分子排阻色譜法測(cè)定多糖分子量及其分布--梁翠榮

1、分子排阻色譜法測(cè)定多糖分子量及其分布1分離原理 凝膠滲透色譜 Gel Permeation Chromatography GPC 也稱體積排阻色譜 Size Exclusion Chromatography SEC 讓被測(cè)量的高聚物溶液通過一根內(nèi)裝不同孔徑的色譜柱，柱中可供分子通行的路徑有顆粒間的間隙（較大）和顆粒內(nèi)的微孔（較?。?。當(dāng)聚合物溶液流經(jīng)色譜柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時(shí)移動(dòng)的速度較快（即保留時(shí)間短）；小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，洗脫時(shí)移動(dòng)的速度要慢得多（即保留時(shí)間長(zhǎng)）。經(jīng)過一定長(zhǎng)度的色譜柱

2、，分子根據(jù)相對(duì)分子大小被分開，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。 2測(cè)定方法直接法：在測(cè)定淋出液濃度的同時(shí)，測(cè)定其粘度或光散射，從而求出其分子量。間接法：用一組分子量不等的、單分散的試樣為標(biāo)準(zhǔn)樣品，分別測(cè)定它們的淋出體積（保留時(shí)間），建立保留時(shí)間與分子量二者之間的關(guān)系，從而求出其分子量。3間接法 右旋糖酐分子量對(duì)照品（ 供右旋糖酐分子量測(cè)定用 中檢所） 右旋糖酐分子量D1 M 2500 ； 右旋糖酐分子量D2 M 4600 ； 右旋糖酐分子量D3 M 7100； 右旋糖酐分子量D4 M 10000； 右旋糖酐分子量D5 M 21400；右旋糖酐分子量D6 M 41100 ； 右旋糖酐分子量D7 M 844

3、00； 右旋糖酐分子量D8 M 133800； 右旋糖酐分子量D0 M 180； 右旋糖酐分子量D2000 M 20000004校正原理 用已知相對(duì)分子質(zhì)量的單分散標(biāo)準(zhǔn)聚合物做一條淋洗體積或淋洗時(shí)間和相對(duì)分子量對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線，稱為“校正曲線”。聚合物中幾乎找不到單分散的標(biāo)準(zhǔn)樣，一般用窄分布的試樣代替。在相同的測(cè)試條件下，做一系列的GPC標(biāo)準(zhǔn)譜圖，以重均分子量的對(duì)數(shù)值(lgM)對(duì)保留時(shí)間(t)作圖，所得曲線即為“校正曲線”。通過校正曲線，就能從GPC譜圖上計(jì)算各種所需相對(duì)分子量與相對(duì)分子量分布的信息。5色譜柱 各種色譜柱的孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限和最小極限。分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的

4、，就會(huì)全部被排阻在凝膠顆粒之外，這種情況叫全排阻。兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能有分離效果。直徑比凝膠最小孔直徑小的分子能進(jìn)入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進(jìn)入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別，也不會(huì)有好的分離效果。因此，色譜柱有一定的使用范圍。6色譜柱的選用 親水性球型高聚物為填充劑（TSK G PWXL柱, Shodex OHpak SB HQ柱） 右旋糖酐鐵 TSK G2500 PWXL 右旋糖酐20 TSK G3000 PWXL 右旋糖酐40 TSK G4000 PWXL 右旋糖酐70 TSK G4000 PWXL7檢測(cè)系統(tǒng) 多糖的檢測(cè)，最常用的檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器（通用型

5、檢測(cè)器）。通過連續(xù)地測(cè)定淋出液折光指數(shù)的變化來測(cè)定樣品的濃度，只要溶劑的折光指數(shù)與被測(cè)樣品的折光指數(shù)有區(qū)別均能檢測(cè)。 8測(cè)定方法色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) TSK G PWXL柱 柱溫35 進(jìn)樣量20l 流動(dòng)相：0.71%硫酸鈉溶液(內(nèi)含0.02%疊氮化鈉) 0.5ml/min 取葡萄糖和葡聚糖2000，分別加流動(dòng)相制成10mg/ml 的溶液，進(jìn)樣,測(cè)得保留時(shí)間tT和t0，對(duì)照品溶液和供試品溶液的保留時(shí)間均應(yīng)在tT和t0之間，理論板數(shù)按葡萄糖峰計(jì)算不小于5000。對(duì)照品溶液：取右旋糖酐分子量對(duì)照品(中檢所) 適量，分別加流動(dòng)相制成10mg/ml 的溶液，室溫放置過夜。供試品溶液： 取供試品適量，加流動(dòng)相制成10mg/ml 的溶