基于高通量測(cè)序分析年糕菌群結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)菌屬

1、收稿時(shí)間：2017-11-29作者簡(jiǎn)介：蔡懷依，女，1992年出生，碩士研究生，食品加工與貯藏工程通訊作者：婁永江，男，1963年出生，教授，水產(chǎn)品加工與貯藏工程 通訊作者：李勇勇，男，1986年出生，講師，水產(chǎn)品加工與貯藏工程基于高通量測(cè)序分析年糕菌群結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)菌屬首頁(yè)頁(yè)腳信息格式不符蔡懷依 雷麗萍 婁永江 李勇勇(寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211)摘 要：結(jié)合宏基因組DNA進(jìn)行高通量測(cè)序，分析年糕菌群結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)菌屬。使用Usearch等軟件整理和統(tǒng)計(jì)樣品序列數(shù)目和操作分類單元（OTU）數(shù)量，分析內(nèi)生細(xì)菌的豐度和-多樣性，獲得了用于分析的有效序列258 96條，OTU數(shù)為81。稀釋曲線表

2、明測(cè)序深度充分，OTU數(shù)量接近于飽和。年糕樣品的Chao1指數(shù)為90.23,Shannon多樣性指數(shù)為1.80?；贠TU的物種分類分析，年糕內(nèi)生細(xì)菌種類覆蓋29個(gè)屬8個(gè)綱5個(gè)門，其中年糕內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬為玫瑰色半光合菌屬(Roseateles，36.75%)、芽胞桿菌屬(Bacillus，24.38%)、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas，9.36%）。關(guān)鍵詞：高通量測(cè)序 年糕 菌群結(jié)構(gòu) 優(yōu)勢(shì)菌屬中圖分類號(hào)：TS202.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：AAnalysis of structural changes of spoilage bacteria and dominant spoilag

3、e bacteria of rice pastry based on high throughput sequencing technologyCai Huaiyi Lei Liping Lou Yongjiang Li Yongyong(School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211)Abstract: In order to reveal bacteria structure and dominant spoilage bacteria of rice pastry, met genome DNA was analyze

4、d by high throughput sequencing. The number of sample sequences and operational taxonomic units (OTU) were reorganized and counted using software like Usearch to analyze the abundance and -diversity of entophytic bacteria. 25896 effective sequences and 81 OTU were obtained. The dilution curve showed

5、 that sequencing was thorough, and OTU number was close to saturation. Chaol index of rice pastry sample was 90.23, and Shannon diversity index was 1.80. Based on OTU species categorization analysis, the types of entophytic bacteria covered 29 geneses, 8 classes, and 5 phylum. The dominant entophyti

6、c bacteria were Roseateles (36.75%), Bacillus(24.38%) and Stenotrophomonas (9.36%).Key words：high throughput sequencing, rice pastry, Flora structure, dominant bacteria年糕（rice pastry）是一種具有悠久歷史的半方便性的米制品，有濃郁的地方傳統(tǒng)和特色1。其營(yíng)養(yǎng)豐富，水分含量高，水分活度大，且整個(gè)加工過程中年糕原輔料半成品及成品都直接與水或空氣接觸，這也直接為微生物提供了適宜的生長(zhǎng)條件2。通過分析年糕儲(chǔ)藏過程中的菌群結(jié)構(gòu)，

7、從而有目的的選用合適的抑菌劑，能為年糕品質(zhì)劣化控制提供基礎(chǔ)資料。目前，分析微生物群體的多樣性及群落結(jié)構(gòu)的經(jīng)典方法是分離、培養(yǎng)以及鑒定，需要進(jìn)行一系列繁雜的形態(tài)特征和生理生化實(shí)驗(yàn)，且能夠培養(yǎng)分離出的微生物僅占樣品的1%10%，無(wú)法解析微生物的組成及豐度情況3。隨著宏基因組學(xué)概念的提出和高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，使樣品中不可培養(yǎng)的微生物、低豐度的微生物均能被檢測(cè)出，更完整地反映樣品中微生物的群落特征，使菌群的分析更準(zhǔn)確和快速4-7。本研究采用宏基因組結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)分析年糕菌群結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)菌屬，為進(jìn)一步探討微生物與年糕品質(zhì)的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料與試劑年糕：寧波江北五橋糧油食品有限

8、責(zé)任公司提供；E.Z.N.A.Soil DNA Kit D5625-01：OMEGA；Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒Q10212：Life；Taq DNA Polymerase Ep0406：Thermo；Agencourt AMPure XP A63882：Beckman；實(shí)驗(yàn)用水：經(jīng)Milli-Q Integral 5超純水系統(tǒng)純化。1.2 儀器與設(shè)備Pico-21臺(tái)式離心機(jī)：Thermo Fisher；GL-88B漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：HYPERLINK /link?url=ueX8qw7dspYXRvp4vlPOOkDa4v

9、s3qByqS7v42uu7KTFBXVBmSfs8nlHzQLu7PWtW t _blank深圳拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；DYCZ-21電泳槽：北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)UVP；Q32866 Qubit2.0熒光計(jì)：Invitrogen；T100TM Thermal Cyeler PCR儀：BIO-RAD；Research plus 0.5-10ul移液器： Eppendorf。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1樣品預(yù)處理 將新鮮年糕放入無(wú)菌袋中進(jìn)行真空包裝，置于37 至樣品腐敗（放置了5 d，以菌落總數(shù)作為判斷依據(jù)）。并采取液氮研磨的方法將樣品磨成粉末狀，

10、用于基因組DNA的提取。1.2.2宏基因組DNA的提取采用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒（OMEGA公司）提取總DNA，提取的總DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，超微量分光光度計(jì)（Thermo NanoDrop 2000）檢測(cè)濃度. 檢測(cè)合格后于-20 保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.2.3 PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序 利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)加入的DNA量。PCR所用的引物已經(jīng)融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的V4-V5通用引物，其中515F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGAT CTN (barcod

11、e) GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，909R引物AGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCACCCCGY CAATTCMTTTRAGT。 通過兩輪PCR擴(kuò)增并完成接頭序列的連接。第一輪PCR反應(yīng)體系為30 L反應(yīng)液，含2Taq master Mix 15 L，Bar-PCR primer F(10uM) 1 L，Primer R (10uM) 1 L，Genomic DNA 10 ng， H20補(bǔ)足至30 L 。PCR反應(yīng)條件為：94 預(yù)變性 3 min；94 30 s，45 20 s，65 30 s進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；之后94 20 s，55 20 s，72 30 s進(jìn)行20個(gè)循環(huán)

12、，最后72 延伸5 min。第二輪擴(kuò)增引入Illumina橋式PCR兼容引物， PCR 反應(yīng)條件為：95 預(yù)變性30 s，然后95 15 s，55 15 s，72 30 s進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，最后72 延伸5 min。PCR 結(jié)束后，利用瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定，之后進(jìn)行DNA純化回收。在25 L PCR產(chǎn)物中加入體積0.8倍的磁珠（Agencourt AMPure XP），震蕩充分懸浮后放在磁力架上吸附5 min，小心的用移液槍吸出上清。加入30 L0.8倍的磁珠洗滌液，震蕩充分懸浮后放在磁力架上吸附5 min，小心吸出上清。加入90 uL WashBuffer，反向放置在磁力架上，使磁珠吸附到PCR管

13、的另外一面，充分吸附后吸出上清。將PCR管或8聯(lián)管放在55 烘箱5 min，使里面的酒精完全揮發(fā)。加入30 L Elution Buffer洗脫。將PCR管放在吸附架上5 min，充分吸附，移出上清到干凈的1.5 mL離心管中，定量備用。利用Qubit 2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA精確定量，以方便按照1：1的等量混合后測(cè)序。等量混合時(shí)，每個(gè)樣品DNA量取10 ng，最終上機(jī)測(cè)序濃度為20 pmol。1.2.4數(shù)據(jù)分析Illumina Miseq得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別 (Base Calling) 分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列(Sequenced Reads) ，其中包

14、含測(cè)序序列 (reads) 的序列信息以及其對(duì)應(yīng)的測(cè)序質(zhì)量信息。Miseq測(cè)序序列中含有barcode序列，以及測(cè)序時(shí)加入的引物和接頭序列。首先需要去除引物接頭序列，再根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)的reads 拼接 (merge) 成一條序列，然后按照barcode標(biāo)簽序列識(shí)別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后對(duì)各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。去除3端測(cè)序引物接頭，Read1 3 端測(cè)序接頭為TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTC，根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系將成對(duì)reads拼接(merge) 成一條序列，拼接序列的overl

15、ap區(qū)域允許的最大錯(cuò)配比率是0.1，根據(jù)各樣本barcode序列從融合后數(shù)據(jù)中分割出各樣本數(shù)據(jù)，去除各樣本中reads尾部質(zhì)量值在20以下的堿基。設(shè)置10bp的端口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始去除后端的堿基。切除reads中含N部分序列，并去除數(shù)據(jù)中的短序列，長(zhǎng)度閾值200 bp，隨后再對(duì)低復(fù)雜度的序列進(jìn)行過濾。將多條序列按其序列間的距離進(jìn)行聚類，對(duì)相似性在 0.97 以上的序列進(jìn)行歸并，生成操作分類單元(OTU) 8-10。根據(jù)聚類分析結(jié)果，計(jì)算 ACE、Chao1、Shannon、Simpson 指數(shù)進(jìn)行 alpha 多樣性分析，其中 ACE、Chao1 指數(shù)是對(duì)菌群豐度進(jìn)

16、行評(píng)估，Shannon、Simpson 指數(shù)是對(duì)菌群多樣性進(jìn)行評(píng)估。采用 RDP classifier 軟件對(duì)序列進(jìn)行物種分類，根據(jù)分類學(xué)分析比對(duì)結(jié)果，在門、屬等水平上對(duì)樣品的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行種類和豐度分析11。2結(jié)果與分析2.1序列長(zhǎng)度分布在年糕樣品總DNA的16S rDNA V4-V5區(qū)中測(cè)得的原始reads數(shù)目34778條，原始序列平均長(zhǎng)度為414.32（圖1）。質(zhì)量控制之后剩余reads數(shù)目330 90條，序列平均長(zhǎng)度為374.47（圖2）。從序列長(zhǎng)度的分布來(lái)看， 與16S rDNA- V4-V5 區(qū)序列長(zhǎng)度大致吻合。去除嵌合體與靶區(qū)域之前序列總數(shù)330 90條，比對(duì)到細(xì)胞器組織序列數(shù)目6

17、763條，非靶區(qū)域序列數(shù)目0條，嵌合體數(shù)目159條，處理后剩余序列261 68條。 圖1 原始數(shù)據(jù)長(zhǎng)度分布圖圖2 質(zhì)控后序列長(zhǎng)度分布圖2.2 OTU多樣性分析通過繪制OTU數(shù)目變化與聚類similarity值之間的關(guān)系圖，從中選擇最佳的similarity值進(jìn)行OTU分析和分類學(xué)分析，分析使用的similarity值為97%的序列相似性（圖3）12。樣品的基因組 DNA 經(jīng) PCR 擴(kuò)增 16S rDNA V4-V5 區(qū)后進(jìn)行高通量測(cè)序，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析獲得序列的 alpha 多樣性，結(jié)果見表 1。Shannon值越大，說(shuō)明群落多樣性越高，而Simpson值越大說(shuō)明群落多樣性越低13，由表1 可知樣

18、本群落多樣性較高。此外，樣本的測(cè)序覆蓋率在1.00以上，表明樣品中序列未被測(cè)到的概率較低。采用對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建曲線，即稀釋曲線(Rarefaction Curve)。它可以用來(lái)比較測(cè)序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用來(lái)說(shuō)明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理14。當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。樣本的Shannon-Wiener曲線（圖4）， 發(fā)現(xiàn)曲線已到達(dá)平臺(tái)期， 說(shuō)明更大的測(cè)序量不會(huì)引起物種多樣性的顯著增長(zhǎng)，基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)量的分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠。圖3 OT

19、U數(shù)目與聚類相似度值關(guān)系圖（由于原始圖片為pdf格式，本人技術(shù)受限所以無(wú)法將圖中紅色英文部分改為中文）表1 年糕腐敗樣品菌群的alpha多樣性比較（alpha、ACE和Chao1無(wú)對(duì)應(yīng)英文翻譯）樣本名稱優(yōu)質(zhì)reads數(shù)目OTU數(shù)目香農(nóng)指數(shù)ACE指數(shù)Chao1指數(shù)覆蓋率SimpsonNG258 96811.8091.1790.231.000.24圖4 Alpha指數(shù)稀疏曲線圖橫坐標(biāo)為樣本中隨機(jī)抽取序列數(shù)，縱坐標(biāo)為所得相應(yīng)的Alpha指數(shù)2.3細(xì)菌種類多樣性和豐度分析 利用blastn將OTU序列與對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，篩選出OTU序列的最佳比對(duì)結(jié)果，并對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行過濾，默認(rèn)滿足相似度90%且co

20、verage90%的序列被用來(lái)后續(xù)分類，不滿足條件的序列則被歸為unclassified。根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，統(tǒng)計(jì)樣本在各個(gè)分類層級(jí)水平上的群落組成如表2所示。以O(shè)TU的物種分類結(jié)果為依據(jù)， 分別在門、綱和屬3個(gè)分類級(jí)別上對(duì)樣本中的細(xì)菌種類和相對(duì)豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.。樣本的細(xì)菌種類覆蓋5個(gè)門，其中以變形桿菌門（Proteobacteria）為主， 占總數(shù)的69.23%，厚壁菌門(Firmicutes)28.26%次之，其中變形桿菌門genus水平上樹狀圖如圖5，厚壁菌門genus水平上樹狀圖如圖6。在綱的分類水平上， 包含8個(gè)綱，以變形菌綱（Betaproteobacteria，37.21%）和

21、芽孢桿菌綱（Bacilli，28.25%）為主。在目的分類水平上，包含13個(gè)目，以伯克氏菌目(Burkholderiales，37.21%)和芽孢桿菌目(Bacillales，24.38%)為主，在科的分類水平上，包含了25個(gè)科，以叢毛單胞菌科(Comamonadaceae，36.80%)和芽孢桿菌科(Bacillaceae，24.38%)為主。在屬的分類水平上， 包含29個(gè)屬，以玫瑰色半光合菌屬(Roseateles，36.75%)和芽胞桿菌屬(Bacillus，24.38%)為主。豐度大于1%的還有寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas，9.36%）、藤黃色桿菌屬（Luteibac

22、ter，1.45%）、乳球?qū)伲↙actococcus ，2.83%）（圖7）。而劉青梅等15通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法獲得散裝年糕中疑似腐敗菌，并采用分子生物學(xué)方法對(duì)細(xì)菌的進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)等方法鑒定出優(yōu)勢(shì)腐敗菌為芽孢桿菌和短芽孢桿菌兩大屬。胡慶松等16采用VITEK-32自動(dòng)化微生物分析儀鑒定系統(tǒng)、 API微生物鑒定系統(tǒng)和手工法鑒定引起散裝年糕腐敗的典型菌株為波茨坦短芽胞桿菌、巨大芽孢桿菌、乙酰短桿菌、希氏短桿菌。俞科偉等通過對(duì)發(fā)生腐敗變質(zhì)的真空包裝年糕中微生物進(jìn)行分離、純化和反證，經(jīng)過形態(tài)觀察、 生理生化、微生物鑒定系統(tǒng)等方法,初步鑒定 2株細(xì)菌分屬于枯草芽孢桿菌、不動(dòng)桿菌屬。黃麗金等17采用分

23、子生物學(xué)方法對(duì)真空年糕的腐敗菌進(jìn)行分離和鑒定，確定其優(yōu)勢(shì)菌為枯草芽孢桿菌。陳挺等18對(duì)真空年糕制品表面和內(nèi)部的微生物進(jìn)行分離純化,并通過形態(tài)特征的觀察和一些生理生化實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行鑒定得出主要優(yōu)勢(shì)菌株為醋酸鈣不動(dòng)桿菌、乙酰短桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和短芽孢桿菌。由此可以看出利用傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法等和高通量測(cè)序得到的年糕菌種具有基本一致的結(jié)果，但又不完全相同。此外，在屬的水平上，盡管不同方法的分析數(shù)據(jù)有差異，造成分析數(shù)據(jù)差異的原因可能在于年糕的不同包裝方式、不同培養(yǎng)時(shí)間和不同的腐敗時(shí)期菌群結(jié)構(gòu)鑒定也會(huì)造成優(yōu)勢(shì)菌屬及豐度的不同，但不同方法所得出豐度較高的菌屬中均含有芽胞桿菌屬。由于芽

24、孢桿菌屬的微生物能夠形成芽孢的特性使得它們能夠抵抗各種極端環(huán)境如高溫、極酸、極鹽，而且對(duì)各種殺菌劑具有抵抗力，因此，它們?cè)诟鞣N自然環(huán)境中都能被分離到19，并且引起年糕脹袋的微生物也很有可能是芽胞桿菌屬(Bacillus) 20。所以，如何抑制芽胞桿菌屬對(duì)于真空年糕的貯運(yùn)保鮮具有重要意義后續(xù)研究應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。除此之外，另一種優(yōu)勢(shì)菌屬玫瑰色半光合菌屬(Roseateles)是伯克氏菌目(Burkholderiales)分支的一個(gè)屬，而伯克氏菌目是一類能夠利用自身固氮的微生物，在水稻與環(huán)境的互作過程中可能發(fā)揮著重要的作用，是水稻的內(nèi)生有益菌21。故由稻米制作出的新鮮年糕可能攜帶該菌，造成該菌在年糕微生

25、物豐度中所占比例較大。圖5 樣本genus水平上變形桿菌門樹狀圖組成圖6 樣本genus水平上厚壁菌門樹狀圖組成表2 genus水平上樣本主要rank reads數(shù)目主要屬名序列數(shù)目主要屬對(duì)應(yīng)reads數(shù)與總reads數(shù)的百分比（%）玫瑰色半光合菌屬（Roseateles）951 736.75芽胞桿菌屬（Bacillus）630 224.38 寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）242 49.36乳球?qū)伲↙actococcus）7322.83明串珠菌屬（Leuconostoc）910.35藤黃色桿菌屬（Luteibacte）3751.45乳酸桿菌屬（Lactobacillus）10

26、70.41魏斯氏菌屬（Weissella）600.23不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）1980.76庫(kù)克菌屬（Kocuria）690.5圖7 樣本群落結(jié)構(gòu)分布圖3結(jié)論本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)分析了新鮮年糕經(jīng)真空包裝后置于37 下腐敗后的總菌群結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)菌屬。結(jié)果表明，年糕內(nèi)生細(xì)菌主要分布于玫瑰色半光合菌屬(Roseateles)和芽胞桿菌屬(Bacillus)、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），這3個(gè)屬是年糕的優(yōu)勢(shì)菌屬。參考文獻(xiàn)1林元灼. 傳統(tǒng)年糕工業(yè)化生產(chǎn)的研究J. 引進(jìn)與咨詢,2003,(07):36-38.LIN Yuanzhuo.Research on trad

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