臨床生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)ppt課件

1、常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第五章.第一節(jié) 光譜分析技術(shù)第二節(jié) 電化學(xué)分析第三節(jié) 電泳技術(shù)第四節(jié) 層析技術(shù)第五節(jié) 離心技術(shù)第六節(jié) 自動生化分析技術(shù) 只講第一節(jié)，其它內(nèi)容在中講授。本章內(nèi)容概要.教學(xué)目的和要求1、掌握分光光度技術(shù)的根本原理及定性和定量方法。2、熟習(xí)分光光度計的的根本構(gòu)造和操作方法光源檢查和波長校正、原子分光光度計的類型和影響熒光分析的要素3、了解其他光譜分析技術(shù)的根本原理及在生化檢驗(yàn)中的運(yùn)用。.第一節(jié) 光譜分析技術(shù)分光光度技術(shù)的根本原理分光光度計的根本構(gòu)造分光光度計的操作方法 分光光度技術(shù)的定性和定量方法 .光譜分析技術(shù)原理： 利用各種化學(xué)物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征，以此來

2、確定物質(zhì)性質(zhì)、構(gòu)造或含量。光譜分析技術(shù)分類：發(fā)射光譜分析技術(shù)：火焰光度法、原子發(fā)射光譜法和熒光光譜法 吸收光譜分析技術(shù)：紫外、可見光分光光度法，原子吸收分光光 度法和紅外光譜法 散射光譜分析技術(shù)：比濁法 .一、分光光度技術(shù)的根本原理一吸光度與透光度 A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I 當(dāng)光線經(jīng)過均勻、透明的溶液時可出現(xiàn)三種情況：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透過溶液。設(shè)入射光強(qiáng)度為I0，透射光強(qiáng)度為I，I和I0之比稱為透光度，即：T = I/I0 T100為T%稱為百分透光度。透光度的負(fù)對數(shù)稱為吸光度即：.二Lambert-Beer定律 Lambert-Bee

3、r定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層厚度之間關(guān)系的根本定律，該定律是分光分析的實(shí)際根底。其表達(dá)式為： A = KLC 式中A為吸光度；K為比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)；L為溶液層厚度，稱為光徑；C為溶液濃度 Lambert-Beer定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體。. 據(jù)Lambert-Beer定律，當(dāng)液層厚度為cm，濃度單位為mol/L時，吸光系數(shù)K稱為摩爾吸光系數(shù)()。的意義是：當(dāng)液層厚度為1cm，物質(zhì)濃度為1mol/L時在特定波長下的吸光度值。是物質(zhì)的特征性常數(shù)。 .三偏離Lambert-Beer定律的要素 運(yùn)用Lambert-Beer定律產(chǎn)生誤差主要來源于光學(xué)和化學(xué)兩方

4、面的要素。1光學(xué)要素： 要求入射光是單色光。入射光的譜帶越寬，其誤差越大。 2化學(xué)要素： 濃度、pH、溶劑和溫度等要素可影響化學(xué)平衡。 .二、分光光度計的根本構(gòu)造最常用的是可見分光光度計和紫外-可見光分光光度計 光源單色器比色杯檢測器顯示器五大部份構(gòu)造：.一光源光源定義： 指一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。光源應(yīng)在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出延續(xù)光譜，并有足夠的強(qiáng)度和良好的穩(wěn)定性，在整個光譜區(qū)域內(nèi)光的強(qiáng)度不應(yīng)隨波長有明顯的變化。 光源種類： 可見光分光光度計常用光源是鎢燈或鹵鎢燈。 紫外光光度計常用氫燈作為光源。 .二單色器定義： 未來自光源的復(fù)合光分散為單色光的安裝稱為分光系統(tǒng)或單色器

5、。 種類： 濾光片棱鏡光柵.三比色杯又稱為吸收池或比色皿 資料：常用無色透明、耐腐蝕和耐酸堿的玻璃或石英資料做成 五顯示器四檢測器 檢測器是將透過溶液的光信號轉(zhuǎn)換為電信號，并將電信號放大的安裝。常用的檢測器為光電管和光電倍增管。 是將光電管或光電倍增管放大的電流經(jīng)過儀表顯示出來的安裝。 .三、分光光度計的操作方法一分光光度計的根本操作以721-A型分光光度計為例，其根本的操作步驟為：1.開721-A分光光度計的開關(guān)，將比色池的蓋子翻開，通電20分鐘使儀器預(yù)熱。2.將波長旋至測定的波長。3.將空白液、校準(zhǔn)液或待測液放入比色池，將空白液置于光路中。4.將開關(guān)置于T位，翻開比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光

6、量細(xì)調(diào)調(diào)理T為0.0,關(guān)上比色池蓋子，調(diào)理T為100.0。5.將開關(guān)置于A，用消光調(diào)零調(diào)理A為0.06.反復(fù)步驟4和57.將校準(zhǔn)液或待測液推入光路，丈量溶液的吸光度A.二吸光度的校正 鉻酸鉀的規(guī)范液可用于校正分光光度計的吸光度。在25，將4mg鉻酸鉀溶于100ml的0.05mol/L KOH中，放入比色池中，在不同波長下測定吸光度值，與己知的規(guī)范吸光度校正表進(jìn)展比較，可檢測儀器吸光度的準(zhǔn)確度。 .四、分光光度技術(shù)的定性和定量方法一分光光度技術(shù)的定性方法定性根據(jù)：最大吸收波長max和摩爾吸光系數(shù) 2.摩爾消光系數(shù)方法1.最大吸收波長max方法.二分光光度技術(shù)的定量方法1.規(guī)范曲線法 根據(jù)Lamb

7、ert-Beer定律，液體的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的規(guī)范品溶液濃度應(yīng)包含高、中、低濃度范圍，按標(biāo)本處置方法作一樣處置，在特定波長下測定吸光度，以規(guī)范液濃度為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，按最小二乘法的原理，將對應(yīng)各點(diǎn)連成一條經(jīng)過原點(diǎn)的直線，這條直線稱為規(guī)范曲線。待測溶液測定吸光度后，從規(guī)范曲線上可查出其相應(yīng)的濃度。方法：.制造和運(yùn)用規(guī)范曲線時應(yīng)留意下面幾點(diǎn)：1測定條件發(fā)生變化時如改換規(guī)范品和試劑等，應(yīng)重新繪制。2規(guī)范品應(yīng)有高的純度，規(guī)范液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。3當(dāng)待測液吸光度超越線性范圍時，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測定。4標(biāo)本測定的條件應(yīng)和規(guī)范曲線制造時的條件完全一致。.2比較法 Cu=(AuCs)/As 己知濃度的規(guī)范品和標(biāo)本作同樣處置，運(yùn)用一樣的空白，同時測定規(guī)范管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及規(guī)范品濃度，可直接計算出標(biāo)本的濃度，計算公式為： 其中Cu和Au為標(biāo)本管濃度和吸光度，Cs和As分別為規(guī)范管濃度和吸光度。用規(guī)范品法定量時，規(guī)范品的濃度應(yīng)盡量和標(biāo)本管濃度相近。 .3其它分析方法 包括差示法、多組份混合物分析和利用摩爾吸光