2016年分子診斷微流控技術(shù)分析報(bào)告

1、2016年分子診斷微流控技術(shù)分析報(bào)告（此文檔為word格式，可任意修改編輯?。?016年2月正文目錄1、分子診斷概述42、分子診斷技術(shù)原理421、核酸提取方法422、核酸分子雜交技術(shù)523、核酸擴(kuò)增技術(shù)5231、常規(guī) PCR 5232、定量PCR技術(shù)6（1）熒光染料7（2）熒光探針7233、等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)83、生物芯片931微陣列芯片1032微流控芯片104、國內(nèi)外POCT化的分子診斷產(chǎn)品1341、Cepheid 的 GeneXpert 1342、Nanospere 的 Verigene 系統(tǒng) 1443、卡優(yōu)迪生物科技的Mini8 1444、 北京博奧生物的RTisochip-A核酸分析儀1

2、55、國內(nèi)重點(diǎn)公司分析1651、利德曼1652、博暉創(chuàng)新176、發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)分析181、分子診斷概述分子診斷是采用分子生物學(xué)的理論和技術(shù)，通過直接探查核 酸的存在狀態(tài)或缺陷，從核酸結(jié)構(gòu)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或翻譯水平分析 核酸的功能，從而對人體狀態(tài)與疾病做出診斷的方法。它檢測的 基因有內(nèi)源性（即機(jī)體自身的基因）和外源性（如病毒、細(xì)菌等） 兩種，前者用于診斷基因有無病變，后者用于診斷有無病原體感 染?；仡櫡肿釉\斷學(xué)20余年的發(fā)展歷史，大致經(jīng)歷3個(gè)階段：1）利用核酸分子雜交技術(shù)進(jìn)行遺傳病的基因診斷；2）利用以定量PCR為代表的核酸擴(kuò)增技術(shù)，檢測存在于宿 主的多種DNA和RNA病原體，及多基因遺傳病細(xì)胞中 mRN

3、A的表達(dá)量；3）以生物芯片技術(shù)為代表的高通量密集型檢測技術(shù)，分析 過程自動化、分析速度提高，實(shí)現(xiàn)高通量、大規(guī)模的快速檢測病 原體和疾病組織中的突變序列。PCR產(chǎn)品占據(jù)目前分子診斷的主要市場，生物芯片是分子 診斷市場發(fā)展的主要趨勢。2、分子診斷技術(shù)原理分子診斷的主要技術(shù)有核酸提取方法、核酸分子雜交、核酸 擴(kuò)增技術(shù)。21、核酸提取方法傳統(tǒng)的DNA提取方法是一般先破碎細(xì)胞，用含少量異戊 醇的氯仿除去蛋白質(zhì)，而核酸保留在水相中，加入RNA酶去除 RNA，最后用異丙醇、乙醇把DNA從提取液中沉淀出來。而磁珠法核酸提取，通過超順磁性氧化硅納米磁珠與核酸分 子特異性地識別和高效結(jié)合，在Chaotropic鹽

4、（鹽酸胍、異硫 氰酸胍等）和外加磁場的作用下，能將核酸從血液、動物組織、 食品、病原微生物等樣本中分離出來。相比傳統(tǒng)的核酸提取方法， 磁珠法核酸提取具有自動化、高通量、操作簡單、用時(shí)短、安全 無毒、提取的核酸純度高等特點(diǎn)。22、核酸分子雜交技術(shù)具有一定互補(bǔ)序列的核昔酸單鏈在液相或固相中按堿基互 補(bǔ)配對原則締合成異質(zhì)雙鏈的過程，稱為核酸分子雜交。雜交的 雙方是待測核酸序列和探針序列，通過檢測核酸探針序列上的標(biāo) 記物，來反映待測核酸序列的含量。探針的標(biāo)記需要高靈敏性、 不影響堿基配對的特異性、不影響探針分子的主要理化性質(zhì)、對 酶促反應(yīng)活性無影響、檢測方法具有高靈敏性和特異性。標(biāo)記方 法包括32P、

5、35S和3H等核素標(biāo)記物及生物素、熒光素或者化 學(xué)放光探針等非核素標(biāo)記物。核酸分子雜交技術(shù)包括固液雜交和液相雜交，固液雜交則包 含膜上印記雜染(Southern和Northern)和原位雜交；液相雜 交則包括RNA酶保護(hù)分析法及核酸酶S1保護(hù)分析法等。23、核酸擴(kuò)增技術(shù)核酸擴(kuò)增是一大類技術(shù)方法的總稱，目前包括常規(guī)PCR、 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)等。231、常規(guī) PCR聚合酶鏈反應(yīng)(即 polymerase chain reaction，PCR)原理：PCR 是模板DNA、引物和四種脫氧核糖核昔三磷酸(dNTP )在DNA聚合酶作用下發(fā)生酶促聚合反應(yīng)，擴(kuò)增出所需目的DNA。包括 三

6、個(gè)基本步驟：雙鏈DNA模板加熱（90-96C ）變性成單鏈（變性 Denature）；在低溫（50C左右）下引物與單鏈DNA互補(bǔ)配對（退火 Annealing）; 在適宜溫度下TapDNA聚合酶催化引物沿著模 板 DNA 延伸 Elongation o由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)將使目 的DNA擴(kuò)增一倍，這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪 循環(huán)的模板，所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)106倍。232、定量PCR技術(shù)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基 團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán) 變得“可見”，最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣

7、品中的DNA或 者cDNA的起始濃度進(jìn)行定量的方法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是 目前確定樣品中DNA或cDNA拷貝數(shù)最敏感、最準(zhǔn)確的方 法。對實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)記的熒光基團(tuán)包含有以SYBR染料為代 表的非特異性熒光標(biāo)記（僅與DNA雙鏈結(jié)合）、以及以Taqman 探針為代表的特異性熒光標(biāo)記（利用熒光能量共振轉(zhuǎn)移fret 技術(shù)來進(jìn)行檢測）。（1）熒光染料在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒 光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻 入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒 光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈 DNA進(jìn)行結(jié)合，可以通過溶

8、解曲線確定PCR反應(yīng)是否特異。（2）熒光探針將標(biāo)記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完 成高溫變性，低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反 應(yīng)規(guī)律，與模板DNA互補(bǔ)配對的Taqman探針被切斷，熒光 素游離于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù) 的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實(shí)時(shí)檢測 與之對應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號強(qiáng)度，求得Ct值，同時(shí)利用數(shù)個(gè)已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對照，即可得出待測標(biāo)本目的基因 的拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)無需雜交檢測，可以實(shí)時(shí)檢測結(jié)果，加 快了檢測的速度，只需要1-2小時(shí)的時(shí)間就能得到檢測結(jié)果。 但在進(jìn)行多種病原體檢測的時(shí)候，

9、需要向同一體系中加入多種病 原體的特異性引物，由于不同PCR引物擴(kuò)增效率、反應(yīng)體系不 同等問題，定量PCR非常難以應(yīng)用于多重檢測。233、等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是繼PCR技術(shù)后發(fā)展起來的一門新型的體外 核酸擴(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增反應(yīng)的全過程（除初始的雜交步驟外）均在 單一溫度，無需專門的擴(kuò)增儀器下進(jìn)行。目前主要的恒溫?cái)U(kuò)增技 術(shù)有：滾環(huán)核酸擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、鏈替代擴(kuò)增、依賴核酸 序列擴(kuò)增和解鏈酶擴(kuò)增。它們都具有共同的特點(diǎn)：恒溫、高效、 特異、不需要特殊的儀器設(shè)備。其中依賴核酸序列擴(kuò)增與環(huán)介 導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增是相對穩(wěn)定的技術(shù)，應(yīng)用較多。3、生物芯片生物芯片技術(shù)是近年發(fā)展起來的分子生物學(xué)與微電子技術(shù) 相

10、結(jié)合的核酸分析檢測技術(shù)，是運(yùn)用分子生物學(xué)、基因信息、分 析化學(xué)等原理進(jìn)行設(shè)計(jì)，以硅晶圓、玻璃或高分子為基材，配合 微機(jī)電自動化或其他精密加工技術(shù)，所制作的高科技元件，具有 快速、精確、低成本之生物分析檢驗(yàn)?zāi)芰?。生物芯片樣品處理?力強(qiáng)、用途廣泛、自動化程度高等特點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景和 商業(yè)價(jià)值，是分子診斷領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。生物芯片根據(jù)原理不 同，可分為微陣列芯片(Microarrays)和微流控芯片(Microfluidic chip)兩類。31微陣列芯片最初的生物芯片技術(shù)主要目標(biāo)是用于DNA序列測定、基 因表達(dá)譜鑒定和基因突變體檢測和分析，所以又稱為DNA微 陣列或基因芯片技術(shù)。微陣列芯片的

11、作用原理是在固相支持物上 原位合成寡核昔酸或者直接將大量探針以顯微打印的方式有序 地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對雜交的檢 測分析，得出樣品的遺傳信息。微陣列芯片在數(shù)平方厘米之面 積上布放數(shù)千或數(shù)萬個(gè)核酸探針，檢體中的DNA、cDNA、RNA 等與探針結(jié)合后，借由熒光或電流等方式偵測，一次測驗(yàn)即可提 供大量基因序列相關(guān)信息，具有快速、精確、低成本之生物分 析檢驗(yàn)?zāi)芰Α?2微流控芯片現(xiàn)階段，生物芯片已經(jīng)朝著一個(gè)高度自動化、集成化的方向 發(fā)展，核心理念就是建立一個(gè)“芯片上的實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-chip)， 微流控技術(shù)的發(fā)展使得這個(gè)理念得到實(shí)現(xiàn)。微流控芯片是指通過 微電子機(jī)械系

12、統(tǒng)(Micro-electro-mechanical Systems，MEMS)技術(shù)在 固體芯片表面構(gòu)建微型生物化學(xué)分析單元和系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對無機(jī) 離子、有機(jī)物質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸以及其他生化組分的準(zhǔn)確、快速 和大信息量的檢測。在微流控技術(shù)用于核酸診斷的應(yīng)用過程中，將核酸提取、擴(kuò) 增及檢測過程等基本操作單元集成到一塊幾平方厘米大小的芯 片上，并以微通道網(wǎng)絡(luò)貫穿各個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，從而實(shí)現(xiàn)對整個(gè)實(shí)驗(yàn) 系統(tǒng)的靈活操控，承載核酸診斷的各項(xiàng)功能。微流控芯片技術(shù)將 核酸診斷過程全面整合，只需加入樣本即可，大大簡化了檢測過 程的操作難度，排除了不同操作者實(shí)驗(yàn)技能的影響，并解決了外 源核酸對檢測結(jié)果的干擾問題。圖表7：

13、微流控芯片是一個(gè)完整的微型實(shí)驗(yàn)室微流控芯片樣品體積只需幾微升，加熱器直接集成在芯片 上，與傳統(tǒng)的PCR相比，在相同擴(kuò)增效率下，芯片的熱循環(huán)效率快2-10倍。同時(shí)連續(xù)流動式PCR、熱對流驅(qū)動PCR等技術(shù) 的使用，使得擴(kuò)增過程加快，現(xiàn)有的微流控芯片能夠?qū)⒃\斷檢測 過程縮短至最低10-15分鐘。圖表8：微流控芯片PCR技術(shù)微流控芯片中具有很多微管道，可對不同的反應(yīng)室進(jìn)行隔 離。微流控芯片中不同反應(yīng)互不干擾，從而具有多重檢測的功能， 可同時(shí)檢測多個(gè)樣本，或同一樣本的不同指標(biāo)。由此，通過在微 流控芯片中設(shè)置多個(gè)反應(yīng)室，最多可同時(shí)進(jìn)行數(shù)十個(gè)檢測，實(shí)現(xiàn) 高通量檢測。圖表9:微流控可實(shí)現(xiàn)多重檢測微流控芯片所使

14、用的材質(zhì)為玻璃、硅片、聚合物等，成本不 高；制作方法包括光刻、蝕刻、模塑法、注塑法、激光燒蝕法等， 制作工藝也較為成熟；對液體流動過程的控制也有電動流控制、 數(shù)字化微流控、壓力驅(qū)動流體控制、被動毛細(xì)力流體控制等多種 控制方式。微流控芯片的生產(chǎn)具有較為成熟的工藝，已經(jīng)被用于 電化學(xué)血?dú)夥治?、心肌?biāo)志物免疫檢測、病原體核酸診斷等多個(gè) 方面。圖表10：微流控芯片可作為合適的POCT產(chǎn)品由以上所知，微流控芯片滿足了 POCT在檢測性能、易用 性、成本上的各種需求，簡化了操作步驟，顯著提高檢測效率， 是核酸診斷POCT化的重要發(fā)展方向。4、國內(nèi)外POCT化的分子診斷產(chǎn)品41、Cepheid 的 Gene

15、XpertGeneXpert PCR儀包含微流樣品管、超聲裝置、注射裝置、 旋轉(zhuǎn)裝置、直角光路設(shè)計(jì)的特殊定量PCR反應(yīng)管等幾個(gè)部分， 從樣品制備到完成測試最快僅需30分鐘左右，大大縮減了樣品 的制備時(shí)間。PCR儀具有四種不同的型號，分別具有1、2、4、 16個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)模塊，每個(gè)反應(yīng)模塊均具有獨(dú)立的光學(xué)以及熱 學(xué)校準(zhǔn)，可以隨時(shí)分別開始反應(yīng)；一臺電腦可同時(shí)連接6臺 PCR儀，靈活性強(qiáng)，極大滿足了實(shí)驗(yàn)室對檢測量的需求，同時(shí) 也降低了成本。相應(yīng)的試劑盒Xpert MRSA則是將酶、dNTPs、緩沖液等全 部濃縮在一個(gè)微珠(Bead)中，而基因特異性引物、熒光探針、內(nèi) 參則包含于另一個(gè)微珠中。檢測時(shí)，

16、只需將兩個(gè)微珠加入卡盒中,GeneXpert PCR儀就可以自動完成樣品測試，大大減輕了操作人 員的工作強(qiáng)度。獨(dú)特的微珠試劑設(shè)計(jì)一方面可保持樣品和試劑在 常溫下的穩(wěn)定性，以及在微流樣品管中的快速溶解，另一方面也 便于精確操作減少誤差，使得同一反應(yīng)在任何時(shí)候任何地點(diǎn)都可 以得到高度一致的檢測結(jié)果。圖表11： GeneXpertPCR儀及試劑盒Cepheid公司的試劑利用定量PCR的方法來檢測，無需雜 交，整體速度很快。在進(jìn)行多種病原體檢測的時(shí)候，單個(gè)卡盒很 難進(jìn)行多重檢測，但可以同時(shí)使用多個(gè)卡盒，通量的問題得以解 決，但成本過高。42、Nanospere 的 Verigene 系統(tǒng)Verigen

17、e系統(tǒng)可自動完成提取核酸、雜交、并通過銀染染色 將雜交信號放大，之后得到定量的分析數(shù)據(jù)。Nanosphere使用 直徑13-20nm的帶有寡核昔酸修飾的納米微球，使用納米微球 比普通的熒光微球具有更好的靈敏度。甚至可以不需要進(jìn)行 PCR，僅通過信號擴(kuò)增就能完成檢測。Verigene系統(tǒng)將反應(yīng)器 和讀數(shù)器分開，檢測的方便性較GeneXpert弱，同時(shí)需要有雜交的步驟，反應(yīng)時(shí)間也較慢，但Verigene系統(tǒng)的卡盒可適用于多 重檢測，為檢測帶來了方便性。圖表12： Nanosphere的Verigene卡條及儀器43、卡優(yōu)迪生物科技的Mini8卡尤迪生物科技是中國首家專注研發(fā)手持型通用熒光定量 PC

18、R儀的生物公司，其首創(chuàng)的“一鍵式一步法Mini8實(shí)時(shí)熒光 定量PCR檢測系統(tǒng)”，簡化了核酸的提取步驟，重量僅21kg， 可使用12V直流電源，適合車載移動使用，最快10-15分鐘得 到結(jié)果。2015年為非洲埃博拉疫情,Mini8實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢 測系統(tǒng)被列入WHO官方名錄，成為中國首家入選的核酸檢測 設(shè)備供應(yīng)商。另外公司仍在利用Utah大學(xué)的Extreme PCR技術(shù)，開發(fā) 僅需10多秒就能得到檢測結(jié)果的新一代產(chǎn)品。圖表13:卡優(yōu)迪Mini8實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測系統(tǒng)44、北京博奧生物的RTisochip-A核酸分析儀2015年4月20日，CFDA批準(zhǔn)博奧生物集團(tuán)有限公司的 恒溫?cái)U(kuò)增微 流

19、控芯片核酸分析儀RTisochip-A醫(yī)療器械注冊。博奧生物利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)，無需90C以 上的高溫變性過程，特異性更高，反應(yīng)更快，最快20分鐘出結(jié) 果；微流控碟式芯片上的24個(gè)檢測通道，避免不同反應(yīng)池的交 叉污染，可以進(jìn)行多指標(biāo)的并行檢測；每個(gè)樣品反應(yīng)量僅需14 皿，節(jié)省反應(yīng)試劑，非常符合快速診斷的需求。為了充分滿足客 戶對不同檢測樣品數(shù)和指標(biāo)數(shù)的需求，博奧生物提供1*24、 2*11、3*8三種不同型號的碟式芯片。5、國內(nèi)重點(diǎn)公司分析51、利德曼北京利德曼（300289）將與英國ENIGMA DIAGNOSTICS LIMITED （以下簡稱“Enigma”）合作共同設(shè)立

20、合資公司，成為 Enigma的獨(dú)家合資伙伴，向中國市場交付Enigma Mini Laboratory床邊分子診斷系統(tǒng)。Enigma將向該合資企業(yè)轉(zhuǎn)授權(quán)其技術(shù)和知識產(chǎn)權(quán)，使之能 為中國市場開發(fā)相關(guān)的分子檢測、其他產(chǎn)品和儀器，并能在中國境內(nèi)制造生產(chǎn)。Enigma公司成立于2004年，系一家設(shè)立并 注冊于英格蘭和威爾士的公司，專注于分子診斷設(shè)備、檢測及其 他產(chǎn)品，擁有 Defence Science Technology Laboratory 授予的一系 列專利的獨(dú)家許可以及美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司和Celera Licences 的實(shí)時(shí)PCR設(shè)備推廣的許可，并致力于研發(fā)和商業(yè)化項(xiàng)目。Enigma M

21、L系統(tǒng)提供了將現(xiàn)有分子診斷的前處理、PCR檢 測、數(shù)據(jù)處理和分析、數(shù)據(jù)傳輸合為一體的全自動化解決方案， 將反應(yīng)所需的全部試劑預(yù)裝入一次性卡架內(nèi)進(jìn)行操作，免去了之 前PCR產(chǎn)品費(fèi)時(shí)費(fèi)力的樣本核酸提取和其它操作過程。此產(chǎn)品 利用實(shí)時(shí)定量PCR的方法進(jìn)行檢測，將獨(dú)有的直接加熱技術(shù)應(yīng) 用于PCR擴(kuò)增過程中，即保留了定量PCR快速的特點(diǎn)，又利 用特有的實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系實(shí)現(xiàn)單管一次性多指標(biāo)檢測。Enigma ML系統(tǒng)的測試數(shù)據(jù)可安全上傳至云端服務(wù)器，可 集中進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)處理，同時(shí)在醫(yī)院臨檢系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn) 檢測結(jié)果的實(shí)時(shí)傳輸和遠(yuǎn)程診療。52、博暉創(chuàng)新博暉創(chuàng)新（300318）于2007年4月與美國Kionix公司成 立合資公司博昂尼克，獲得了 Kionix公司“層狀微流體結(jié)構(gòu)與制造方法