臨床基因擴增檢驗實驗室的設置、質量管理資料

1、臨床基因(jyn)擴增檢驗實驗室的設置、質量管理體系的建立及其技術驗收云南省臨床檢驗(jinyn)中心杜廷義2007，12，20共七十頁題外話：不參加(cnji)實習課？參加實習課？共七十頁對相關(xinggun)管理文件的理解：臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準(biozhn)（第六條）臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范（第十條、第十三條、第十四條）臨床實驗室必須遵循的管理辦法及其它行業(yè)標準共七十頁強調(qing dio)：污染(wrn)的控制：預防為主質量保證共七十頁污染(wrn)的途徑：實驗材料(cilio)試劑每一成分設備的每一部位每一操作步驟共七十頁污染

2、(wrn)的判斷：經(jīng)驗： 全陽性，CT值35；標準品的CT值發(fā)生波動 陰性質控陽性 陽性率異常增高(znggo)輕微污染和非特異性擴增？共七十頁污染(wrn)和非特異性擴增:目的基因過程(guchng)控制反應體系（引物、模版、酶、鎂離子、退火、循環(huán)）條件優(yōu)化共七十頁控制(kngzh)的手段：工作區(qū)的嚴格劃分SOP的制訂和嚴格執(zhí)行去污染措施(cush)的常規(guī)采用共七十頁污染(wrn)的監(jiān)測：陰性質控的設置： 陰性血清樣本 以水為模擬(mn)標本 僅含擴增反應液 （加鑒別實驗室是否污染的空白管)共七十頁質控品的位置(wi zhi)標準品空白陽性質控陰性質控臨床(ln chun)樣本標準品空白陽性

3、質控臨床樣本陰性質控共七十頁實驗室的設置(shzh)管理(gunl)要求：設置標準和工作規(guī)范具體落實：實事求是、因地制宜共七十頁設置標準和工作(gngzu)規(guī)范 “原則上分為四個分隔的工作(gngzu)區(qū)； 各區(qū)必須有明確的標記” “每一區(qū)域都須有專用的儀器；不同的工作區(qū)應使用不同顏色或有明顯區(qū)別標志的工作服；離開工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出” “，可在開展臨床標本檢測前對提取方法進行評價” “，本區(qū)如采用副壓條件或減壓情況下可減少擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至前區(qū)的可能性。共七十頁理想(lxing)的設置緩沖間緩沖間擴增區(qū)試劑準備區(qū)樣本制備區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間專用走廊工作

4、流向磁性(cxng)連鎖裝置共七十頁現(xiàn)實(xinsh)的問題是：建筑結構通道、門水電供應采光(cigung)、通風共七十頁基本(jbn)的要求:四個區(qū)域必須是相互獨立的各區(qū)的儀器設備及各種物品必須是專用的各區(qū)間不能直通，應有緩沖間，供換工作服及鞋子用產(chǎn)物分析(fnx)區(qū)應安裝排風扇或其它抽風裝置。共七十頁擴增區(qū)試劑準備區(qū)樣本制備區(qū)產(chǎn)物檢測區(qū)其它實驗室走 廊實例(shl)：共七十頁其它實驗室樣本制備區(qū)擴增區(qū)試劑準備區(qū)產(chǎn)品檢測區(qū)走廊實例(shl)：共七十頁實例(shl)：產(chǎn)物檢測區(qū)擴增區(qū)樣本制備區(qū)其它實驗室共七十頁休息區(qū)試劑準備區(qū)擴增區(qū)產(chǎn)物檢測區(qū)走廊模板加樣區(qū)實例(shl)：樣本(yngbn)處理

5、區(qū)共七十頁實例(shl)：共七十頁小結(xioji)：處理原則的核心是通過合理的設置解決好臨床PCR檢測實際運作動態(tài)過程中可能發(fā)生的污染的預防問題因此，實驗室的設計(shj)必須充分考慮到對污染來源和污染途徑的預防和控制共七十頁實驗室各區(qū)的功能(gngnng)和配置：共七十頁試劑儲存(chcn)和準備區(qū)儲存試劑的制備試劑的分裝(fn zhun)主反應混合液的制備冰箱混勻器微量加樣器可移動紫外燈專用工作服和工作鞋消耗品（帶濾心吸頭、離心管、一次性手套等）專用辦公用品等。共七十頁標本(biobn)制備區(qū)：臨床標本的保存(bocn) 核酸提取、儲存及其加入至擴增反應管測定RNA時cDNA的合成不得在

6、本區(qū)對樣本進行PCR擴增冰箱 (28和-20或-80)高速臺式冷凍離心機水浴箱和/或加熱模塊生物安全柜混勻器微量加樣器可移動紫外燈專用工作服和工作鞋專用消耗品專用辦公用品等共七十頁擴增區(qū)：DNA 或cDNA擴增已制備的DNA模板和合成的cDNA的加入主反應混合液制備成反應混合液如果空間允許的話，模板的加入也可以(ky)在一個獨立的空間內(nèi)完成核酸擴增儀微量加樣器(視情況定)可移動(ydng)紫外燈專用工作服和工作鞋專用消耗品專用辦公用品等共七十頁產(chǎn)物(chnw)分析區(qū)：擴增片段的測定最主要的擴增產(chǎn)物污染來源有可能(knng)使用致突變和有毒物質微量加樣器可移動紫外燈專用工作服和工作鞋專用消耗品專

7、用辦公用品等共七十頁輔助(fzh)用房：清潔區(qū)標本接受區(qū)：靈活設置 不干擾(gnro)四區(qū) 規(guī)范的保存和傳遞共七十頁實驗室使用(shyng)和管理：標本(biobn)接受區(qū)樣本制備區(qū)擴增區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)試劑準備區(qū)共七十頁區(qū)域(qy)的適當合并： “由于測定技術總是在發(fā)展之中，區(qū)域的合并(hbng)應根據(jù)儀器的特點而定”共七十頁小結(xioji)：從核心儀器特點、實驗室的現(xiàn)狀出發(fā)，綜合考慮管理要求盡可能在現(xiàn)有條件下滿足(mnz)管理要求以管理措施彌補硬件的不足有條件，留有余地再好的分區(qū)設置，如果不輔之與認真執(zhí)行的相應的管理制度，等同于無。共七十頁實驗室質量體系的建立(jinl)：管理(gunl)要求

8、體系建立共七十頁管理(gunl)要求：1 實驗室設置和設備1.1 實驗室原則上應分為(fn wi)四個區(qū)，但如使 用全自動擴增檢測儀，區(qū)域可適當合 并。1.2 各工作區(qū)的明確標記1.3 實驗室設置應能有效地防止PCR后區(qū)產(chǎn) 物的污染。 共七十頁管理(gunl)要求：2 設施和環(huán)境2.1 實驗室的設施、工作區(qū)域、能源、照明、 溫控、通風等。應便于檢測工作的正常(zhngchng)進行。2.2 實驗室應配備溫度濕度計、穩(wěn)壓電源等。2.3 進入和使用實驗室各區(qū)域應有明確的限制和 控制。2.4 應有實驗室清潔、消毒制度及相應用具；2.5 實驗室應有有關生物污染物處理、生物防護 等措施及相應用具；共七十

9、頁管理(gunl)要求：3 人員3.1 實驗室應配備足夠數(shù)量的人員； 這些人 員必須經(jīng)過培訓，并取得上崗證；3.2 實驗室應有培訓計劃(jhu)和措施，保證其技術 人員得到及時培訓。3.3 實驗室應保存其技術人員有關資格證書 （如上崗證）、培訓、技能和經(jīng)歷等技術檔案。共七十頁管理(gunl)要求：4 設備管理4.1 主要設備應有維護程序文件及維護記錄；4.2 (a)有問題的設備應立即停止使用，并加上明顯標識，如可 能應將其貯存在規(guī)定的地方直至修復；(b)修復的設備必須 經(jīng)校準、檢定（驗證）或檢測滿足要求后方能再次投入使 用；(c)實驗室應檢查由于上述缺陷對以前所進行的檢測工 作的影響。4.3

10、加樣器、溫度計、擴增儀和酶標儀等應有校準程序并進行 校準，擴增儀和酶標儀應有明顯的標識表明其校準狀態(tài)。4.4 應保存(bocn)擴增儀、酶標儀、生物安全柜、加樣器等設備的檔 案共七十頁管理(gunl)要求：5 檢測方法5.1 實驗室應制定：有關儀器設備操作程 序；有關擴增檢測的工作程序。5.2 所有上述標準操作程序都應現(xiàn)行有效并便 于工作人員使用。5.3 實驗室應有儀器、試劑、消耗品的選購、 驗收(ynshu)、貯存和質檢程序； 必須使用經(jīng)國 家有關部門批準的試劑和儀器。共七十頁管理(gunl)要求：6 標本管理6.1 實驗室應建立對擬檢測標本的唯一編號識別系統(tǒng)。6.2 實驗室應制定有關標本收

11、集、處理、運送、貯存 程序。6.3 在接收標本時應有其狀態(tài)的詳細記錄。6.4 實驗室應確定標本是否符合檢測要求, 拒收標本 原因(yunyn)要明確。6.5 如果標本必須在特定的環(huán)境條件下（如2-8、 -20和-70低溫）貯存，則應對這些條件加以 維持、監(jiān)控和記錄；共七十頁管理(gunl)要求：7 記錄7.1 實驗室應有適合自身實際情況又符合現(xiàn) 行規(guī)章制度的記錄管理制度；7.2 記錄應有參與標本收集(shuj)、標本準備和處 理、檢測的人員簽字。7.3 所有記錄和報告都應安全貯存、妥善保 管并保密。共七十頁管理(gunl)要求：8 報告8.1 檢測結果的報告應準確、清晰和客觀。定性測定報告“陰

12、 性”或“陽性”；定量測定則以拷貝數(shù)/ml或IU/ml報告。8.2 每份報告應包括以下信息：（a）標題，例如“檢測報告” （b）報告的唯一性標識（如序號）；（c）檢測標本的特性 和狀態(tài)；（d）檢測標本的接收時間和進行檢測的時間； （f）采用的檢測方法；（g）實驗操作及校核人員的簽字， 以及簽發(fā)日期；（h）檢測報告中應給出參考結果或范圍；8.3 當報告的有效性發(fā)生疑問時，實驗室應立即通知臨床(ln chun)相關 科室予以改正。8.4 當臨床科室或患者要求用電話、圖文傳真或其它電子和電 磁設備傳送結果時，實驗室應保證工作人員遵循文件化的 程序，并為對方保密。共七十頁管理(gunl)要求：9 質量

13、控制9.1 實驗室應有室內(nèi)質量控制標準操作程序 文件：（a）質控物的合理性； （b）質控方法（圖）的有效性； （c）失控的判斷； （d）失控的措施。9.2 實驗室應參加(cnji)室間質量評價共七十頁管理(gunl)要求：10 抱怨10.1 實驗室應制定抱怨及其處理的標準操作程序；應 將抱怨資料及處理抱怨所采取的措施及結果記錄 歸檔保存。10.2 當抱怨或其它任何事項是對實驗室是否符合其現(xiàn) 行程序、或者是否符合臨床基因擴增實驗室管 理暫行辦法和臨床基因擴增實驗室工作規(guī) 范、或是對其它有關實驗室校準或檢測質量(zhling)提 出疑問時，則實驗室應立即對這些范圍的工作和 有關職責進行審核。共七十

14、頁管理(gunl)要求（現(xiàn)場考核）：送審的文件描述(mio sh)與實驗室實際情況的一致性實際運行與文件規(guī)定的一致性人員素質：對文件的認知、熟悉、靈活運用程度共七十頁現(xiàn)場考核(koh)的實際內(nèi)涵：認識到不到位落實到不到位符合(fh)性檢查加指導性檢查有重點的全面檢查共七十頁建立質量管理體系首先要解決(jiju)的問題：第一個問題：質量體系建立的核心(hxn)問題是什么？第二個問題：質量體系模式要達到的管理目的是什么？第三個問題：達到目的的方法（途徑、手段）是什么？共七十頁質量體系的定義(dngy) 為實施質量管理所需的組織結構、程序、過程和資源。要點：定義涵蓋了實驗室管理(gunl)的每一個

15、方面。 共七十頁組織結構(jigu)：一個組織為行使其職能，按某種方式建立的職責、權限及其相互關系。程序：為進行某項活動所規(guī)定的途徑。過程：將輸入轉化為輸出的一組彼此相關的資源和活動。共七十頁四個組成部分(z chn b fn)的關系：關鍵：核心過程（活動） 紐帶程序(chngx) 組織結構 程序 資源 過程共七十頁理解(lji)“過程”的重要性 1、工作是通過過程來完成的。 2、質量管理是通過對各種過程的控制 來實現(xiàn)的。 3、質量管理本身(bnshn)也是一系列的過程過程的分解、控制過程的有機組合過程共七十頁前處理檢測樣本采集和接受編制報告審核報告發(fā)放記錄保存登記編號質控咨詢共七十頁質量體系

16、運行(ynxng)的目的方針目標質量環(huán)及要素QS結構QS文件QS運行QS審核QS評審質量改進報告 證書共七十頁主要手段(shudun)：質量體系文件質量方針：質量手冊：闡明實驗室的質量方針，各方面質量管理的一般性描述程序性文件：對通用于整個實驗室的某些(mu xi)方面工作的文件化描述標準操作程序（SOP文件）：是實驗室最為具體、最具有可操作性、也是使用頻率最高的文件共七十頁PCR實驗室技術驗收(ynshu)對文件的要求：儀器設備的維護保養(yǎng)程序；儀器設備的校準程序；儀器設備的操作程序；臨床標本的收集程序；臨床標本的處理（核酸純化）程序；臨床標本的保存程序；核酸擴增及產(chǎn)物分析檢測(jin c)的

17、操作程序；試劑的質檢操作程序；實驗室消耗品購買、驗收和貯存程序；實驗室廢棄物的處理程序；實驗室的清潔程序；室內(nèi)質量控制程序；抱怨處理程序。共七十頁申請表的附錄5“需準備(zhnbi)的標準操作程序（最低要求）”對實驗室的質量手冊和程序文件沒作要求對必須具備的SOP文件的編撰格式?jīng)]作具體要求共七十頁SOP：實驗室最具個性(gxng)的文件不夠嚴謹(ynjn)準確不夠連貫不夠嚴密共七十頁例：用加樣槍取100l樣品加入提取液用加樣器（移液器）以前進(qinjn)式移液法吸取100l樣品加入提取液共七十頁例： 向一新的經(jīng)高壓(goy)滅菌處理過的0.5ml離心管中加入10l充分混勻的RNA提取液A（R

18、NA提取液A易沉淀，取樣前需用移液器反復吸打混勻后吸?。＜尤?0l血清標本或陰陽性標準品，再加人200l的RNA提取液B充分混勻。室溫放置5分鐘。6000rpm離心1分鐘，小心吸去上清，用75的預冷乙醇（DEPC水配制）洗沉淀兩次。（取75乙醇450l洗沉淀，充分震蕩混勻，6000rpm，離心1分鐘，然后去上清，再用75的乙醇450l洗一次），65干燥沉淀10分鐘。（注： 75%乙醇配制時須用試劑盒中提供的DEPC H2O）。共七十頁 機械(jxi)地抄書、說明書、其它實驗室的文件。共七十頁撰寫(zhun xi)SOP文件要做到：具有專業(yè)知識的人，按文件就能順利完成實驗忠實而且連貫地反映實驗

19、過程對文件表述的理解無歧義嚴謹(ynjn)、嚴密準確和簡練共七十頁文件的文字(wnz)組織：簡練明確向一新的經(jīng)高壓滅菌(mi jn)處理過的0.5ml離心管中加入10l充分混勻的RNA提取液A（RNA提取液A易沉淀，取樣前需用移液器反復吸打混勻后吸?。＜尤?0l血清標本或陰陽性標準品，再加人200l的RNA提取液B充分混勻。室溫放置5分鐘。6000rpm離心1分鐘，小心吸去上清，用75的預冷乙醇（DEPC水配制）洗沉淀兩次。（取75乙醇450l洗沉淀，充分震蕩混勻，6000rpm，離心1分鐘，然后去上清，再用75的乙醇450l洗一次），65干燥沉淀10分鐘。（注： 75%乙醇配制時須用試劑盒

20、中提供的DEPC H2O）。共七十頁質量體系文件(wnjin)的構成： 質量 手冊 程序性 文 件質量文件 質量文件（作業(yè)指 導書、表格、報告等）共七十頁程序文件(wnjin)和SOP的關系對通用(tngyng)于整個實驗室的某些方面工作的文件化描述具體操作的標準化文件程序文件等同于以往的管理制度SOP等同于以往的操作卡或操作說明書共七十頁WhatWhoWhereWhenWhyHow寫合乎管理(gunl)要求的 ，寫你做得到的共七十頁難點(ndin)：寫你所做的做你所寫的記錄(jl)你所做的關鍵：SOP和記錄的必要性和重要性共七十頁儀器設備的校準(jio zhn)程序目的：保證檢驗的有效性，準

21、確性。范圍：本程序適用于滿足PCR實驗室檢測需要并可能對檢驗結果造成誤差的儀器設備。主要有：職責：校準由PCR實驗室主任負責組織執(zhí)行。工作流程：4.1 校準方法： Finpipette可調式移液器校準采用廠家推薦方法。校準主要使用設備為BS110S電子天平（Max 110g, d=0.1mg）。4.2 校準計劃(jhu)：4.2.1 啟用校準：設備在投入使用時實施啟用校準。4.2.2 周期校準：設備在投入使用后，每半年實施一次校準。4.2.3 維修后校準：設備在維修后須經(jīng)校準方可重新投入使用。4.2.4 校準計劃外的校準：如在檢測及EQA，IQC活動中發(fā)現(xiàn)存在結果漂移或偏差及其它可疑情況時，通

22、 過分析對可疑設備實施校準。4.2.5 Finpipette可調式移液器的校準順序：按照單一流向規(guī)定，對Finpipette可調式移液器的校準首先 校準試劑準備區(qū)，然后依次為樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)。每校準完一個區(qū)的移 液器，將其放回原處后，再取下一個區(qū)的移液器進行校準。4.2.6 校準安排在不進行樣本檢測的日期完成。4.3 校準的有效標識：經(jīng)校準的設備加貼綠色標簽，標簽上應標明本次校準的日期和結果及下次校準的計劃 預定日期。4.4 校準結果的審批及記錄保存：每次校準的結果須及時送交科質量負責人審閱簽字予以核準。校準記錄須 妥善保存直至設備報廢。校準涉及的文件： 5.1 校準方法文件：Cal-SOP-1 Cal-SOP-25.2 校準記錄文件：Cal-Rec-1-112共七十頁Finnpipette可調式移液器的校準(jio zhn)方法 1 校準原理：采用移液槍吸蒸餾水稱重的方法校準；2 校準接受標準：比較測量結果與允許值，若測量結果在允許值范圍之外，即使五次 中只出現(xiàn)一次，該支移液器也必須重新校準；3 校準環(huán)境和用具要求：3.1 室溫：2025，測定中波動范圍不大于0.5；3.2 電子天平：在校準前注意檢查電子天平的水平狀態(tài)及校準記錄；為保