Westernblot轉(zhuǎn)膜及膜的選擇

1、Westernblot轉(zhuǎn)膜及膜的選擇轉(zhuǎn)膜：經(jīng)過PAGE電泳分離后的蛋白質(zhì)樣品需要經(jīng)過“轉(zhuǎn)膜”步驟一一從PAGE膠轉(zhuǎn)移到膜上固定，才能用各種方法進(jìn)行WesternBlot的檢測和顯色，而且為了防止沒有電場的情況下已經(jīng)分離的蛋白條帶擴(kuò)散，轉(zhuǎn)移要盡快進(jìn)行轉(zhuǎn)膜的首要是選膜。在轉(zhuǎn)移膜上顯色其實就像是畫家在畫布上作畫一樣，不光要有好的畫筆和顏料，適合的畫布也是相當(dāng)之重要WesternBlotting亦是如此，沒有選擇好合適的轉(zhuǎn)移膜是無法做出漂亮的結(jié)果的。因此，選擇適合的轉(zhuǎn)移膜，要讓轉(zhuǎn)移“膜”高一尺，幫襯而不是阻礙到我們的實驗。WesternBlot印跡常用的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素膜（Nitrocellul

2、oseBlottingMembranes,NC）和PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride），此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白印跡。具體哪種膜適合于哪些實驗?zāi)兀窟x擇的根據(jù)主要有：a.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大小）；b.不影響后續(xù)的顯色檢測（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）；c.如果后繼實驗有其他要求，比如要做蛋白測序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來挑選不同的轉(zhuǎn)移膜，就像國畫要選擇宣紙，油畫要挑亞麻布或薄棉扣布一樣。轉(zhuǎn)膜是對westernblot最終結(jié)果影響最大的一步，轉(zhuǎn)膜質(zhì)量的好壞直接決定

3、了實驗結(jié)果的好壞。轉(zhuǎn)膜的影響因素不多，主要有膜的選擇、轉(zhuǎn)印方法和實驗操作三個方面。首先是膜的選擇問題。膜的選擇主要從實驗?zāi)康暮蛯嶒炓髞砜紤]。例如，要做分子量小于20kDa的小蛋白，0.45um的NC膜是不可取的，因為這樣可能會使得蛋白因透過膜孔而造成膜結(jié)合的目的蛋白量不確定，從而影響到最終結(jié)果的可靠性。而如果所分離的蛋白需要進(jìn)行測序，則非PVDF膜不可，因為只有PVDF膜才能經(jīng)受住嚴(yán)酷的清洗條件。常用的westernblot用膜有NC膜、PVDF膜和尼龍膜，它們的一些主要的特點總結(jié)如下表：NC膜尼龍膜PVDF膜靈敏度和分辨高高高率背景低較高低125200ug/cm2（適合于SDS結(jié)合能力80

4、110ug/cm24OOug/cm2存在下與蛋白質(zhì)的結(jié)合）材料質(zhì)地干的NC膜易脆軟而結(jié)實機(jī)械強(qiáng)度高溶劑耐受性無無有操作程序緩沖液潤濕,避免氣泡緩沖液潤濕使用前100%甲醇潤濕檢測方式常規(guī)染色，可用放射性和非放射性檢測不能用陰離子染料常規(guī)染色，比較于NC膜，可用考馬斯亮藍(lán)染色，可用于ECL檢測，快速免疫檢測。0.45um一般蛋白低濃度小分子0.2um一分子量小于20kD蛋白、酸性蛋適用范圍蛋白白、糖蛋白和蛋糖蛋白檢測和蛋白質(zhì)測序O.lum分子量小于7kD蛋白多糖（主要用白在核酸檢測中）價格價格較便宜便宜較貴其次是轉(zhuǎn)膜方法的選擇。主要有半干法轉(zhuǎn)膜和濕法轉(zhuǎn)膜。半干法操作要求高，但效率也高。濕法操作要

5、求相對低，花時間多一些。最后是實驗操作方面的問題。使用PVDF膜的時候需要進(jìn)行預(yù)處理，這里面會帶來一些問題，如甲醇潤濕不夠，膜的有些區(qū)域不能很好的結(jié)合蛋白就會引入誤差膜上面一定不要有油脂類的東西，否則也會影響蛋白結(jié)合和抗體的雜交。硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜是蛋白印跡最廣泛使用的轉(zhuǎn)移介質(zhì)，對蛋白有很強(qiáng)的結(jié)合能力，而且適用于各種顯色方法，包括同位素，化學(xué)發(fā)光（Luminol類）、常規(guī)顯色、染色和熒光顯色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很簡便，比如不需要甲醛預(yù)處理，只要在無離子水面浸潤排出膜內(nèi)氣泡，再在電泳緩沖液中平衡幾分鐘就可以了；比如NC膜很容易封閉，也不需要特別嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那逑礂l件。轉(zhuǎn)移到NC膜上的

6、蛋白在合適的條件下可以穩(wěn)定保存很長時間，Schleicher&Schull公司的一個實驗表明，轉(zhuǎn)移到NC膜上的幾種蛋白4度條件下保存5年依然保持免疫識別特性，依然可以得到清晰可信的WesternBlot結(jié)果。不過要注意的是純的硝纖膜在比較脆，又容易卷，操作要小心，不適合用于需要多次重復(fù)清洗的用途因為經(jīng)不起多次“折磨”。選擇硝纖膜時要注意的是選擇合適的孔徑，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔徑的膜，小于20KD的話建議選擇0.2um的,如果小于7KD的話最好選擇O.lum的膜。另外還要注意選擇純的NC膜混有含醋酸纖維（CM）的。膜結(jié)合力會有所降低。另外提醒一句：由于NC膜上結(jié)合的蛋白會

7、因為一些去污劑而被代替，因此在封閉時最好使用較溫和的Tween20,而且濃度不要超過0.3%（據(jù)說0.05%效果最好）。硝纖膜最為大家熟悉和認(rèn)可的品牌就是Schleicher&Schull；Millipore；PALL，另外羅氏、Invitrogen、GE（Amersham）、SantaCruz等公司都有提供各式的硝纖膜（估計OEM的可能性比較大，不過有時挺奇怪的，OEM的有時比生產(chǎn)廠家賣的還便宜）。Schleicher&Schull的名字拗口那大概需要舌頭在口腔里經(jīng)過若干次不同弧度和不同速度的上下往返精確運動再配合適當(dāng)?shù)耐職獠拍茏x得準(zhǔn)確優(yōu)雅，不過作為第一個提供硝纖膜的廠家依然廣為人知，其NC

8、膜分為純NC膜和強(qiáng)化NC膜兩種:Protrannitrocellulosemembrane和Optitrannitrocellulosemembrane。前者Protran直是Schleicher&Schull自豪的產(chǎn)品，這種“100%PureNitrocelluloseMembranes。一般而言，NC膜越純，其蛋白結(jié)合能力就越高，所以要增加WB的靈敏度和分辨率，提高所使用膜的純度是個可以考慮的選擇。如果NC膜攙雜一些醋化纖維素一一這在前面已經(jīng)提到，會影響蛋白質(zhì)結(jié)合。而Protran在制作過程中去除了各種雜質(zhì)，保證了其純度,從而增加了蛋白結(jié)合能力。除了這一點以外，Protran還有低背景、多

9、孔徑選擇（0.45,0.2,0.1um）和保存時間長（實驗證明膜上蛋白辨認(rèn)時間可長達(dá)5年！真是“路遙知馬力”的典范）等優(yōu)點。但是Protran由于是純NC膜，比較脆，機(jī)械耐受力欠佳，需要小心操作，如果擔(dān)心自己“粗手粗腳”，那么就可以考慮一下Optitran或者Pall公司的以耐受力著稱的BioTraceNTNitrocelluloseTransferMembrane。Optitran是在一層超薄聚酯支撐膜的兩面均勻鋪上100%純的硝酸纖維素，結(jié)果表面看起來和純硝纖膜完全一樣，保持了NC膜各種優(yōu)點，只是內(nèi)部多了一層中性支持物，大大增強(qiáng)這種強(qiáng)化NC膜的柔韌度和機(jī)械耐受力，不容易卷曲，方便操作，特別

10、是重復(fù)標(biāo)記和洗脫的實驗。不過有的使用過的人反應(yīng)不如純NC膜結(jié)合能力強(qiáng)。NC膜除了一般的Discs、Rolls和Sheets以外，像Invitrogen、Bio-Rad公司還有一種方便顧客使用的“sandwich”三明治形，十分有趣。說它有趣是因為考慮周到，利于高通量操作，但其實也就是將濾紙和NC膜紙?zhí)壮蔀V紙一NC膜一濾紙的層迭形式，預(yù)先切割裝訂好，方便使用。不過，卷膜肯定是最實惠的選擇，只不過要自己動手裁剪一一切記，必須帶手套操作。不知道為什么在國外硝纖膜會被當(dāng)作危險品來運輸還要加收運費，所以貨期蠻長的，所以還是卷膜好，一卷用n年一一如果非要給這個n加個期限，那就是至少可以用到等我畢業(yè)之后。P

11、VDF膜剛開始做WB的人也許會有這種疑問：為什么實驗室的老師（或者師兄師姐們）在教我們做WB的時候，如果是用PVDF膜做，總是小心翼翼的剪，節(jié)省著用，甚至一些邊邊角角也舍不得丟掉呢？其實，這不僅是因為PVDF膜比較貴，還由于PVDF膜是做WB的“殺手锏”。聚偏二氟乙烯（PVDF）膜作為基質(zhì)的轉(zhuǎn)印膜由Millipore公司在1985年首先推出。與硝酸纖維素膜相比，PVDF膜在蛋白質(zhì)截留能力，機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)相容性上都更優(yōu)越的性能（Pluskal,etal.,1986）。市售硝酸纖維素膜的典型結(jié)合量是80-100ng/cm2,而PVDF膜結(jié)合量是100-200ng/cm2（而結(jié)合強(qiáng)度PVDF比硝纖膜

12、強(qiáng)6倍?。?。在艾滋病毒（HIV）血清學(xué)檢驗中直接比較PVDF和硝酸纖維素膜，PVDF膜具有更好的截留總HIV抗原能力并提高抗體檢測糖基化被膜抗原的性能。但是PVDF膜最大的優(yōu)點不僅于此：更好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)耐受性使PVDF膜在各種染色應(yīng)用和多重免疫檢測中成為理想選擇；而且單個凝膠的泳道復(fù)本可用于多種目的，如考馬斯亮藍(lán)染色后切出條帶并進(jìn)行N-末端測序、蛋白消化/肽分離/內(nèi)部測序和免疫檢測（Kurien,etal.,2003）。特別是需要做N端蛋白測序，在相當(dāng)“嚴(yán)酷”的清洗條件下，當(dāng)尼龍或者硝纖膜已經(jīng)降解的情況下PVDF膜依然保持本色，笑傲江湖。所以PVDF也是要做蛋白測序的唯一選擇。此外，個人經(jīng)

13、驗，一些強(qiáng)疏水蛋白用PVDF膜效果會更好一些PVDF膜適用的檢測方法也不少，化學(xué)發(fā)光、常規(guī)顯色、同位素和標(biāo)準(zhǔn)染色都一樣OK，但不適合熒光。PVDF膜特別注意的是需要100%甲醇預(yù)處理（不超過15秒）再用緩沖液平衡，才能用，而且適用過程中萬一干了也要同樣程序再處理（不過要真出現(xiàn)這種問題也是自己欠扁，誰要你不小心呢，轉(zhuǎn)膜前處理也就罷了，轉(zhuǎn)膜后再這樣處理可能會影響后繼的抗體識別呢）。PVDF膜同樣分0.45um和0.2um的，后者孔徑小,對小分子蛋白有較好的攔截吸附，背景可能會比前者稍高。PVDF膜常見的有以下幾個品牌公司7口XZ產(chǎn)品名孔徑適用范圍參考價格MilliporeImmobilonTran

14、sfer0.45um$212Membranes0.2umBio-RadImmun-BlotPVDFChemiluminescent,Membranecolorimetricwesternblots,amino-terminalsequenceandtotalaminoacidcompositionPiercePVDFMembrane0.45umWesternSouthern,0.2umNorthern,anddotblotsPallLifeBioTracePVDFTransfer0.45umNucleicacidand$149ScienceMembraneproteintransfers.Pr

15、oteinsequencingInvitrogenPVDFMembrane0.45umProteinsequencing,1625.80.2umimmunoblottingWhatmanWestranClearSignal0.45umWesternblotsPVDFMembrane作為PVDF膜的鼻祖，Millipore公司的PVDF膜Immobilon系列分為Immobilon-P(0.45um),-PSQ(0.2um),-FL(用于熒光顯色)和BlottingSandwichesforHighTroughput四種。Immobilon-P膜孔徑均一，具有極強(qiáng)的吸附能力，染色性能好、抗溶劑能

16、力強(qiáng)和信噪比高，有助于提高檢測靈敏度，而且開放的孔結(jié)構(gòu)容易接近被吸附的蛋白質(zhì)，并有助于去除背景上沒有吸附的探針，可以說是免疫印跡檢測理想的印跡膜。Immobilon-PSQ轉(zhuǎn)印膜是印跡小分子蛋白質(zhì)(20KDa)的理想選擇優(yōu)良的蛋白質(zhì)吸附性能，滲漏少。內(nèi)表面面積較大，可供蛋白質(zhì)吸附從而提高蛋白質(zhì)測序的得率。由于不含污染性支撐物或表面活性劑，Immobilon-PSQ層析譜上的背景峰值極小。Immobilon-FL也是Millipore值得驕傲的產(chǎn)品，因為這是第一個專門為熒光顯色優(yōu)化的轉(zhuǎn)移膜。通過實驗證明，這種膜在Kodak成像系統(tǒng)可以顯示僅7ng的蛋白，聽起來不錯吧,有興趣可以試一試。這幾種膜除

17、了一般的PVDF膜的優(yōu)點之外，最大特點就是一個字快。按照Millipore的操作手冊，Immobilon可以在保證質(zhì)量的前提下縮短WB時間到2個小時主要是縮短封閉和洗脫時間。這可真是個好消息，因為坐在那兒等WB結(jié)果多浪費時間啊！縮短這個費時而枯燥的過程，早出結(jié)果,可以提高實驗效率，利于我們分析實驗結(jié)果，考慮下步對策嘛。卷膜經(jīng)濟(jì)實惠，裁剪剩下的邊角料還可以用來做點雜交，而預(yù)裁剪的即用膜更適合高通量等等“用金錢換時間”的實驗。再次強(qiáng)調(diào)的是，疏水PVDF膜在用前必須經(jīng)過50%或以上體積比的甲醇或者乙醇溶液處理幾分鐘，待膜變成半透明后用MilliQ水或者純水漂洗一下，轉(zhuǎn)入電泳緩沖液平衡才能用。Invi

18、trogen公司的PVDF膜也有大家風(fēng)范：膜是與兩張預(yù)裁的濾紙同時提供，方便使用；雖然一般而言0.2um的膜滲漏少適用性會更強(qiáng)，但I(xiàn)nvitrogen的0.45umPVDF膜自有自家優(yōu)勢特別適合于低背景，高敏感度的印跡反應(yīng)，同樣需要在乙醇或者甲醇，或者異丙醇中浸泡5分鐘就可以用了。尼龍膜尼龍膜更多是用于核酸的轉(zhuǎn)移，也有見于蛋白印跡，比如dotblot,比較于NC膜來說，它的優(yōu)點是結(jié)合力強(qiáng)，特結(jié)實又柔軟且不易卷曲，機(jī)械強(qiáng)度大，便于操作，缺點是背景高由于尼龍膜電荷密度高，使得非結(jié)合區(qū)的封閉比疏水性NC膜困難，對于靈敏度高的檢測方法，背景問題尤為突出（據(jù)分子克隆III說通過熱處理的酪蛋白和1%聚乙烯吡咯烷酮延長封閉時間可以改善），而且當(dāng)轉(zhuǎn)移緩沖液中存在有SDS時蛋白質(zhì)就容易從尼龍膜上泄漏（通過甲醛固定可以緩解這一情況）。另外至今也沒有適合尼龍膜上的直接染色方法。因此在許多情況下實驗室人員進(jìn)行WB實驗不選擇尼龍膜。盡管如此，一些產(chǎn)品卻能“取其精華，去其糟粕”，將尼龍膜一些不利于蛋白印跡的因素縮小或者去除，使其成為有效的蛋白轉(zhuǎn)移介質(zhì)。比如說，化學(xué)發(fā)光底物做得相當(dāng)出色的