外源性Wnt5a誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化表型的實(shí)驗(yàn)研究

1、外源性Wnt5a誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化表型的實(shí)驗(yàn)研究袁媛，司維柯，李招權(quán)，潘靜，趙宸【關(guān)鍵詞】誘導(dǎo)分化DifferentiatinPhentypesfK562ellsInduedbyExgenusnt5aKeyrdsnt5a；K562；indutindifferentiatin；ntsignalingJExpHeatl2022;15(5):946-949nt家族在個(gè)體發(fā)育及一些惡性腫瘤的發(fā)生、開展中起到重要作用1,2。nt5a屬于nt家族成員之一，近年來報(bào)道它也與腫瘤的發(fā)生親密相關(guān)3，但與白血病的關(guān)系報(bào)道較少。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，nt5a在急性、慢性髓系血病患者的外周血或骨髓以及一些髓系白血病細(xì)

2、胞株中均表達(dá)缺失或降低，并且外源性的nt5a可抑制K562細(xì)胞增殖并有誘導(dǎo)其分化的現(xiàn)象。在此根底上，本研究旨在進(jìn)一步確證外源性nt5a有誘導(dǎo)K562細(xì)胞定向成熟分化的作用，以提醒nt5a在白血病的發(fā)生、開展中的作用和機(jī)制，為白血病的診斷和治療提供新的診斷標(biāo)志物和基因治療靶點(diǎn)。材料和方法主要試劑外源性nt5a誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化表型的實(shí)驗(yàn)研究RPI1640培養(yǎng)液美國Gib公司產(chǎn)品，小牛血清杭州四季青生物材料研究所產(chǎn)品，小鼠抗人D13、D14、D68單克隆抗體北京中衫生物技術(shù)公司產(chǎn)品，二甲亞砜、胰酶美國Gib公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)人紅白血病細(xì)胞株K562、中國倉鼠卵巢細(xì)胞株H為本試驗(yàn)室保存，均置于10

3、熱滅活小牛血清的RPI1640培養(yǎng)液中,在37、52條件下培養(yǎng)。Adnt5a、AdGFP條件培養(yǎng)液的制備Adnt5a、AdGFP由美國芝加哥大學(xué)分子腫瘤研究室何通川教授贈送，構(gòu)建方法見文獻(xiàn)4。接種H細(xì)胞于6孔板，使集合度達(dá)60,分別參加Adnt5a和AdGFP各5l，培養(yǎng)16-48小時(shí)檢測熒光，根據(jù)熒光強(qiáng)度在48-72小時(shí)搜集培養(yǎng)液約6l,即為nt5a、GFP條件培養(yǎng)液，-4保存?zhèn)溆?。nt5a誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)K562細(xì)胞濃度為106/l，于6孔板中，每孔參加2lnt5a、GFP條件培養(yǎng)液、1lK562細(xì)胞懸液，培養(yǎng)K562細(xì)胞1-7天，每天搜集細(xì)胞用于下述實(shí)驗(yàn)。K562細(xì)胞分化形態(tài)學(xué)觀

4、察分別用nt5a、GFP條件培養(yǎng)液處理K562細(xì)胞1-7天，每天搜集細(xì)胞，離心后對涂片進(jìn)展瑞氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。處理K562細(xì)胞2、5天，搜集細(xì)胞離心，用PBS洗滌2次后，2.5戊二醛固定，常規(guī)制備電子顯微鏡檢的超薄切片，透射電子顯微鏡下觀察超微構(gòu)造的變化。nt5a誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化的細(xì)胞化學(xué)染色nt5a誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化時(shí)細(xì)胞外表分化抗原檢測搜集處理1、3、5天的K562細(xì)胞，離心涂片進(jìn)展免疫細(xì)胞化學(xué)染色，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)展，D13、D14、D68陽性結(jié)果斷定：光子顯微鏡下觀察，胞漿中呈棕黃色者為陽性細(xì)胞，每例隨機(jī)選出10個(gè)不重復(fù)、不重疊的高倍視野104

5、0，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率，結(jié)果與GFP組比擬并做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。nt5a誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化時(shí)細(xì)胞周期的變化nt5a、GFP條件培養(yǎng)液分別處理K562細(xì)胞1、3、5天，細(xì)胞終濃度為1106/l，離心搜集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，70預(yù)冷乙醇固定，RNA酶消化，碘化丙錠PI室溫染色30分鐘后，上流式細(xì)胞儀檢測，分析得出處理1、3、5天的K562細(xì)胞周期各時(shí)相的比例。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)展單因素方差分析，數(shù)據(jù)以SD表示。結(jié)果nt5a誘導(dǎo)K562細(xì)胞的形態(tài)及超微構(gòu)造變化光子顯微鏡下觀察，nt5a條件培養(yǎng)液處理5天的K562細(xì)胞與對照細(xì)胞比擬，顯示細(xì)胞體積縮小，核漿比減小

6、，核染色質(zhì)濃縮，核仁減少或消失，有的核出現(xiàn)了凹陷圖1，并且出現(xiàn)了個(gè)別典型單核細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞圖1D。電子顯微鏡下觀察，nt5a處理的細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)增多，電子密度增大，核仁減小，或變小，胞質(zhì)增多，核漿比減小，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、核糖體、線粒體等明顯增多，并隨處理時(shí)間的延長成熟形態(tài)特征更明顯圖2。nt5a誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化的細(xì)胞化學(xué)染色nt5a誘導(dǎo)K562分化時(shí)細(xì)胞外表抗原標(biāo)記利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測細(xì)胞外表分化抗原D13、D14、D68，并計(jì)算陽性率。結(jié)果顯示：nt5a處理3-5天的K562細(xì)胞，單核細(xì)胞系外表標(biāo)志抗原D14、D68陽性率明顯高于GFP對照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析二者有顯著性差異p0.01，粒細(xì)胞系外表分化抗原D13表達(dá)的增強(qiáng)與對照組比擬無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p0.05表2。nt5a誘導(dǎo)K562細(xì)胞的細(xì)胞周期變化K562細(xì)胞分別用條件培養(yǎng)液處理5天，GFP處理組細(xì)胞的G1期細(xì)胞為41.53%，S期為53.19%，G2期為5.27%，這說明K562細(xì)胞處于增殖旺盛狀態(tài)。nt5a處理組細(xì)胞G1期為34.47%，S期為48.57%，G2期為16.95%，處理組與對照組K562細(xì)胞相比G2期增高了2.22倍，提示nt5a作用5天，能將細(xì)胞阻滯在G2期，使細(xì)胞不能進(jìn)展正常的有絲分裂，從而抑制了細(xì)胞的增殖表3。討論總之，結(jié)合我們既往的研究及本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)nt