組織制片技術(shù)概述2013

1、組織制片技術(shù)1 組織制片技術(shù)的概述 組織制片技術(shù)的方法 組織制片技術(shù)的基本程序 蘇木精伊紅染色2 組織制片技術(shù)的發(fā)展史 從16世紀60年代Hook發(fā)明顯微鏡，開始觀察和描述軟木塞中的細胞至今，組織制片技術(shù)隨著生命科學的發(fā)展而不斷進步。345678 組織制片技術(shù)的發(fā)展史 在19世紀中期，隨著生物、物理和化學等學科的飛速發(fā)展，以及顯微鏡和切片機的逐步完善，組織學也建立起一整套完整科學的組織制片技術(shù)。9 組織制片技術(shù)的發(fā)展史 特別是20世紀50年代以來，由于組織化學、免疫組織化學等新技術(shù)和新儀器的出現(xiàn)，使組織制片技術(shù)的應用領域進入了一個嶄新的時期。 101112 利用組織制片技術(shù)的方法所制出的標本，

2、顯示了組織細胞的結(jié)構(gòu)和形態(tài)、組織細胞之間的相互連接及組織細胞中的某些化學成分的種類和含量。 提供最直觀的依據(jù)。組織制片是研究醫(yī)學和生物學的一個最基本的手段。組織制片的意義和目的13組織制片技術(shù)的方法 非組織切片法 組織切片法 14非組織切片法 組織不經(jīng)過切片制成觀察標本的方法。非組織切片法的種類 涂片、壓片、鋪片、磨片、消化分離標本、活體標本、整裝標本、血管注射標本。15涂片 將所采的血液、骨髓或者脫落細胞涂抹于載玻片上經(jīng)瑞氏、姬姆薩染色、常規(guī)HE染色。16壓片 先將組織處理成小塊物質(zhì)，然后用化學藥品進行軟化和染色，再用蓋玻片壓封于載玻片上。例如運動終板和寄生蟲標本等。17鋪片：將需要觀察的薄

3、片組織用手工的方法直接鋪于載玻片上，然后經(jīng)過固定、染色等程序制成。例如蛙的腸系膜鋪片，大白鼠的皮下組織鋪片等。18磨片：對于骨，牙齒等組織，不經(jīng)脫鈣和切片，直接在磨石上用手工磨成大約50微米左右的薄片，然后再進行染色封固在載玻片上。19消化分離標本：先將組織分離成小塊，然后利用相應的化學物質(zhì)將細胞間質(zhì)消化溶解，再用機械分離的方法，如水的震蕩沖擊力，使小塊組織分離成單個而又完整的細胞，經(jīng)染色后涂于載玻片上進行封固。例如平滑肌分離標本，脊髓的運動神經(jīng)細胞等。20 活體標本 將所采的觀察標本加生理鹽水后直接滴于載玻片上在顯微鏡下觀察。21整裝標本 將胚胎或小動物經(jīng)前期固定后整體封藏于盛滿固定劑的透明

4、容器中 。將發(fā)育至某一階段的雞胚整體取出，經(jīng)固定、染色、脫水、透明后封固于載玻片上的標本。22血管注射標本 將有色物質(zhì)注射進血管，用酸或鹼將血管周圍的組織腐蝕后做成的整體封藏的血管標本。 將有色物質(zhì)注射進血管后，經(jīng)一系列制片技術(shù)處理后封固于載玻片上供顯微鏡下觀察的標本。23組織切片法 利用化學試劑將組織經(jīng)過一系列的固定、脫水、透明后，再利用石蠟、火棉膠或者明膠等支持物滲透進組織內(nèi)部，使組織保持一定的硬度，并包埋成塊，然后依靠切片機將包埋好的組織塊切成以微米計的薄片，再根據(jù)需要進行各種染色得到的供顯微鏡下觀察的標本的方法。 24組織切片法的種類 冰凍切片 石蠟切片、火棉膠切片、明膠切片25 冰凍

5、切片 將所取材的新鮮組織，經(jīng)快速冷凍后再切片，以保持組織內(nèi)所含的脂類或某些酶類的活性。 為觀察急待結(jié)果的組織，如臨床手術(shù)所取組織，也可用這種方法。 26組織切片標本制作的基本程序: 1. 取材 2. 固定和固定后處理 3. 脫水 4. 透明 5. 浸蠟與包埋 6. 切片 7. 染色 8. 封固 27 取 材一、動物的處死 手法迅速、快捷。 常用方法： 1. 麻醉法：吸入麻醉（乙醚）和注射麻醉（烏拉坦或者戊巴比妥）。 2. 空氣栓塞法：耳靜脈，2030ml空氣 3. 擊頭法：重物猛擊，迅速致死。 4. 頸椎脫臼法：小白鼠 5. 破壞腦和脊髓：金屬探針，蛙 6. 股動脈放血：麻醉后放血使大動物迅速

6、死亡。2829二、取材的步驟 選擇動物選擇取材部位選擇切面方向30 應根據(jù)實驗工作的目的和經(jīng)濟能力選擇實驗動物 肝臟豬肝 卵巢貓 胃狗 運動終板爬蟲類動物 肥大細胞大、小白鼠的皮下組織 間皮和內(nèi)皮蛙的腸系膜31 根據(jù)器官組織的結(jié)構(gòu)特點選擇取材部位 胰腺胰尾部 脊髓的運動神經(jīng)元頸膨大和腰膨大處 肺 肺門 胃胃底部 32 根據(jù)器官組織的結(jié)構(gòu)特點選擇取材時切面的方向 腎臟腎門處作縱切 33頭皮順毛根的方向縱切 34大小腸的環(huán)行皺襞縱切35氣管和食管橫切36三、取材時應注意的問題 ： 組織新鮮：取材動作快捷，迅速投入固定液 注意環(huán)境溫度的影響：冰上取材或者冷固定 材料應小而?。?不超過1.51.5 0

7、.5cm3 固定液會造成組織收縮，注意保持組織原有形態(tài) 取材手術(shù)器械鋒利規(guī)范操作，防止組織損害 注意取材環(huán)境和器械干凈，防止組織污染37固定和固定后處理一、固定的目的 ： 固定劑使細胞的成分凝固，防止組織細胞自溶和腐敗，保持細胞生活時的狀態(tài)。 固定劑的酶染作用使細胞各成分易于被染料著色。 使組織適度硬化，利于制作薄片。38二、固定的方法： 1. 直接固定：最常用。 2. 蒸汽固定：12鋨酸或者甲醛揮發(fā)的蒸汽，多用于涂片固定。 3.灌注固定：（必須進行后固定） 局部灌注固定：肺、腎臟、眼球、肝臟 全身灌注固定：神經(jīng)系統(tǒng)39三、固定的注意事項： 固定劑的用量 一般為組織塊體積的15倍左右 固定劑的

8、配制 現(xiàn)配現(xiàn)用 固定的時間 受較多因素的影響。一般過夜或者24小時可達到固定要求。 40四、常用固定劑單純固定劑 甲醛、乙醇、冰乙酸、升汞、苦味酸、 重鉻酸鉀、丙酮、 鉻酸、四氧化鋨 固定組織時，只單用某一種試劑尚難對各種組織成分有較理想的固定作用。因此，常加入其它試劑，根據(jù)對組織的作用與反應，配成混合固定劑，以求得補償某試劑對組織所致的缺陷。混合固定劑 中性甲醛液、乙醇甲醛液、 Bouin氏液、 苦味酸硫酸液 、Carnoy氏液 、Helly氏液41甲醛(Formeldedhyde)固定濃度： 4%甲醛溶液固定時間： 12小時24小時固定后處理： 流水沖洗12小時24小時配制方法： 甲醛10

9、ml + 生理鹽水/蒸溜水90ml特性： 甲醛放置時間過長易產(chǎn)生白色沉淀“三聚甲醛”，氧化后變?yōu)榧姿?，使溶液變?yōu)樗嵝?，嚴重時可影響到細胞核著色（）。42乙醇(Ethyl alcohol) 固定濃度： 80%-90%乙醇液 固定時間： 一般4小時12小時 固定后處理： 直接入脫水劑 配制方法： 無水乙醇 + 蒸餾水 特性： 乙醇具有固定、脫水等多種功能。組織在高濃度乙醇中放置時間過長時，易發(fā)脆。50%以上濃度的乙醇可溶解組織內(nèi)脂肪、類脂體、色素等，注意制片的目的（） 。43中性甲醛液 配制方法： 40%甲醛 120ml 蒸餾水 880ml 磷酸二氫鈉 4g 磷酸氫二鈉 13g固定時間： 24小時

10、固定后處理： 流水沖洗24小時適用組織： 常用固定劑，適用廣泛（）44乙醇甲醛液（AF液） 配制方法： 95%乙醇90ml 40%甲醛10ml 固定時間：組織塊固定412小時， 鋪片固定 510分鐘。 固定后處理：直接入脫水劑。 適用組織：肥大細胞，糖原的固定（） 。 45Bouin氏液配制方法：飽和苦味酸溶液75ml 40%甲醛25ml 冰乙酸5ml固定時間：1224h固定后處理：70%乙醇脫去苦味酸產(chǎn)生的黃色適用組織：常備固定液，特別適用于固定皮膚和胚胎組織。46五、固定后處理 除去組織中滲入的固定液和一些由固定液產(chǎn)生的沉淀、結(jié)晶和色素的步驟稱為固定后處理。主要有以下六種方法：流水沖洗 ：

11、重鉻酸鉀、甲醛固定的組織，要經(jīng)過流水沖洗24h。酒精脫黃 : 含有苦味酸的固定液固定的組織，必須經(jīng)過70乙醇洗滌脫去黃色。 47碘酒脫汞 ：氯化汞固定的組織有汞結(jié)晶，碘酒浸泡除去。脫甲醛色素 ：甲醛長期固定的組織易產(chǎn)生黑色結(jié)晶， 70乙醇濃氨水溶液除去。 組織漂白 ：鋨酸固定的組織為黑色。漂白液漂白才上色。 脫鈣：含鈣組織骨、牙齒和內(nèi)耳。48脫 水一、定義 用某種能與透明劑互溶的化學試劑將組織內(nèi)的水分逐漸置換出來的過程。 要點：緩慢、徹底、勿過度。二、常用脫水劑 乙醇、丙酮、正丁醇 49乙醇固定劑 + 脫水劑上行酒精脫水70%（30%）100%，以10遞增。丙酮脫水強，但對組織的收縮脆化作用也

12、強；主要用于組織的固定兼脫水或切片的快速脫水，以保護某些特殊染色的標本不被褪色。 50透 明一、定義 對組織的最后脫水處理。 在經(jīng)過前一階段的“脫水”后，還要借某種有機溶媒將酒精完全置換，使組織與所用的包埋介質(zhì)相溶而浸滲。二、常用透明劑 二甲苯、苯甲酸甲脂、三氯甲烷 、冬青油 51二甲苯 為無色透明的液體，易揮發(fā)，長期接觸對呼吸道粘膜有較強的刺激作用20分鐘1個小時，大塊組織可適當延長時間。作用迅速，浸泡時間過長易發(fā)生過度收縮和脆化苯甲酸甲脂為無色透明的液體，易揮發(fā)透明作用較二甲苯緩慢，透明時間12-24小時。對組織塊的收縮和脆化的影響較小。苯甲酸甲脂與火棉膠互溶，用于火棉膠切片的透明52 用

13、石蠟做為支撐劑將組織包埋成塊使其硬化的過程 包括浸蠟和包埋兩步一、浸蠟 組織透明后，用石蠟置換組織內(nèi)部的透明劑的過程稱為浸蠟。 組織塊浸蠟一般先經(jīng)過低熔點蠟，再經(jīng)過高熔點蠟。 包 埋 53高溶點蠟也稱硬蠟溶點在60-62硬蠟箱的溫度控制在62-64之間組織浸蠟時間一般不超過1小時低溶點蠟也稱軟蠟溶點在48-50 軟蠟箱的溫度控制在5254之間 組織浸蠟時間一般可達24小時54二、包埋 組織浸蠟完成后，接著進行組織塊包埋。用于包埋的是硬蠟。包埋在包埋器中完成。 修整蠟塊時，組織塊應距蠟塊邊緣23毫米，以利于連續(xù)切片。 55切 片 石蠟切片 組織切片中應用最為廣泛的一種切片就是用石蠟作為包埋劑制作

14、的切片。易于制作大量菲薄的組織標本，而且包埋塊可長期保存。56一、儀器及器材57二、切片過程： 調(diào)節(jié)恒溫水箱水溫至47左右； 固定蠟塊于固定器； 快修裝置修整包埋面； 調(diào)節(jié)切片厚度至46微米； 連續(xù)切片； 攤片于水箱內(nèi)； 將蠟片貼于涂好粘片劑的載玻片上； 置于溫箱內(nèi)烤片。58三、切片的注意事項 切片前要將切片機各部位的螺絲旋緊，否則會引起切片機各部件震動，造成切片厚薄不勻。 包埋塊的切面和切片刀的傾斜度之間的夾角應按切片機刀臺上的刻度作適當調(diào)整。 恒溫水箱的溫度應比包埋蠟的溶點低5-6。59染 色 一、染料 指分子中含有發(fā)色團和助色團的有機化合物，有鮮艷的色彩，對于組織有極強的親和力。 根據(jù)來

15、源可分為兩類： 天然染料（卡紅、蘇木精） 人工合成染料（苦味酸、桔黃G） 根據(jù)其化學性質(zhì)分為： 堿性染料(basic dye) 酸性染料(acid dye) 中性(neutrophilia)染料60二、染色的原理 染色就是染料和組織細胞的分子相互結(jié)合，使組織和細胞著色。 化學反應 在組織細胞內(nèi)含有酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)。染色時酸性物質(zhì)與堿性染料結(jié)合；堿性物質(zhì)與酸性染料結(jié)合。細胞核中主要由酸性物質(zhì)組成（如核酸等），所以與蘇木精等堿性染料有很強的親和力。細胞質(zhì)主要由堿性物質(zhì)組成，所以與伊紅等酸性染料有很強的親和力。 能被堿性染料著色的物質(zhì)：嗜堿性(basophilia)； 能被酸性染料著色的物質(zhì)：嗜酸

16、性(acidophilia)。61物理反應 細胞中有許多微小的毛細小孔，染料的色素離子通過這些小孔滲入細胞內(nèi)，染料與細胞沒有牢固的結(jié)合，但分散的色素離子和組織細胞分子之間通過分子間相互作用使細胞著色。62三、染色的注意事項：1.溶媒：水和乙醇。2.濃度：低濃度，長時間。3. 溫度：高，染色效果明顯。4. 適當使用媒染劑、促染劑和分化劑。媒染劑：能增強染料對組織的著色能力，其本身與染料或組織發(fā)生結(jié)合的試劑。如配制各種蘇木精染色液時添加的鉀明礬、銨明礬等。促染劑：能增強染料對組織的著色能力，本身并不參與染色反應。如伊紅染色液中添加的冰乙酸等。分化劑：能除去組織上和切片上過染的染色液，使染色部位與周

17、圍組織對比鮮明，著色深淺適當；例如低濃度的鹽酸、醋酸、高錳酸鉀、重鉻酸鉀等。63封 固一、定義 最后一道程序是滴加封固劑，用蓋玻片覆蓋，以利于鏡下觀察。 阻斷組織片與外界的接觸，防止組織片脫片、受潮、干裂、機械磨損等，延長切片的使用時間。 這一步驟稱為封固。 封固分為干封和濕封兩種。64干封：切片染色經(jīng)脫水和透明后，用中性樹膠之類無水封固劑封固。數(shù)年不褪色。濕封：切片染色后直接用含甘油、明膠及少量的水和防腐劑組成的封固劑封固。濕封的標本保存時間不長，主要用于某些組織化學或特殊染色的標本。65二、封固時的注意事項： 封固時避免產(chǎn)生氣泡。 封固劑應濃度適中。 選擇大小合適的蓋玻片，以蓋好組織后四周約有2毫米左右的間隙為適當。 封固劑應避光保存 。 66蘇木精(hematoxylin)-伊紅(eosin)（H-E染色）一、脫蠟與入水1二甲苯510分鐘 2次；2無水乙醇5分鐘 2次；395