生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：血清清、球蛋白分離2

1、南方醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心血清清蛋白、g-球蛋白的分離、提純與鑒定2內(nèi) 容實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理2實(shí)驗(yàn)材料3實(shí)驗(yàn)過程45注意事項(xiàng)3實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握鹽析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法2.掌握凝膠層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法3.掌握離子交換層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法4.掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法5.了解柱層析技術(shù)4實(shí)驗(yàn)流程鹽析法進(jìn)行粗分離DEAE纖維素離子交換層析粗提脫鹽純化醋酸纖維素薄膜電泳鑒定葡聚糖凝膠G-25層析5實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)的分離和純化是研究蛋白質(zhì)化學(xué)及其生物學(xué)功能的重要手段。不同蛋白質(zhì)的分子量、溶解度及等電點(diǎn)等都有所不同。利用這些性質(zhì)的差別，可分離純

2、化各種蛋白質(zhì)。6 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與常用的分離純化方法蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)常用的純化方法分子質(zhì)量透析、超濾凝膠層析離心溶解度調(diào)整pH調(diào)整離子強(qiáng)度降低介電常數(shù)電荷電泳等電聚焦離子交換層析特異結(jié)合部位親和層析其他性質(zhì)吸附層析液相層析氣相層析7球 蛋 白12等電點(diǎn)相對分子量（104）含量（）4.886.957675.0620255.0630495.129156.2126.857.315.6301220血清蛋白的等電點(diǎn)、平均分子量及正常含量清蛋白 A在pH6.5溶液中，清蛋白解離而帶負(fù)電荷， 同時(shí)1、2、-球蛋白也會(huì)解離而帶負(fù)電。 由于清蛋白的等電點(diǎn)、分子量最小所以解離而帶的負(fù)電荷量最多。-球蛋白的等電點(diǎn)

3、高于pH6.5所以解離而帶正電荷。8實(shí)驗(yàn)材料樣品：人混合血清試劑：葡聚糖凝膠G-25(Sephadex G-25)層析柱二乙基氨基乙基(DEAE)纖維素離子交換層析柱飽和硫酸銨溶液各不同濃度的pH6.5醋酸銨緩沖溶液20%磺基水楊酸溶液1%BaCl2溶液pH8.6巴比妥緩沖溶液氨基黑10B染色液、漂洗液器材：層析柱、電泳儀、電泳槽等1. 粗提原理-鹽析法9鹽析法：在蛋白質(zhì)溶液中,加入無機(jī)鹽至一定濃度， 或達(dá)飽和狀態(tài)，可使蛋白質(zhì)在水中溶解度降低，從而 分離出來。水化膜減弱、消失。蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽后， 由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，致使蛋白 質(zhì)分子周圍的水化膜減弱乃至消失。蛋白質(zhì)表面

4、的電荷大量被中和。中性鹽加入蛋白 質(zhì)溶液后由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面的電荷 大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，蛋白質(zhì)分 子之間聚集而沉淀。10粗提-鹽析法由于血清中各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小、所帶電荷的多少和親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣。調(diào)節(jié)鹽的濃度可使不同的蛋白質(zhì)沉淀從而達(dá)到分離的目的。血清清蛋白球蛋白半飽和硫酸銨清蛋白不沉淀，上清球蛋白沉淀，蒸餾水溶解112. 脫鹽原理-凝膠層析鹽析分離的蛋白質(zhì)溶液中含有大量無機(jī)鹽，必須先脫鹽后才能進(jìn)一步純化。脫鹽有多種方法，本實(shí)驗(yàn)采用凝膠層析法。凝膠層析法主要是根據(jù)混合物中各種物質(zhì)分子大小的不同而將其分離的技術(shù)。凝膠層析分離示意圖蛋白

5、質(zhì)分子大，無機(jī)鹽分子小。通過凝膠層析即可將大小不同的物質(zhì)分離開來。133.純化原理-離子交換層析離子交換層析是指流動(dòng)相中的離子和固定相上的離子進(jìn)行可逆的交換，利用化合物的電荷性質(zhì)及電荷量不同進(jìn)行分離。R-SO3-H+ + Pr+R-SO3-Pr+ + H+陽離子交換陰離子交換R-N+R3OH- + Pr -R-N+R3Pr - + OH-140.06mol/LNH4AcpH6.5DEAE帶正電荷清蛋白pI 4.9，帶負(fù)電荷多a、b球蛋白pI 5.05.2，帶負(fù)電荷少a、b球蛋白被洗脫,清蛋白仍被吸附0.02mol/LNH4AcpH6.5DEAE帶正電荷清蛋白及a、b球蛋白的pI6.5 ，帶負(fù)電

6、荷g球蛋白pI 6.5，帶正電荷清蛋白及a、b球蛋白被層析柱吸附,g-球蛋白被洗脫0.3mol/LNH4Ac pH6.5DEAE帶正電荷緩沖液離子強(qiáng)度增加清蛋白被洗脫164.純度鑒定-醋酸纖維素薄膜電泳 血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，一般都低于pH7.4。它們在pH8.6的緩沖液中均解離帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。由于血清中各種蛋白質(zhì)分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，在醋酸纖維素薄膜上電泳的速度也不同。因此可以將它們分離為清蛋白（Albumin)、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白5條區(qū)帶。17血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳結(jié)果純度鑒定標(biāo)準(zhǔn)：在膜條上相應(yīng)位置只出現(xiàn)單一條帶18實(shí)驗(yàn)過程鹽析

7、法進(jìn)行粗分離DEAE纖維素離子交換層析粗提脫鹽純化醋酸纖維素薄膜電泳鑒定葡聚糖凝膠層析用1ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩沖液(2ml)洗脫，流出液量約1ml時(shí)開始檢測蛋白質(zhì)取血清0.8ml，邊搖邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液0.8ml，混勻室溫放置10min，4000r/min離心10min沉淀（含球蛋白）加水 0.6ml溶解上清液（含清蛋白、少量球蛋白和球蛋白）約0.8ml用1ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩沖液(2ml)洗脫，流出液量約1ml時(shí)

8、開始檢測蛋白質(zhì)凝 膠 柱 層 析 除 鹽磺基水楊酸檢測蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的峰液12d繼續(xù)用2ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液洗滌BaCl2檢測 至SO42-陰性用23ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液再生平衡過葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.07cm）過葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.07cm）磺基水楊酸檢測蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的峰液12d繼續(xù)用0.02mol/L NH4AC緩沖液洗滌約2mlBaCl2檢測至SO42-陰性用23ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液再生平衡鹽析操作流程離子交換柱層析純化加樣加樣20樣品 加樣洗內(nèi)壁0.02M 醋酸銨 計(jì)算流出量洗脫檢測凝膠層

9、析脫鹽過程220.02M 醋酸銨 計(jì)算流出量磺基水揚(yáng)酸0.02M 醋酸銨 收集檢測 再生平衡氯化鋇0.02M 醋酸銨凝膠層析脫鹽過程離子交換柱再生和蛋白純度鑒定用1ml 0.0mol/L NH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,用約mL 0.06mol/L NH4AC緩沖液流洗，除去球蛋白和球蛋白離 子 交 換 柱 層 純 化除鹽后收集的清蛋白用1ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩沖液(3ml)洗脫，流出液量約1ml開始檢測蛋白質(zhì)取濃度最高的1管作純度鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳法）磺基水楊酸檢測蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的洗脫液每管10

10、d，連續(xù)收集3管DEAE-纖維素柱不用再生，可直接用于純化清蛋白除鹽后收集的球蛋白過DEAE-纖維素層析柱（1.06cm）過DEAE-纖維素層析柱（1.06cm）用0.3mol/L NH4AC緩沖液(約3ml)洗脫，流出液量約2ml開始檢測蛋白質(zhì)磺基水楊酸檢測蛋白質(zhì)收集含有清蛋白的洗脫液每管10d，連續(xù)收集2管DEAE-纖維素柱先用6ml l.5mol/L NaCl - 0.3mol/L NH4AC溶液流洗，再用10ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液流洗再生平衡2管均作純度鑒定(醋酸纖維素薄膜電泳法)操作流程24注意事項(xiàng)所用血清應(yīng)新鮮，無沉淀物及細(xì)菌滋生。使用時(shí)勿將各時(shí)段所應(yīng)用的溶液濃

11、度弄錯(cuò)。上樣時(shí)，滴管應(yīng)沿柱上端內(nèi)壁加入樣品，動(dòng)作應(yīng)輕、慢，勿將柱床沖起。流洗平衡時(shí)亦應(yīng)如此。洗脫時(shí)應(yīng)注意及時(shí)收集樣品，切勿使蛋白質(zhì)峰溶液流失，并注意層析柱不要流干，進(jìn)入空氣。切勿將檢測蛋白質(zhì)的磺基水楊酸與檢查SO42-的BaCl2混淆，因二者與相應(yīng)物質(zhì)生成的沉淀均為白色。葡聚糖凝膠價(jià)錢昂貴，要回收再生,避免損耗，嚴(yán)禁倒掉!25醋酸纖維素薄膜電泳 1. 點(diǎn)樣(粗面)8cm2cm點(diǎn)樣線點(diǎn)樣區(qū)1.5cm(粗面）點(diǎn)樣線盡量點(diǎn)得細(xì)窄而均勻小組標(biāo)記樣品標(biāo)記26醋酸纖維素薄膜電泳2. 電泳薄膜粗面向下點(diǎn)樣端置陰極端兩端緊貼在濾紙鹽橋上，膜應(yīng)輕輕拉平注意：切勿使點(diǎn)樣處與電泳槽接觸電壓：120V時(shí)間：50min。27 3. 染色和漂洗 電泳完畢后，關(guān)閉電源，將膜取出，直接浸于染色液中5min。 取出膜，盡量瀝凈染色液，移入漂洗液中浸洗脫色（一般更換2次），至背景顏色脫凈為止。 取出膜，用濾紙吸干即可。醋酸纖維素薄膜電泳28 實(shí)驗(yàn)結(jié)果-+血清清蛋白第1管清蛋白第2管-球蛋白管點(diǎn)樣線A