班謙2親子鑒定

1、親親 子子 鑒鑒 定定概述概述親權(quán)鑒定親權(quán)鑒定（identification in disputed paternity）：）：是指應(yīng)用醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、人類學(xué)及其他自然科學(xué)的理論和技術(shù)，主要通過人類遺傳標(biāo)記的檢測與分析，對(duì)被檢者之間是否存在生物學(xué)親緣關(guān)系所作的科學(xué)判定。適用對(duì)象：適用對(duì)象： 親子鑒定親子鑒定 同胞間同胞間 隔代直系間隔代直系間 旁系個(gè)體（叔侄、姨甥等）間旁系個(gè)體（叔侄、姨甥等）間第十二章第十二章 親子鑒定親子鑒定歷史：歷史： 滴骨法滴骨法 早在三國時(shí)期就有實(shí)例記載，是指將活人的血滴在死人的骨頭上，觀察是否滲入，如能滲入則表示有父母子女兄弟等血統(tǒng)關(guān)系。 合血法合血法 大約出現(xiàn)在明代

2、，是指雙方都是活人時(shí)，將兩人刺出的血滴在器皿內(nèi)，看是否凝為一體，如凝為一體就說明存在親子兄弟關(guān)系。影視劇中的影視劇中的“滴血認(rèn)親滴血認(rèn)親”甄嬛傳中，甄嬛被告發(fā)與太醫(yī)溫實(shí)初有奸情。滴血認(rèn)親的水碗里被摻了明礬，滴血后溫實(shí)初與皇子血液相融，甄嬛提出水有問題。尋秦記中，大殿滴血認(rèn)親一幕，穿越到古代的項(xiàng)少龍也是利用“加料”的小動(dòng)作，證明了假嬴政與秦王的親子關(guān)系。九品芝麻官結(jié)尾，惡霸常威不肯招供強(qiáng)奸戚秦氏的事實(shí)，包大人掉包讓其與自己兒子滴血認(rèn)親，兩滴血相融，騙得常威招供。ABO血型血清型、酶型、HLA等DNA指紋圖PCR技術(shù)VNTRSTRSNP現(xiàn)代醫(yī)學(xué)鑒定技術(shù)：現(xiàn)代醫(yī)學(xué)鑒定技術(shù)：一、親子鑒定的應(yīng)用一、親子

3、鑒定的應(yīng)用1.涉及民事糾紛的親子鑒定（1）解決家庭糾紛：通常是丈夫懷疑孩子不是自己親生的；（2）確認(rèn)責(zé)任關(guān)系：非婚生子女撫育責(zé)任及財(cái)產(chǎn)繼承；（2）解決醫(yī)療糾紛：懷疑醫(yī)院換錯(cuò)嬰兒或試管嬰兒配子錯(cuò)配。2.涉及刑事訴訟的親子鑒定（1）強(qiáng)奸致孕案對(duì)兒童（或胎兒）親生父親的確定；（2）無名尸體、失蹤人員及身源不明者身源的認(rèn)定；（3）殺嬰、拐騙兒童等案件中孩子身源的認(rèn)定。3.涉及行政事務(wù)的親子鑒定（1）移民涉外公證；（2）失散親人親緣關(guān)系的認(rèn)定；（3）計(jì)劃外生育責(zé)任人的確認(rèn)及其無合法出生證明子女戶籍的注冊(cè)。第十二章第十二章 親子鑒定親子鑒定 以上各類親子鑒定例中，尤以母子關(guān)系確定，要求判斷爭議父親和子女間

4、是否存在親子關(guān)系的最為常見，這類親子鑒定又稱為父權(quán)鑒定（paternity testing）。 二、親子鑒定的依據(jù)二、親子鑒定的依據(jù)親子鑒定的依據(jù)非遺傳特征受單一基因座等位基因控制受多基因座共同控制，同時(shí)還受環(huán)境、營養(yǎng)狀態(tài)、疾病等非遺傳因素影響遺傳特征 廣義的血型是指由遺傳決定的人類血液的個(gè)體差異，包括紅細(xì)胞血型、白細(xì)胞血型、血小板型、血清蛋白型和酶型等。 個(gè)體間遺傳差異的本質(zhì)是編碼基因產(chǎn)物的DNA分子結(jié)構(gòu)在不同個(gè)體或等位基因之間存在差異，稱為DNA多態(tài)性。應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)鑒定的遺傳標(biāo)記大致可作如下分類：應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)鑒定的遺傳標(biāo)記大致可作如下分類：遺傳標(biāo)記基因產(chǎn)物水平遺傳標(biāo)記DNA水平遺傳標(biāo)記細(xì)胞

5、表面的遺傳標(biāo)記平遺傳標(biāo)記 （紅細(xì)胞血型、白細(xì)胞血型、血小板型等）蛋白質(zhì)的遺傳標(biāo)記（血清型、紅細(xì)胞酶型、血清酶型、唾液型等）DNA序列多態(tài)性DNA長度多態(tài)性三、親子鑒定的原理三、親子鑒定的原理 親子鑒定主要是通過檢測個(gè)體的遺傳標(biāo)記，并根據(jù)遺傳規(guī)律分析個(gè)體間遺傳標(biāo)記檢驗(yàn)結(jié)果是否符合遺傳規(guī)律，從而判定被檢者之間是有具有生物學(xué)的親緣關(guān)系。（一）孟德爾遺傳規(guī)律（一）孟德爾遺傳規(guī)律 位于常染色體上的決 定某種性狀的基因或 DNA遺傳標(biāo)記，按照 孟德爾遺傳定律遺傳。 在一個(gè)具體家庭中，決定某一性狀的基因在親代和子代之間傳遞的規(guī)律是：孩子的一對(duì)等位基因必定是一個(gè)來自父親，一個(gè)來自母親；孩子不可能帶有雙親均沒有

6、的等位基因；除非父母雙方均有同一基因，否則子女不會(huì)是純合子；父母之一若是純合子，則子女必得其一。第十二章第十二章 親子鑒定親子鑒定圖12-1 孟德爾遺傳規(guī)律示意圖 根據(jù)上述遺傳規(guī)律，在排除遺傳變異和分型錯(cuò)誤的前提下，鑒定親子關(guān)系的基本原理可以歸納為以下兩點(diǎn)： 1在肯定某個(gè)基因必需來自生父，而假設(shè)父親并不具有這個(gè)基因的情況下，可以排除其親子關(guān)系； 2在肯定某個(gè)基因必需來自生父，而假設(shè)父具有這個(gè)基因的情況下，不能排除其親子關(guān)系。血型組合血型組合生父基因生父基因可以排除父權(quán)可以排除父權(quán)不能排除父權(quán)不能排除父權(quán)母親母親 孩子孩子a a a aab ba a、a ba a a bba ab b、a ba

7、 b a aab ba a、a bb b b bba abb、abb b a bab ba a、a ba b b bba ab b、a ba b a ba、ba a、b b、a b表表12-1 根據(jù)遺傳標(biāo)記判定父權(quán)根據(jù)遺傳標(biāo)記判定父權(quán)（二）非孟德爾遺傳規(guī)律（二）非孟德爾遺傳規(guī)律1. 男性伴性遺傳男性伴性遺傳 Y染色體非重組部分以單倍型的方式由男性親代穩(wěn)定地直接傳給男性子代中，即男性伴性遺傳。 在母親不能參加的父子間的單親鑒定、隔代、同胞間親緣關(guān)系的鑒定及性犯罪案件中的個(gè)人識(shí)別中都具有非常重要的作用。2. 核外遺傳核外遺傳 線粒體DNA（mitochondrial，mtDNA）是人類唯一的核外基

8、因組DNA，它主要通過卵細(xì)胞將遺傳信息傳給子代，同一母系后代的mtDNA在排除變異的前提下是一致的。 在父親不能參加鑒定的母子間的單親鑒定，以及母系同胞間或隔代或旁系個(gè)體間的親緣關(guān)系鑒定中具有重要意義。親子鑒定常用的遺傳標(biāo)記親子鑒定常用的遺傳標(biāo)記一、基因產(chǎn)物水平的遺傳標(biāo)記一、基因產(chǎn)物水平的遺傳標(biāo)記1.表現(xiàn)為簡單的遺傳性狀，其遺傳方式經(jīng)家系調(diào)查已明確；2.具有遺傳多態(tài)性，基因頻率分布較均勻，父權(quán)排除率高；3.在相應(yīng)地區(qū)、民族中的群體遺傳數(shù)據(jù)已建立；4.血型個(gè)體發(fā)生早，不易受年齡、疾病及其他因素影響；5.檢驗(yàn)方法操作簡單，重復(fù)性好，結(jié)果明確可靠。（一）紅細(xì)胞血型（一）紅細(xì)胞血型 紅細(xì)胞血型是指由遺

9、傳決 定的紅細(xì)胞表面抗原的差異。1. ABO血型血型 ABO血型是最早被發(fā)現(xiàn)的人類血型系統(tǒng)，在輸血、器官移植、人類遺傳學(xué)及法醫(yī)學(xué)研究中具有重要意義。 用已知標(biāo)準(zhǔn)抗血清測定紅細(xì)胞上的抗原（正試驗(yàn)），或用已知標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞測定血清中的抗體（反試驗(yàn)），可以確定ABO血型的四種普通型：即A型、B型、AB型和O型。表12-2 ABO血型抗原、抗體組成已知抗體已知抗體標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞分分 型型抗抗-A抗抗-BA型型B型型被檢紅細(xì)胞被檢血清A型B型AB型O型表表12-3 ABO血型的分型血型的分型 ABO基因座位于人類第9號(hào)染色體（9q34），主要有A、B和O三個(gè)等位基因，A和B為共顯性，A、B對(duì)O為顯性，

10、O為隱性。 ABO血型抗原決定簇是多糖，它們并不是基因的直接產(chǎn)物，而是由基因表達(dá)產(chǎn)生的不同糖基轉(zhuǎn)移酶，以H物質(zhì)作為基礎(chǔ)物質(zhì)催化生成的不同糖鏈。 ABO血型抗原不僅以醇溶性糖脂類的形式存在于紅細(xì)胞及其他組織細(xì)胞上，也可以水溶性糖蛋白的形式存在于部分人的血清、精液、唾液等體液與分泌液中。因此，也可以通過對(duì)上述樣品的檢測判定ABO血型。2. MN血型血型 M抗原與N抗原是Landsteiner等（1927年）用人紅細(xì)胞免疫家兔制備特異性抗血清時(shí)發(fā)現(xiàn)的，是第二個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類血型系統(tǒng)。 以糖蛋白的形式存在于紅細(xì)胞膜表面上， 用已知抗-M、抗-N抗體檢測未知的紅細(xì)胞抗原，根據(jù)凝集反應(yīng)分為M型、N型和MN型

11、3種表型。 MN基因座位于第4號(hào)染色體（4q28-31)上，M、N兩個(gè)等位基因符合常染色體共顯性遺傳。3. Rh血型血型 Rh血型是最為復(fù)雜的人類血型之一，5種常見抗原D、C、c、E、e構(gòu)成18種表型。 其中RhD抗原具有很強(qiáng)的免疫原性，在輸血、新生兒溶血和母兒妊娠不合中具有重要的意義，因此臨床上則根據(jù)RhD抗原的有無分為RhD（+）和RhD（-）兩種型。 RhCE基因座的四種等位基因RhCE、RhCe、Rhce、Rhce屬常染色體共顯性遺傳。 Rh血型抗原為膜內(nèi)鑲嵌蛋白，相應(yīng)的Rh抗體多為不完全抗體。因此，常用抗人球蛋白試驗(yàn)（Coombstest）鑒定Rh血型。（二）血清蛋白型（二）血清蛋白

12、型 血清蛋白型（The polymorphism of serum protein）又稱血清型（Serum types），是指由遺傳決定的人血清中存在的同一種蛋白質(zhì)的個(gè)體差異，表現(xiàn)為氨基酸排列順序的差別，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和立體構(gòu)象的不同。 親子鑒定常用的血清型系統(tǒng)有：結(jié)合珠蛋白（HP）型、維生素D結(jié)合蛋白（Gc）型、1-抗胰蛋白酶（Pi）型、轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）型、間-胰蛋白酶抑制劑（ITIH1）型和補(bǔ)體成分等。（三）紅細(xì)胞酶型（三）紅細(xì)胞酶型 紅細(xì)胞酶型亦即紅細(xì)胞的同工酶多態(tài)性，是指由遺傳基因決定的、具有相同催化活性的酶分子一級(jí)結(jié)構(gòu)在同一種屬不同個(gè)體間的遺傳差異。 親子鑒定常用的紅細(xì)胞酶

13、型有：紅細(xì)胞酸性磷酸酶（EAP）型、酯酶D（ESD）型、葡糖磷酸變位酶1（PGM1）型、乙二醛酶I（GLOI）型和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）型等。（四）白細(xì)胞血型（四）白細(xì)胞血型 人類白細(xì)胞膜上存在著三類不同的抗原：紅細(xì)胞血型抗原（ABH、Lea和Leb等）、白細(xì)胞本身特有抗原（CD4和CD8等）及代表個(gè)人特異性且與其他組織共有的同種抗原人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）又稱為移植抗原（transplantation antigen）或組織相容性抗原（histocompatibility antigen）。 HLA系統(tǒng)是迄今發(fā)現(xiàn)的最復(fù)雜的人類遺傳標(biāo)記。HLA基因

14、定位于第6號(hào)染色體短臂（6p21.31），形成一組緊密連鎖的基因群，稱為主要組織相容性復(fù)合體。 HLA-類抗原是一種膜糖蛋白，主要包括HLA-A、B和C基因的產(chǎn)物，由一條重鏈和一條輕鏈構(gòu)成。該類抗原分布廣泛，存在于所有有核細(xì)胞，并以可溶性方式存在于自身血清或初乳中。 HLA-類抗原主要包括DR、DQ、DP等基因座的產(chǎn)物，由和兩條糖蛋白鏈構(gòu)成。該類抗原的組織分布比HLA-類抗原少得多，主要表達(dá)在如B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其它抗原遞呈細(xì)胞的表面。 HLA的遺傳特征： 共顯性遺傳 單倍型遺傳 連鎖不平衡 HLA抗原分型主要應(yīng)用微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)和混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)兩種方法。二、二、DNA水平的遺傳標(biāo)記水平的

15、遺傳標(biāo)記（一）（一）DNA的結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)構(gòu)與功能由4種脫氧核糖核酸（簡稱核苷酸）通過磷酸二酯鍵聚合而成的多核苷酸鏈。絕大部分（98%）DNA存在于細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)中。以堿基配對(duì)的原則（A與T，G與C）通過氫鍵彼此相連。極少部分DNA存在于核外線粒體中。生物體的遺傳信息表現(xiàn)為DNA分子中核苷酸的排列順序，并以密碼子的形式編碼在DNA分子上。（二）（二）DNA多態(tài)性的分子學(xué)基礎(chǔ)多態(tài)性的分子學(xué)基礎(chǔ)DNA多態(tài)性是指DNA區(qū)域中等位基因（或片段）存在兩種或兩種以上形式，其本質(zhì)是生物體在進(jìn)化過程中DNA的核苷酸排列順序改變的結(jié)果。DNA多態(tài)性可分為長度多態(tài)性和序列多態(tài)性。1、長度多態(tài)性（length p

16、olymorphism） DNA長度多態(tài)性是指在兩條同源染色體上，同源DNA片段的核苷酸排列數(shù)量存在的個(gè)體差異。DNA長度多態(tài)性是由于片段插入、缺失或重復(fù)序列數(shù)目變異所致。散在重復(fù)序列：單拷貝DNA序列以其單體形式散在地分布于整個(gè)基因組中稱為散在重復(fù)序列。 串聯(lián)重復(fù)序列：具有特定的重復(fù)單位，各重復(fù)單位頭尾相連形成的重復(fù)序列稱為串聯(lián)重復(fù)序列，又稱為衛(wèi)星DNA。 倒位重復(fù)序列 重復(fù)單位是互補(bǔ)序列，并在同一條DNA鏈上呈反向排列的重復(fù)序列稱為倒位重復(fù)序列。小衛(wèi)星小衛(wèi)星DNA（Minisatellite DNA）：）：是由許多長度為670bp的串聯(lián)重復(fù)單位組成的DNA序列，又稱為可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（

17、Variable Number of Tandem Repeats，VNTRs）。這類重復(fù)可能源于減數(shù)分裂期間的同源染色體或染色體內(nèi)部的不對(duì)等交換。同一小衛(wèi)星的各個(gè)重復(fù)單位內(nèi)含有一個(gè)約1015bp長的保守序列，即核心序列；不同的小衛(wèi)星DNA之間其核心序列有極高的同源性。小衛(wèi)星DNA重復(fù)單位的重復(fù)數(shù)目遵循孟德爾遺傳規(guī)律遺傳。圖12-2 DNA指紋圖的應(yīng)用微衛(wèi)星微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA）：）：是一類更簡單的寡核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列，重復(fù)單位為27bp，重復(fù)次數(shù)在1060次左右，又被稱為短串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandem Repeats, STR）。微衛(wèi)星DNA的產(chǎn)生主要

18、是DNA復(fù)制過程中滑動(dòng)，或DNA復(fù)制和修復(fù)時(shí)滑動(dòng)鏈與互補(bǔ)鏈堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致一個(gè)或幾個(gè)重復(fù)單位的缺失或插入。STR實(shí)質(zhì)上屬于VNTR，同樣具有極高的多態(tài)性，亦按孟德爾定律遺傳。圖12-3 短串聯(lián)重復(fù)序列結(jié)構(gòu)示意圖2. 序列多態(tài)性（序列多態(tài)性（ sequence polymorphism） DNA序列多態(tài)性指在兩條同源染色體上，同源DNA序列長度相等，但個(gè)別核苷酸存在的個(gè)體差異。 單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，稱為單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide poly-morphism，SNP）。 這種變異是由堿基的替代、插入或缺失所致。（三）（三）DNA多態(tài)性的檢測技術(shù)多態(tài)性的檢

19、測技術(shù)1. DNA指紋技術(shù)指紋技術(shù) DNA指紋（DNA fingerprint）是指將人類基因組DNA用特定的限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)電泳分離、薩森印跡轉(zhuǎn)移，然后用已知序列小衛(wèi)星DNA探針根據(jù)堿基互補(bǔ)原則與未知基因組DNA雜交，所顯示出的由一系列不等距離、相互間隔的多條電泳譜帶組成的高度多態(tài)性圖譜。 圖譜中的每一條譜帶代表一個(gè)特定長度的DNA片段，不同個(gè)體之間的差異在圖譜中主要表現(xiàn)為譜帶位置、數(shù)目和密度強(qiáng)弱的差異。 DNA指紋的實(shí)質(zhì)是基因組DNA的限制性片段長度多態(tài)性，它的個(gè)體特異性取決于所用限制酶的識(shí)別序列特異性和探針的特異性。圖12-4 DNA指紋圖基本實(shí)驗(yàn)流程（1）DNA指紋的基本操作過程

20、指紋的基本操作過程 限制性核酸內(nèi)切酶（限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonucleaese, RE）：）：又簡稱限制酶或內(nèi)切酶，是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在特定部位以內(nèi)切方式水解DNA鏈的核酸水解酶。 這種由于DNA限制酶識(shí)別的序列核苷酸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶切位點(diǎn)的產(chǎn)生、消失或移位，酶切所產(chǎn)生的限制性片段數(shù)目和長度改變所呈現(xiàn)的DNA多態(tài)現(xiàn)象稱為限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment polymorphisms, RFLP）。 分子雜交是特異性探針與待測DNA 多態(tài)片段在復(fù)性條件下形成穩(wěn)定異 源DNA雙鏈的過程。 DNA指紋的探針有兩類

21、：多位點(diǎn)探針（multi-locus probe，MLP）和單位點(diǎn)探針（single-locus probe，SLP），前者指在低強(qiáng)度雜交條件下可同時(shí)檢測基因組DNA中多個(gè)VNTR位點(diǎn)的探針，多位點(diǎn)探針檢測得到的DNA 圖譜稱為DNA指紋，后者指在高強(qiáng)度雜交條件下，只檢測出基因組DNA中單個(gè)VNTR多態(tài)片段的探針，單位點(diǎn)探針檢測得到的DNA圖譜稱為DNA紋印。（2）DNA指紋的基本特征指紋的基本特征 1）體細(xì)胞穩(wěn)定性 2）個(gè)體高度特異性 3）按孟德爾遺傳規(guī)律遺傳2. 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction PCR）技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一

22、種快速的體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，是依賴于靶DNA序列側(cè)翼上所結(jié)合的兩個(gè)寡核苷酸引物在體外由DNA聚合酶催化合成特異性DNA片段的方法。具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單、快速等優(yōu)點(diǎn)。在耐熱DNA聚合酶作用下，以一對(duì)特異性序列DNA短片段作為引物，利用加熱和冷卻交替的循環(huán)程序，有選擇性地放大基因組內(nèi)某一小區(qū)段。第十二章第十二章 親子鑒定親子鑒定（1）PCR技術(shù)由3個(gè)基本反應(yīng)組成的循環(huán)過程： 1）變性； 2）退火； 3）延伸。（2）反應(yīng)體系： 1）模板DNA 2）引物 3）Taq DNA聚合酶 4）dNTP 5）反應(yīng)緩沖系統(tǒng)圖12-5 PCR循環(huán)示意圖 PCR引物的設(shè)計(jì)應(yīng)考慮下列原則：引物的設(shè)

23、計(jì)應(yīng)考慮下列原則：引物的特異性要好，與非特異擴(kuò)增序列的同源性不能超過70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源，特別是3端與模板DNA一定要配對(duì)；引物的長度要適當(dāng)，一般以1530bp為宜。引物過短會(huì)使特異性降低，過長則增加成本，并降低特異性；引物的堿基組成分布盡可能隨機(jī)，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶的堆積，G+C的含量宜在45%55%；引物自身不應(yīng)有互補(bǔ)序列，防止疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；兩引物間不應(yīng)有互補(bǔ)序列，以防引物二聚體的形成，尤應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊。1）適宜的變性條件是95/30s。變性不完全往往是PCR失敗的常見原因。2）退火的溫度和所需時(shí)間的長短取決于引物的堿基組成、長度、濃度與模板DNA的匹配程度。一般退火溫度比

24、引物的Tm值約低5。退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性也越高，但擴(kuò)增效率下降；降低退火溫度雖可以提高擴(kuò)增產(chǎn)物量，但引物延伸的錯(cuò)配堿基會(huì)增加。3）延伸溫度通常在7275之間，此時(shí)Taq DNA聚合酶具有最高活性。1分鐘延伸1kb。4）循環(huán)次數(shù)一般2530次比較合適。循環(huán)次數(shù)過多，易引起非特異產(chǎn)物量的增加。 （3）反應(yīng)參數(shù)）反應(yīng)參數(shù) 1）AMP-FLP技術(shù)：技術(shù)：擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AMP-FLP）系指不同個(gè)體基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的DNA片段長度不同而形成的遺傳多態(tài)性，其多態(tài)性主要來自基因組中小衛(wèi)星或微衛(wèi)星位點(diǎn)。短串

25、聯(lián)重復(fù)序列（STR）是當(dāng)前法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最為廣泛應(yīng)用的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)。STR位點(diǎn)的突出特點(diǎn)是基因座多，片段短，多態(tài)性高，在個(gè)人識(shí)別與親權(quán)鑒定中實(shí)用價(jià)值極高；其次不同STR位點(diǎn)的擴(kuò)增片段長度相差不大，為多個(gè)STR位點(diǎn)的復(fù)合擴(kuò)增創(chuàng)造了條件。 （4）擴(kuò)增產(chǎn)物分析）擴(kuò)增產(chǎn)物分析復(fù)合復(fù)合PCR擴(kuò)增技術(shù)（擴(kuò)增技術(shù)（multiplex PCR） 提高了個(gè)人識(shí)別能力，又能節(jié)約檢材，縮短檢測時(shí)間，減少成本消耗，尤其適用于法醫(yī)學(xué)鑒定。 避免基因連鎖 可以在同一擴(kuò)增體系和相同的反應(yīng)條件下擴(kuò)增 等位基因片段長 度范圍互不重疊圖12-6 復(fù)合擴(kuò)增示意圖2）PCR-ASO技術(shù)技術(shù)：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后，用等位基因特異性寡核苷

26、酸（Allele Specific Oligonucleotide，ASO）探針進(jìn)行雜交，然后依據(jù)探針標(biāo)記物（同位素、酶或生物素）進(jìn)行顯譜。3）AS-PCR技術(shù)：技術(shù)：等位基因特異性PCR（Allele Specific PCR）技術(shù)是根據(jù)等位基因中某一堿基的差異，設(shè)計(jì)一系列3端第一個(gè)堿基分別與各等位基因的特異性堿基相匹配且長度各不相同的引物，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。引物3端末位堿基必須與模板DNA堿基互補(bǔ)才能進(jìn)行DNA擴(kuò)增，通過擴(kuò)增產(chǎn)物長度的分析，便可簡單地進(jìn)行等位基因分型。圖12-7 AS-PCR原理示意圖4）PCR-SSP技術(shù)：技術(shù)：是根據(jù)等位基因中某一堿基的差異，設(shè)計(jì)一系列3端第一個(gè)堿基分別與各

27、等位基因的特異性堿基相匹配的序列特異性引物（Sequence Specific Primer，SSP），進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。引物3端末位堿基必須與模板DNA堿基互補(bǔ)才能進(jìn)行DNA擴(kuò)增，通過擴(kuò)增產(chǎn)物是有無可簡單地進(jìn)行特異性等位基因。圖12-8 PCR-SSP示意圖5）PCR-RFLP技術(shù)：技術(shù)：選擇能夠識(shí)別靶DNA序列中特定堿基序列的限制性核酸內(nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，由于不同個(gè)體擴(kuò)增產(chǎn)物堿基序列的差異，導(dǎo)致酶切位點(diǎn)產(chǎn)生或消失，消化后DNA片段的數(shù)目和長度不同。通過電泳分離，根據(jù)電泳譜帶的位置和數(shù)目可判定基因型。6）MVR-PCR技術(shù)：技術(shù)：即小衛(wèi)星變異做圖（Minisatellite variant

28、 repeat mapping）圖12-9 PCR-RFLP示意圖三、親子鑒定效能的評(píng)估三、親子鑒定效能的評(píng)估 父權(quán)排除概率（父權(quán)排除概率（excluding probability of paternity，EPP）：）：又稱非父排除概率（probability of excluding paternity，PEP）是指通過某一個(gè)遺傳標(biāo)記系統(tǒng)的檢測，將不是生父的被控父親排除的概率，即在所有非父被控為生父的男子中，用遺傳標(biāo)記否定父權(quán)有多大的可能性。（一）常染色體遺傳標(biāo)記的（一）常染色體遺傳標(biāo)記的EPP1. 一個(gè)顯性基因和一個(gè)隱性基因決定的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)（如P血型、分泌型等） EPP = pq42

29、. 兩個(gè)共顯性等位基因決定的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)（如 MN 型、Hp型、ESD型等） EPP = pq(1-pq) 3. 兩個(gè)顯性基因和一個(gè)隱性基因決定的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)（如ABO型） EPP = p(1-p)4 + q(1-q)4 + pqr2(p+q)+ 2pqr24. 三個(gè)共顯性等位基因決定的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)（如Gc、Tf c和 Pi M亞型等） EPP = (p2+q2+r2)2 (p5+q5+r5)+ 6pqr + 4pqr(p2+q2+r2)5. 多個(gè)共顯性等位基因決定的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，目前常用的DNA遺傳標(biāo)記，如STR一個(gè)基因座有多個(gè)共顯性等位基因，用n表示共顯性等位基因數(shù)設(shè)pi和pj分別表示群體

30、中第i個(gè)和第j個(gè)等位基因頻率，并且等位基因i不等于等位基因j，其非父排除率為：（二）性染色體遺傳標(biāo)記系統(tǒng)的（二）性染色體遺傳標(biāo)記系統(tǒng)的EPP 1. Y染色體遺傳標(biāo)記系統(tǒng) 式中n表示基因座的等位基因數(shù)，pi表示第i個(gè)等位基因頻率。 2. X染色體遺傳標(biāo)記系統(tǒng) 由于X染色體的遺傳特點(diǎn)是女孩可以否定父權(quán)或母權(quán)，男孩只能否定母權(quán)。母女關(guān)系肯定時(shí)，否定父權(quán)概率為： （三）累積非父排除概率（三）累積非父排除概率 親子鑒定一般使用多個(gè)遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，因此求得每個(gè)遺傳標(biāo)記系統(tǒng)的非父排除概率后尚須求得多個(gè)系統(tǒng)的累積非父排除概率（cumulative chance of exclusion，CCE)。假設(shè)每個(gè)遺傳標(biāo)

31、記系統(tǒng)是互相獨(dú)立的，而不同遺傳標(biāo)記系統(tǒng)的非父排除率分別為P1、P2、P3PK，則累積非父排除率為：CCE =1-(1-P1)(1-P2)(1-P3) (1-PK) 以上式顯示，檢測的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)越多，累積非父排除率越高，排除非父的機(jī)會(huì)亦越高。 （三）累積非父排除概率（三）累積非父排除概率 親子鑒定一般使用多個(gè)遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，因此求得每個(gè)遺傳標(biāo)記系統(tǒng)的非父排除概率后尚須求得多個(gè)系統(tǒng)的累積非父排除概率（cumulative chance of exclusion，CCE)。假設(shè)每個(gè)遺傳標(biāo)記系統(tǒng)是互相獨(dú)立的，而不同遺傳標(biāo)記系統(tǒng)的非父排除率分別為P1、P2、P3PK，則累積非父排除率為： 上式顯示，檢測

32、的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)越多，累積非父排除率越高，排除非父的機(jī)會(huì)亦越高。親子鑒定結(jié)果的評(píng)估親子鑒定結(jié)果的評(píng)估一、親子鑒定的基本要求一、親子鑒定的基本要求 1、鑒定人的資格 2、鑒定機(jī)構(gòu)的條件 3、被鑒定人的要求 4、遺傳標(biāo)記系統(tǒng)的確定 5、相關(guān)統(tǒng)計(jì)參數(shù)的計(jì)算(1)(1)父權(quán)指數(shù)（父權(quán)指數(shù)（paternity indexpaternity index，PIPI）：）：又稱親子關(guān)系指數(shù)。它是假設(shè)父提供生父基因成為孩子生父的可能性與隨機(jī)男子提供生父基因成為孩子生父可能性的比值。表示假設(shè)父為孩子生父的機(jī)會(huì)比隨機(jī)男子為孩子生父的機(jī)會(huì)大多少倍，是一項(xiàng)重要評(píng)估親子關(guān)系的統(tǒng)計(jì)參數(shù)。PI值越大，表示真三聯(lián)的可能性大，PI

33、值越小，表示假三聯(lián)的可能性大。基因頻率基因頻率：是指群體中某種等位基因數(shù)目占該基因座上所有等位基因總數(shù)目的百分比。Hardy-Weinberg平衡定律：群體無限大；隨機(jī)婚配；沒有突變；沒有大規(guī)模的遷移和沒有選擇因素的影響。 群體中的基因頻率和基因型頻率在逐代傳遞中保持不變。純合子基因型的頻率為等位基因頻率的平方；雜合子基因型的頻率為等位基因頻率的乘積的2倍。（2） 父權(quán)相對(duì)機(jī)會(huì)（父權(quán)相對(duì)機(jī)會(huì)（relative chance of paternity，RCP)：又稱為父權(quán)概率（probability of patermity）是以百分比的形式來表示PI值，更符合習(xí)慣上的概率表達(dá)形式，更易看出親生關(guān)系機(jī)率的大小。二、三聯(lián)體親子鑒定的親權(quán)評(píng)估二、三聯(lián)體親子鑒定的親權(quán)評(píng)估（一）認(rèn)定親子關(guān)系（一）認(rèn)定親子關(guān)系 1PI值的計(jì)算 （1）母子關(guān)系確定的案例 （2）父母皆疑案例