微生物實(shí)驗(yàn)十

1、流感病毒的分離培養(yǎng)一、流感病毒的MDCK細(xì)胞分離方法二、流感病毒分離培養(yǎng)之雞胚培養(yǎng)法 1一、流感病毒MDCK細(xì)胞分離方法（一）生物安全要求H5,H7亞型高致病性禽流感病毒，H2N2亞型流感病毒的MDCK細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別：BSL-3。實(shí)驗(yàn)操作人員需進(jìn)行BSL-3防護(hù)，具體詳見(jiàn)“生物安全個(gè)人防護(hù)SOP”。H5,H7亞型高致病性禽流感病毒，H2N2亞型流感病毒的MDCK細(xì)胞分離操作必須在BSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜中進(jìn)行。2其余流感病毒的MDCK細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別：BSL-2。實(shí)驗(yàn)操作人員需進(jìn)行BSL-2防護(hù)，具體詳見(jiàn)“生物安全個(gè)人防護(hù)SOP”。其余流感病毒的MDCK細(xì)胞分離操作

2、必須在BSL-2級(jí)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜中進(jìn)行。3（二）材料1、7590成片的MDCK細(xì)胞，選用合適大小的細(xì)胞培養(yǎng)瓶和細(xì)胞培養(yǎng)板來(lái)用做病毒分離2、胰酶（牛胰腺來(lái)源型）3、HEPES緩沖液，1M母液 4、D-MEM培養(yǎng)基，Hanks液5、青、鏈霉素母液（10000U/mL 青霉素G；10000g/mL硫酸鏈霉素 46、牛血清白蛋白組分，7.5%溶液7、臨床樣品0.5mL8、1mL無(wú)菌移液管9、10mL無(wú)菌移液管10、15mL無(wú)菌離心管5（三）實(shí)驗(yàn)步驟1、準(zhǔn)備病毒生長(zhǎng)液（1）細(xì)胞維持液準(zhǔn)備500mL D-MEM液中加入青、鏈霉素母液 5mL（終濃度達(dá)：100U/mL青霉素；100g/mL鏈霉素）牛血清

3、白蛋白組分 12.5mL（終濃度：0.2%）HEPES緩沖液 12.5mL（終濃度：25mM）6（2）病毒生長(zhǎng)液每500mL細(xì)胞維持液中加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液濃度為2mg/mL）使TPCK-胰酶的終濃度為2g/mL。2流感病毒MDCK細(xì)胞分離步驟：（1）7590成片細(xì)胞的準(zhǔn)備，以選取T25細(xì)胞瓶為例。用40物鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。輕輕倒出細(xì)胞生長(zhǎng)液，用10mL的無(wú)菌移液管吸取6mL Hanks液分別清洗細(xì)胞3遍。7（2）細(xì)胞培養(yǎng)瓶的接種用無(wú)菌的移液管將清洗細(xì)胞的Hanks液從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中移出。用無(wú)菌的移液管吸取適量臨床標(biāo)本置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，溫和搖動(dòng)數(shù)次。然后放于37，5%CO2培養(yǎng)

4、箱中吸附12h。吸出接種物，用10mL的無(wú)菌移液管吸取6mL Hanks液分別清洗細(xì)胞2遍。然后加入6mL病毒生長(zhǎng)液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。放置于3335培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞病變情況。（細(xì)胞病變的特征是細(xì)胞腫脹圓化，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞核固縮或破裂，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞部分或全部脫落）。8（3）細(xì)胞培養(yǎng)物的收獲當(dāng)75%100%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)進(jìn)行收獲，收獲之前可以將細(xì)胞放于-70冰箱，凍融12次，以提高收獲標(biāo)本的病毒滴度。即使無(wú)細(xì)胞病變也應(yīng)該于接種后第7天收獲。收獲病毒液時(shí)，先溫和搖動(dòng)細(xì)胞瓶數(shù)次，然后用10mL的無(wú)菌移液管吸取病毒液置于15mL無(wú)菌離心管中，混勻病毒。收獲的病毒液可以立即進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，或凍于-8

5、0冰箱待以后試驗(yàn)使用。9二、流感病毒分離之雞胚培養(yǎng)法 （一）、檢視標(biāo)記雞胚（1）用照蛋燈檢視雞胚，判斷雞胚狀態(tài) 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血帶或淤血塊 胎動(dòng)：活胚有明顯的自然運(yùn)動(dòng)，死胚無(wú)胎動(dòng) 絨毛尿囊膜發(fā)育界限：密布血管的絨毛尿囊膜與雞胚 胎的另一面形成明顯的界限（2）標(biāo)記出雞胚的氣室與尿囊的界限（3）如果雞胚是死胚、沒(méi)有受精、有裂痕、發(fā)育不全、或表面有好多滲水孔，應(yīng)棄掉10（二）、接種樣本將標(biāo)記好的雞胚的氣室朝上放置在照蛋器上。（2）用75酒精消毒雞胚，用無(wú)菌鑷子在氣室端鉆孔，再無(wú)菌眼科剪剪開(kāi)10 x6mm窗口。 (3)用注射器吸800l標(biāo)本。(4)從窗口中滴入無(wú)菌的液體石蠟，輕輕晃

6、動(dòng)雞胚，讓液體石蠟在雞胚殼膜內(nèi)層鋪開(kāi)，此時(shí)在照蛋燈下即可清楚的看到雞胚胎的位置。將注射針頭刺入胚胎的鄂下胸前，用針頭輕輕撥動(dòng)下顎及腿，當(dāng)進(jìn)入羊膜腔時(shí)，能看到雞胚隨著針頭的撥動(dòng)而動(dòng)，即可注射200l標(biāo)本。將針頭退出至寸，將另外200l標(biāo)本注入雞胚尿囊腔。每個(gè)樣本接種2個(gè)雞胚。11(5)將針頭棄于合適的生物安全裝置中(6)用消毒過(guò)的醫(yī)用膠布封口(7)3335oC 溫箱培養(yǎng)雞胚23 天。臨床采樣標(biāo)本通常培養(yǎng)3天，病毒傳代通常培養(yǎng)2天。注意：雞胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)時(shí)，每天檢查雞胚生長(zhǎng)情況，24小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，認(rèn)為是非特異死亡應(yīng)棄去12+”：大部分紅細(xì)胞凝集，在管底鋪成薄膜狀，但尚有少數(shù)紅細(xì)胞不凝，在管底中心形成小紅點(diǎn)。 “+”：約有半數(shù)紅細(xì)胞凝集，在管底鋪成薄膜，面積較小，