi)目的的制備過(guò)程，是分別純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時(shí)最常用的方法。經(jīng)過(guò)沉淀，將目的生物大分子轉(zhuǎn)入固相沉淀或留在液相，而與雜質(zhì)得到初步的分別。在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法是： 中性鹽沉淀鹽析法：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分別純化。 蛋白質(zhì)和酶均易溶于水，由于這些分子的COOH、NH2和OH都是親水基團(tuán)，這些基團(tuán)與極性水分子相互作用構(gòu)成水化層，包圍于蛋白質(zhì)分子周?chē)鷺?gòu)成1nm10

13、0nm顆粒的親水膠體，減弱了蛋白質(zhì)分子之間的作用力，蛋白質(zhì)分子外表極性基團(tuán)越多，水化層越厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間的親和力越大，因此溶解度也越大。親水膠體在水中的穩(wěn)定要素有兩個(gè)：即電荷和水膜。由于中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)和酶分子的親水性，所以參與大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴顯露疏水區(qū)域，同時(shí)又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即構(gòu)成沉淀。 鹽析的操作方法 最常用的是固體硫酸銨參與法。欲從較大體積的粗提取液中沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，往往運(yùn)用固體硫酸銨，參與之前要先將其研成細(xì)粉不能有塊，要在攪拌下緩慢均勻少量多次地參與，尤其到接近方案飽和度時(shí)，加鹽的速度更要慢一些，盡量防止部分硫酸銨濃度

14、過(guò)大而呵斥不應(yīng)有的蛋白質(zhì)沉淀。鹽析后要在冰浴中放置一段時(shí)間，待沉淀完全后再離心與過(guò)濾。在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分別，高濃度硫酸銨常用過(guò)濾方法，由于高濃度硫酸銨密度太大，要使蛋白質(zhì)完全沉降下來(lái)需求較高的離心速度和較長(zhǎng)的離心時(shí)間。 有機(jī)溶劑沉淀： 多用于蛋白質(zhì)和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分別純化。 選擇性沉淀熱變性沉淀和酸堿變性沉淀： 多用于除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。 等電點(diǎn)沉淀： 用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉淀，但此法單獨(dú)運(yùn)用較少，多與其他方法結(jié)合運(yùn)用。 有機(jī)聚合物沉淀： 是開(kāi)展較快的一種新方法， 主要運(yùn)用PEG聚乙二醇Polyethyene glycol

15、作為沉淀劑。 未得到充分的證明解釋主要有：以為沉淀作用是聚合物與生物大分子發(fā)生共沉淀作用。由于聚合物有較強(qiáng)的親水性，使生物大分子脫水而發(fā)生沉淀。聚合物與生物大分子之間以氫鍵相互作用構(gòu)成復(fù)合物，在重力作用下構(gòu)成沉淀析出。經(jīng)過(guò)空間位置排斥，使液體中生物大分子被迫擠聚在一同而發(fā)生沉淀。 本方法的優(yōu)點(diǎn)是：操作條件溫暖，不易引起生物大分子變性。沉淀效能高，運(yùn)用很少量的PEG即可以沉淀相當(dāng)多的生物大分子。沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。2. 分別純化方法的選擇 生物大分子能否高效率地制備勝利，關(guān)鍵在于分別純化方案的正確選擇和各個(gè)分別純化方法實(shí)驗(yàn)條件的探求。選擇與探求的根據(jù)就是生物大分子與雜質(zhì)之間的生物學(xué)和物理化

16、學(xué)性質(zhì)上的差別。 制備生物大分子的方法可以粗略地分類(lèi)如下： 以分子大小和形狀的差別為根據(jù)的方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過(guò)濾等。 以溶解度的差別為根據(jù)的方法：鹽析、萃取、分配層析、選擇性沉淀和結(jié)晶等。 以電荷差別為根據(jù)的方法：電泳、電滲析、等電點(diǎn)沉淀、吸附層析和離子交換層析等。 以生物學(xué)功能專(zhuān)注性為根據(jù)的方法：親和層析等。 從動(dòng)物胰臟中提取胰蛋白酶時(shí)，普通是用稀酸溶液將胰腺細(xì)胞中含有的酶原提取出來(lái)，然后再根據(jù)等電點(diǎn)沉淀的原理，調(diào)理pH以沉淀除去大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質(zhì)，再以硫酸銨分級(jí)鹽析將胰蛋白酶原等包括大量糜蛋白酶原和彈性蛋白酶原沉淀析出。經(jīng)溶解后，以極少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌该拥鞍酌负蛷椥缘鞍酌竿瑫r(shí)也被激活，被激活的酶溶液再以鹽析分級(jí)的方法除去糜蛋白酶及彈性蛋白酶等組分。搜集含胰蛋白酶的級(jí)分，并用結(jié)晶法進(jìn)一步分別純化。普通經(jīng)過(guò)23次結(jié)晶后，可獲得相當(dāng)純的胰蛋白酶，其比活力可到達(dá)800010000BAEE單位/毫克蛋白，或更高。胰蛋白酶制備根本原理一、試劑pH2.5乙酸酸化水；硫酸銨。 二、資料新穎或冰凍動(dòng)物胰臟 豬胰蛋白酶原的提取 1.稱(chēng)取適量動(dòng)物胰