(動物來源)堿性磷酸酶的提取及性質(zhì)研究

1、（動物來源）堿性磷酸酶（動物來源）堿性磷酸酶的提取及性質(zhì)研究的提取及性質(zhì)研究 主要內(nèi)容主要內(nèi)容 課題研究現(xiàn)狀課題研究現(xiàn)狀 研究方案研究方案 實驗器材及試劑配置方法實驗器材及試劑配置方法課題研究現(xiàn)狀課題研究現(xiàn)狀 堿性磷酸酶(簡稱ALP或AKP) 是一種底物專一性較低的磷酸單酯酶，廣泛存在于植物、動物和微生物體內(nèi)，是一種重要的調(diào)控酶，在生物體內(nèi)直接參與了磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝過程。 目前，國內(nèi)外學(xué)者對 ALP 進(jìn)行了廣泛的研究，包括不同物種 ALP 的結(jié)構(gòu)、催化反應(yīng)機(jī)理、理化性質(zhì)、分離純化、功能基團(tuán)、檢測方法等。課題研究現(xiàn)狀課題研究現(xiàn)狀 迄今為止，有大量關(guān)于堿性磷酸酶的報道，在1911年Levene

2、等、1912年Grosser等就已經(jīng)分離到(堿性)憐酸酯酶；直到1934年，Davis正式提出了堿性磷酸酶這一命名；1958年，Agren等運(yùn)用同位素標(biāo)記的方法分離到磷酸絲氨酸;近些年以來,很多研究者從不同動物組織中分離純化出了堿性憐酸酶，并對其部分性質(zhì)做了大量的研究。研究方案研究方案1.堿性磷酸酶的分離純化堿性磷酸酶的分離純化2.分子量測定（分子量測定（SDSPAGE）原理）原理 3.Km和和Vmax值測定值測定4.酶的固定化酶的固定化5.酶動力學(xué)研究酶動力學(xué)研究初步純化原理初步純化原理 采取有機(jī)溶劑沉淀法從豬肝勻漿液中提取、采取有機(jī)溶劑沉淀法從豬肝勻漿液中提取、分離堿性磷酸酶分離堿性磷酸酶

3、(AKP)。正丁醇能使部分雜。正丁醇能使部分雜蛋白變性，過濾除去雜蛋白即為含有蛋白變性，過濾除去雜蛋白即為含有 AKP 的濾液，的濾液，AKP 能溶于終濃度為能溶于終濃度為 33的丙酮的丙酮或或30的乙醇中，而不溶于終濃度為的乙醇中，而不溶于終濃度為50的丙酮或的丙酮或 60的乙醇中，通過離心即可得的乙醇中，通過離心即可得到初步純化的到初步純化的 AKP。 分離純化試劑分離純化試劑 （1）0.5mol/L醋酸鎂溶液：107.25g醋酸鎂溶于蒸餾水中，定容至1000ml（2）0.01mol/L醋酸鎂-0.0lmol/L醋酸鈉溶液:準(zhǔn)確吸取20ml0.5mol/L醋酸鎂溶100ml0.14mol/

4、L醋酸鈉溶液，混合后定容至1000ml（3）正丁醇、丙酮、乙醇（4）Tris-HCl ph8.8緩沖液：稱取三羥甲基氨基甲烷12.1g，用蒸餾水溶解后定容至1000ml，即為0.1mol/LTris溶液.取100ml 10.1mol/LTris溶液，加蒸餾水約780mL，再加0.1mol/L醋酸鎂溶液100ml，混勻后用1%冰醋酸調(diào)ph為8.8，用蒸餾水定容至1000ml；堿性磷酸酶的分離純化堿性磷酸酶的分離純化 取新鮮豬肝取新鮮豬肝20g20g剪碎（剪碎（0-40-4），加），加0.01mol/L0.01mol/L醋醋酸鎂酸鎂0.0lmol/L0.0lmol/L醋酸鈉醋酸鈉60ml60ml，

5、在電動勻漿機(jī)上勻，在電動勻漿機(jī)上勻漿，稱為漿，稱為A A液液 除去雜蛋白除去雜蛋白 在在A A液中加液中加10ml10ml正丁醇，用玻璃棒正丁醇，用玻璃棒攪拌攪拌3-53-5分鐘后，室溫放置分鐘后，室溫放置20min40min20min40min。四層紗。四層紗布過濾后，離心布過濾后，離心30min30min，2500r/min2500r/min，取上清液，取上清液，放入干燥潔凈離心管放入干燥潔凈離心管1 1 除去脂肪除去脂肪 在離心管在離心管1 1中加等體積的冷丙酮（中加等體積的冷丙酮（- -1010）混勻，冰凍離心）混勻，冰凍離心5 5分鐘（分鐘（25002500轉(zhuǎn)），棄去上轉(zhuǎn)），棄去上清

6、液，在沉淀中加清液，在沉淀中加0.5moL/l0.5moL/l醋酸鎂醋酸鎂20ml20ml，充分?jǐn)?，充分?jǐn)嚢枋蛊渥兂蓱覞嵋?，記錄體積，稱為拌使其變成懸濁液，記錄體積，稱為B B液液堿性磷酸酶的分離純化堿性磷酸酶的分離純化 在在B液中加液中加95%的冷乙醇，使乙醇最終濃度達(dá)的冷乙醇，使乙醇最終濃度達(dá)到到30%，混勻后立即離心，混勻后立即離心5min，量取上清液，倒，量取上清液，倒入另一干燥潔凈的刻度離心管入另一干燥潔凈的刻度離心管2中，記錄溶液體中，記錄溶液體積，棄去沉淀。積，棄去沉淀。 在離心管在離心管2中加入冷中加入冷95%的乙醇，使乙醇最終濃的乙醇，使乙醇最終濃度達(dá)到度達(dá)到60%，混勻后離

7、心，混勻后離心5min，棄去上清液，留，棄去上清液，留下沉淀。下沉淀。 向沉淀中加入向沉淀中加入0.5mol/L醋酸鎂溶液醋酸鎂溶液10mL，充分，充分溶解，向沉淀中逐滴加入冷丙酮至丙酮的最終濃溶解，向沉淀中逐滴加入冷丙酮至丙酮的最終濃度達(dá)到度達(dá)到33%，離心，離心5min，取上清液，取上清液 ，放入干燥，放入干燥潔凈的離心管潔凈的離心管3中中 向向3中加冷丙酮，直至丙酮的最終濃度為中加冷丙酮，直至丙酮的最終濃度為60%，混勻后離心混勻后離心5min，棄去上清液，留下沉淀，該沉，棄去上清液，留下沉淀，該沉淀即為部分純化的堿性磷酸酶。向沉淀中加入淀即為部分純化的堿性磷酸酶。向沉淀中加入PH8.8

8、的的Tris緩沖液緩沖液10mL，使其溶解，稱為，使其溶解，稱為C液。液。分子量測定（分子量測定（SDSPAGE）原理）原理 SDS是十二烷基硫酸鈉的簡稱，它是一種陰離子是十二烷基硫酸鈉的簡稱，它是一種陰離子表面活性劑，加入到電泳系統(tǒng)中能使蛋白質(zhì)的氫表面活性劑，加入到電泳系統(tǒng)中能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上（在一鍵和疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上（在一定條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)與定條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合比為的結(jié)合比為1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)），使各種蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)），使各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了物都帶上相同密度的負(fù)電荷，其

9、數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而使其電泳遷移率蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而使其電泳遷移率只取決于分子大小這一因素，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分只取決于分子大小這一因素，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)和遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可求得未子量的對數(shù)和遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可求得未知物的分子量。知物的分子量。電泳試劑電泳試劑 （1）分離膠緩沖液(A 液，3.0mol/L TrisHCl 緩沖液， pH8.9)：1mol/L HCl 48mL，加Tris 36.3g，重蒸水定容至100mL，調(diào)至pH8.9 （2）30% 丙烯酰胺(B 液)： Acr(丙烯酰胺)30g，Bis(N，N亞甲基雙丙烯酰胺)0.8g，

10、加重蒸水定容到100mL （3）濃縮膠緩沖液(C 液，0.5mol/LTrisHCl緩沖液，pH6.7)：1mol HCl 48mL，Tris 5.98g加重蒸水定容到100mL調(diào)pH至6.7 （4）TEMED(四甲基乙二胺，T液)（5）10% SDS ( S液) （6）10%過硫酸銨：1g過硫酸銨，加重蒸水10mL，最好臨用前配制 （7）pH8.3 電極緩沖液：Tris 6.05g，甘氨酸 28.8g，10% SDS 10mL加重蒸水溶解，調(diào)pH到8.3，定容至1000mL，用時10倍稀釋 （8）染色：取考馬斯亮藍(lán)R250，0.46g溶于400mL脫色液中，過濾后備用 （9）脫色液：80mL

11、冰醋酸，250mL 95%乙醇，加蒸餾水定容至1000mL分子量測定分子量測定SDS-PAGE電泳：電泳：（采用7. 5%分離膠 3%的濃縮膠對酶蛋白進(jìn)行分離鑒定）（1）安裝雙垂直板電泳槽；）安裝雙垂直板電泳槽； （2）配）配12%的分離膠的分離膠5 mL，濃縮膠，濃縮膠3 mL；（3）制樣：取樣品）制樣：取樣品20 L與樣品緩沖液與樣品緩沖液10 L混合，混合，100 加熱加熱5分鐘；分鐘；（4）上樣：用微量注射器加樣）上樣：用微量注射器加樣15-20 L（5）電泳：在凝膠上加）電泳：在凝膠上加40 V/cm電壓，待染料進(jìn)入分離膠電壓，待染料進(jìn)入分離膠后將電壓提高到后將電壓提高到140 V/

12、cm繼續(xù)電泳直到染料到達(dá)底部；繼續(xù)電泳直到染料到達(dá)底部；（6）固定和染色：用考馬斯亮藍(lán)）固定和染色：用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液浸泡，加熱幾染色液浸泡，加熱幾分鐘；分鐘；（7）脫色：半小時更換一次脫色液，處理）脫色：半小時更換一次脫色液，處理3-5次，直到膠板次，直到膠板呈現(xiàn)淡藍(lán)色。呈現(xiàn)淡藍(lán)色。Km值測定試劑值測定試劑（1）0.04mol/L底物液（磷酸苯二鈉）：稱取10.16g磷酸苯二鈉（C6H5PO4Na22H2O），用煮沸后冷卻的蒸溜水溶解，并稀釋至1，000ml，加4ml氯仿防腐，貯于棕色瓶內(nèi)，置冰箱內(nèi)保存，可用一周。（2）0.1mol/l碳酸鹽緩沖液（ph10.0）：稱取無水碳酸鈉6

13、.36g及碳酸氫鈉3.36g溶解于蒸餾水中，并稀釋至1000ml；（3）0.5mol/LNaOH（4）0.3%4-氨基安替比林:稱取3g4-氨替比林及碳酸氫鈉42g，用蒸餾水溶解，并稀釋至1000ml，貯于棕色瓶中，放冰箱內(nèi)保存（5）0.5%鐵氰化鉀：稱取10g鐵氰化鉀及30g硼酸各溶于800ml蒸餾水中，溶解后兩液混合加水至2000ml。置棕色瓶中，放冰箱內(nèi)保存；Km和和Vmax值測定值測定Km和和Vmax值測定值測定 按表1操作加入酶液混勻之后立即計時，各管在37水浴中準(zhǔn)確保溫15分鐘后，立即加入0.5mol/LNaOH溶液1.0ml終止反應(yīng)； 顯色，各管中加入0.3%4氨基安替比林1.0

14、ml和0.5%鐵氰化鉀2.0ml，充分混勻，靜置10分鐘，以0管為對照，在波長510nm下比色，記錄各管吸光度。作圖，所測各管的吸光度代表各管中反應(yīng)速度V，以之為縱軸，以作用物濃度S為橫軸作圖觀察曲線形狀；以各管吸光度值的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，以作用物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)作圖求酶的Km值。酶的固定化原理酶的固定化原理 通過物理或化學(xué)的方法，將水溶性的酶與通過物理或化學(xué)的方法，將水溶性的酶與水不溶性載體結(jié)合，使酶固定在載體上，水不溶性載體結(jié)合，使酶固定在載體上，并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶稱為固定化酶。稱為固定化酶。 酶的固定化酶的固定化 與游離酶相比，固定化酶

15、有以下優(yōu)點(diǎn)：與游離酶相比，固定化酶有以下優(yōu)點(diǎn)： 提高酶的穩(wěn)定性 易與產(chǎn)物分離 可反復(fù)利用 酶固定化后，對變性劑、抑制劑的抵抗能力增強(qiáng)，貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性也得以提高。 酶的固定化方法有：酶的固定化方法有： 吸附法、共價偶聯(lián)法、交聯(lián)法、包埋法。酶的固定化酶的固定化（1）稱取3 g殼聚糖溶于98 mL蒸餾水中，攪拌均勻，再滴加2 mL冰醋酸，攪拌至均勻的粘稠狀。（2）稱取8 g NaOH置大燒杯中，加入180 mL蒸餾水及20 mL甲醇。（3）將拔出推塞的注射器架在鐵架臺上，倒入粘稠狀的殼聚糖溶液，使殼聚糖溶液從20 cm高的注射器出口滴入大燒杯中，以制備殼聚糖微球載體。（4）殼聚糖溶液滴加完畢

16、后，靜止片刻，待微球完全沉入燒杯底部時，反復(fù)水洗多次至pH值中性，瀝干水分。加入1%戊二醛溶液100 mL，靜置2 h，使戊二醛偶聯(lián)于殼聚糖載體上。注意：為保證適宜的流速，注射器中的殼聚糖溶液不宜超過10 mL，隨著殼聚糖溶液逐滴滴入大燒杯，應(yīng)隨時補(bǔ)充殼聚糖溶液至刻度，并不斷輕輕晃動大燒杯。若液體表面殼聚糖微球過于密集，應(yīng)靜置片刻，待微球沉入燒杯底部后繼續(xù)滴加。固定化酶的制備固定化酶的制備 1、將靜置2 h后的殼聚糖微球載體中的戊二醛溶液倒掉，再用蒸餾水洗滌5次，以除去多余的戊二醛。 2、將實驗純化得到的堿性磷酸酶液1 mL用蒸餾水稀釋至100 mL，與偶聯(lián)戊二醛的殼聚糖載體混合，靜置偶聯(lián)過夜。 3、固定化酶測定前，用蒸餾水洗滌兩次，以除去未固定住的殘留酶液.（洗滌液并入殘留液 酶動力學(xué)研究酶動力學(xué)研究最適最適pH及酸堿穩(wěn)定性實驗及酸堿穩(wěn)定性實驗最適溫度及熱穩(wěn)定性實驗最適溫度及熱穩(wěn)定性實驗抑制劑類型鑒別抑制劑類型鑒別酶動力學(xué)研究試劑酶動力學(xué)研究試劑 （1）各pH值相應(yīng)緩沖液（2）基質(zhì)液：稱取磷酸苯二鈉2H2O 6g，4-氨基安替比林3g，分別溶于煮沸冷卻后的蒸餾水中，兩