分子生物學實驗技術核酸的凝膠電泳PPT學習教案

1、會計學1分子生物學實驗技術核酸的凝膠電泳分子生物學實驗技術核酸的凝膠電泳第1頁/共42頁第2頁/共42頁Home第3頁/共42頁第4頁/共42頁第5頁/共42頁第6頁/共42頁（二）（二）DNA的遷移速率決定因素的遷移速率決定因素第7頁/共42頁第8頁/共42頁第9頁/共42頁第10頁/共42頁 瓊脂糖類型瓊脂糖類型凝結(jié)溫度凝結(jié)溫度/熔化溫度熔化溫度/ 標準瓊脂糖標準瓊脂糖35389095不同廠家不同廠家生產(chǎn)的不生產(chǎn)的不同商品其同商品其凝結(jié)溫度凝結(jié)溫度和熔化溫和熔化溫度有一定度有一定差異差異40428590 高強度瓊脂糖高強度瓊脂糖34438595 修飾的低熔點修飾的低熔點/ 凝點瓊脂糖凝點瓊

2、脂糖253563653565 超低熔點超低熔點8154045 低黏性低熔點瓊低黏性低熔點瓊脂糖脂糖25307038853075第11頁/共42頁濃濃 度度（%）標標 準準(kb)高強度高強度(kb)低熔點低熔點(kb)低黏度低低黏度低溶點溶點(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.481.20.1560.370.371.50.0840.240.242.00.130.133.00.0510.514.00.10.56.00.010.1第12頁/共42頁 7 7 電泳緩沖液電泳緩沖液 常用的有常用的有TAETAE、TPETPE及及TBET

3、BE第13頁/共42頁 都是常用電泳緩沖液。三者相比：都是常用電泳緩沖液。三者相比：1 1）TAETAE的緩沖容量最低，如長時間電泳會被消耗，此時的緩沖容量最低，如長時間電泳會被消耗，此時凝膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化；凝膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化；2 2）TBETBE和和TPETPE比比TAETAE花費稍貴，但有高得多的緩沖容量；花費稍貴，但有高得多的緩沖容量；3 3）雙鏈線狀雙鏈線狀DNADNA片段在片段在TAETAE中比在中比在TBETBE或或TPETPE中遷移快中遷移快10%10%；4 4）對于高分子質(zhì)量的對于高分子質(zhì)量的DNADNA，TAETAE的分辨率略高于的分辨率略高于TBETBE或或

4、TPETPE，對于低分子質(zhì)量的，對于低分子質(zhì)量的DNADNA，TAETAE要差些。超螺旋要差些。超螺旋DNADNA在在TAETAE中的電泳分辨率要好于中的電泳分辨率要好于TBETBE。 第14頁/共42頁載樣緩沖液：載樣緩沖液：臨上樣到臨上樣到凝膠加樣孔凝膠加樣孔之前與待之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。電泳的樣品相混合的一種緩沖液。載樣緩沖液有三個作用：載樣緩沖液有三個作用：1 1）增加樣品密度保證）增加樣品密度保證DNADNA沉入加樣孔內(nèi)；沉入加樣孔內(nèi)；2 2）使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程；）使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程；3 3）其中的染料在電場中以可以預測的泳動）其中的染料在電場

5、中以可以預測的泳動速率向陽極遷移。速率向陽極遷移。第15頁/共42頁類型類型6 緩沖液緩沖液貯存溫度貯存溫度I0.25%溴酚藍溴酚藍40.25%二甲苯氰二甲苯氰FF40% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍溴酚藍室溫室溫0.25%二甲苯氰二甲苯氰FF15% Ficoll(Type400)水溶液水溶液III0.25%溴酚藍溴酚藍40.25%二甲苯氰二甲苯氰FF30%甘油水溶液甘油水溶液IV0.25%溴酚藍溴酚藍440% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液第16頁/共42頁 通過染色通過染色, 紫外燈下檢測。紫外燈下檢測。 主要有溴化乙錠（主要有溴化乙錠（ethidium bromid

6、e, EB）染色法和）染色法和SYBR Gold染色法。染色法。第17頁/共42頁第18頁/共42頁第19頁/共42頁第20頁/共42頁第21頁/共42頁第22頁/共42頁第23頁/共42頁第24頁/共42頁 可以用透射或入射紫外光對可以用透射或入射紫外光對EBEB染色的凝膠染色的凝膠成像，圖像可以直接輸出到計算機觀察。成像，圖像可以直接輸出到計算機觀察。第25頁/共42頁現(xiàn)一般采用試劑盒回收：現(xiàn)一般采用試劑盒回收： 存在的主要問題：存在的主要問題：1 1 不能有效的回收大片段不能有效的回收大片段DNA DNA 2 2 不能有效回收少量不能有效回收少量DNA DNA Home第26頁/共42頁

7、第27頁/共42頁第28頁/共42頁酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度。酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度。（一）（一） 聚丙烯酰胺凝膠的本質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠的本質(zhì)第29頁/共42頁第30頁/共42頁第31頁/共42頁第32頁/共42頁丙烯酰胺濃度丙烯酰胺濃度（%）有效分離范圍有效分離范圍（bp）二甲苯氰二甲苯氰FF溴酚藍溴酚藍3.5100020004601005.080500260658.0604001604512.040200702015.025150601520.061004512注注:N,N-:N,N-亞甲雙丙烯酰胺的濃度為丙烯酰胺的亞甲雙丙烯酰胺的濃度為丙烯酰胺的1/301/30; ; Home第33頁/共42頁第34頁/共42頁第35頁/共42頁第36頁/共42頁B+A-+A-B脈沖電場電泳示意圖脈沖電場電泳示意圖第37頁/共42頁第38頁