SDSPAGE原理下

1、電泳槽1SDS蛋白電泳上樣緩沖液 蛋白上樣緩沖液(SDSloadingbuffer)是一種以溴酚藍(lán)為染料，5倍濃縮的SDS凝膠電泳上樣緩沖液,用于常規(guī)的SDS蛋白電泳樣品上樣。 本產(chǎn)品分為還原型和非還原型兩種，還原型上樣緩沖液中的巰基可使蛋白分子的鏈內(nèi)二硫鍵和鏈間二硫鍵斷裂，使通過二硫鍵連接的各亞單位彼此分離，在電泳凝膠上顯現(xiàn)多個蛋白條帶，選購和使用時請務(wù)必注明，仔細(xì)區(qū)分。注意事項 分為還原型和非還原型兩種，還原型上樣緩沖液中含一定量的DTT或巰基乙醇，有輕微刺激性氣味，較易區(qū)分； 含巰基的試劑有一定的毒性，為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。 使用說明 1. 按每4微升蛋白樣品

2、加入1微升蛋白上樣緩沖液的比例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液(5X)。 2.100或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。 3.冷卻到室溫后離心數(shù)秒鐘，混均后再離30秒鐘，取上清直接上樣到SDS膠加樣孔內(nèi)即可。 4.通常電泳時染料到達(dá)膠的底端附近（0.5-1cm)即可停止電泳。2增加樣品密度以保證蛋白質(zhì)沉入加樣孔內(nèi)，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。上樣緩沖液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，這可以阻止樣品從梳樣孔中擴(kuò)散出來到電泳緩沖液中。指示劑監(jiān)測電泳的行進(jìn)過程，一般加入泳動速率較快的溴酚藍(lán)指示電泳的前沿 。 SDS蛋白電泳上樣緩沖液3單純的固定液一般難以達(dá)

3、到這些要求，因此在實驗中使用兩種混和的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而稱的卡諾氏固定液是效果良好的固定液。Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需臨時配制，長時間放置影響固定效果，固定時間15分鐘至24小時，冰箱、室溫均可。 甲醇：有固定、硬化和脫水的作用?？梢怨潭ò椎鞍住⑶虻鞍?、核蛋白，但對核蛋白固定效果較差(親和力小且易自溶)。甲醇固定的特點是殺死快，滲透力強(qiáng)，對組織收縮較大(可收縮20左右)，可使材料變硬。冰醋酸：純醋酸在溫度稍變低時即形成冰晶，所以又稱為冰醋酸。常用0.3-0.5的濃度作為固定液。冰醋酸對材料有膨脹作用，對核蛋白固定好，可與水、酒精、

4、氯仿混合。 甲醇/冰醋酸固定液4考馬斯亮藍(lán)（Coomassie Brilliant Blue） 考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)染料結(jié)合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。 考馬斯亮藍(lán)G250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色。它和蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律（Beers law）。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色有紅色形式和藍(lán)色形式，最大光吸收由465nm變成595nm，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。 蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個很快的過程，約2min即可反應(yīng)完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可穩(wěn)定1h，之后，蛋白質(zhì)

5、染料復(fù)合物發(fā)生聚合并沉淀出來。蛋白質(zhì)染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，使得在測定蛋白質(zhì)濃度時靈敏度很高，在測定溶液中含蛋白質(zhì)5L/ml時就有0.275光吸收值的變化，比Lowry法靈敏4倍，測定范圍為10100g蛋白質(zhì)，微量測定法測定范圍是110g蛋白質(zhì)。此反應(yīng)重復(fù)性好，精確度高，線性關(guān)系好。標(biāo)準(zhǔn)曲線在蛋白質(zhì)濃度較大時稍有彎曲，這是由于染料本身的兩種顏色形式光譜有重疊，試劑背景值隨更多染料與蛋白質(zhì)結(jié)合而不斷降低，但直線彎曲程度很輕，不影響測定。5考馬斯亮藍(lán)G-250（Coomassie brilliant blue G-250） 測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質(zhì)含量，測定蛋白質(zhì)濃度范圍為01 000gmL，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。6Triton-