藥物分析學(xué)：第十一章中藥分析概論

1、第十一章 中藥分析概論 Analysis of traditional Chinese medicines藥物分析學(xué) 總論目 錄中藥分析的特點(diǎn)12鑒別實(shí)驗(yàn)3檢查4含量測定5中藥安全性相關(guān)的質(zhì)量控制項(xiàng)目6中藥指紋圖譜和特征圖譜7中藥分析的樣品處理方法中藥體內(nèi)分析8 Traditional Chinese Medicine / herbal medicine 以中醫(yī)藥學(xué)理論體系的術(shù)語表述其性能、功效和使用規(guī)律，并且按中醫(yī)藥學(xué)理論指導(dǎo)其臨床應(yīng)用的傳統(tǒng)藥物。中藥中國藥典2010年版I部藥材和飲片植物油脂和提取物成方制劑和單味制劑 中藥中藥分析的特點(diǎn)以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，評價(jià)中藥質(zhì)量的整體性 化學(xué)成分的多

2、樣性和復(fù)雜性 藥效成分的非單一性 原藥材質(zhì)量的差異性 工藝、炮制方法及輔料的特殊性 雜質(zhì)來源的多途經(jīng)性 質(zhì)量控制方法的多源性 五倍子 鞣質(zhì)（70%）槐米 蘆?。?0%）長春花 長春新堿（百萬分之一）2、各種有效成分含量相差懸殊1、成分復(fù)雜且多數(shù)有效成分尚不十分清楚中藥分析的特點(diǎn)7原因：生長環(huán)境、采收季節(jié)及部位差異不同產(chǎn)地金銀花：綠原酸；山東平邑所產(chǎn)為5.66%，山西大谷為3.88%，云南大理為1.81%采收季節(jié)丹參：丹參酮 11、12月份含量最高3、中藥材質(zhì)量的不穩(wěn)定性 例：三黃瀉心湯干浸膏 常壓 減壓 逆浸透 成分 濃縮 濃縮 噴霧大黃酸葡萄糖苷 41.1 51.6 98.6%小檗堿 34.

3、5 37.5 94.5%黃連堿 6.3 12.0 93.7%黃芩苷 77.4 77.6 98.5%4、制劑工藝不同，有效成分含量也不同針對不同的劑型，采用相應(yīng)的方法進(jìn)行分離純化后測定蜜丸 蜂蜜錠劑 糯米粉、黃米粉膠劑 豆油、黃酒、冰糖5、劑型繁多，輔料干擾大中藥制劑易含有較高的重金屬、砷鹽和殘留農(nóng)藥等雜質(zhì)非藥用部位、泥沙重金屬、殘留農(nóng)藥包裝、保管不當(dāng)發(fā)生霉變、蟲蛀洗滌原料的水質(zhì)二次污染6、雜質(zhì)來源復(fù)雜，需控制液體制劑：合劑、口服液、酊劑等半固體制劑：煎膏劑、流浸膏固體制劑：丸劑、散劑、片劑、膠囊劑等中國藥典（2010年版）一部（二十六種）中藥制劑的分類含量測定檢查鑒別取樣中藥分析的一般程序13

4、 中藥制劑成分的多樣性和復(fù)雜性，需進(jìn)行樣品前處理； 前處理的目的：對待測組分進(jìn)行提取、分離、純化，排除制劑中的其他組分和輔料等干擾中藥分析的樣品前處理14取樣供試品溶液的制備超聲提取法*回流提取法連續(xù)回流提取法萃取法水蒸氣蒸餾法超臨界流體萃取法超聲提取法 利用超聲波的助溶作用進(jìn)行提取超聲波振蕩器（超聲波清洗器） 簡便 省時(shí) 提取率高 連續(xù)回流提取法樣品置有機(jī)溶劑中加熱，蒸發(fā)的溶劑經(jīng)冷凝流回樣品管的提取方法節(jié)省溶劑，提高提取效率適宜受熱穩(wěn)定的藥物費(fèi)時(shí)特點(diǎn)儀器索氏提取器用于皂苷類正丁醇氯仿乙醚、石油醚醋酸乙酯萃取法利用溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解度的不同用于生物堿類用于黃酮類用于揮發(fā)油18超臨界

5、流體萃取（SFE法）超臨界流體是指在臨界溫度和臨界壓力以上的流體，介于氣體與液體之間的一種物相。物質(zhì)狀態(tài)密度(g/cm3)粘度(g/cm/s)擴(kuò)散系數(shù)(cm2/s)氣態(tài)(0.6-2)x10-3(1-3)x10-40.1-0.4液態(tài)0.6-1.6(0.2-3)x10-2(0.2-2)x10-5SCF0.2-0.9(1-9)x10-4(2-7)x10-4超臨界CO2：Pc=7.37MPa ；Tc=31.3 19超臨界流體萃取法CO2萃取過程無味、無臭、無毒，安全性好；CO2價(jià)格便宜，純度高，可循環(huán)使用；樣品易濃集；藥味的選取原則單味制劑，直接進(jìn)行鑒別和含測；復(fù)方制劑，應(yīng)按照君、臣、佐、使選擇藥味；

6、應(yīng)首選君藥、臣藥、貴重藥、毒性藥。凡有原粉入藥者，應(yīng)該作顯微鑒別。原則上處方中的每一藥味均應(yīng)進(jìn)行鑒別，選擇盡量多的藥味（1/3藥味）。鑒別與含量測定藥味的選取原則選擇明確的有效成分或類別清楚的某一類總成分進(jìn)行含量測定檢測成分應(yīng)歸屬某單一藥味檢測成分應(yīng)與中醫(yī)用藥的功能主治相近無法含量測定的，可測定浸出物含量鑒別：性狀鑒別顯微鑒別色譜法鑒別含量測定：高效液相色譜法薄層掃描法氣相色譜法含生藥粉制劑丸劑、片劑、膠囊劑、散劑快速，簡便，覆蓋面大 顯微鑒別色譜鑒別TLC法應(yīng)用最多 （Rf、顏色、熒光）GC法 含揮發(fā)性成分的藥物 HPLC法常與含量測定同時(shí)進(jìn)行處方 牛黃10g 朱砂60g 黃連200g 黃芩

7、120g 梔子120g 郁金80g方藥分析牛黃清熱解毒藥，主含膽酸類成分黃連清熱燥濕藥，主要為小檗堿黃芩清熱燥濕藥，主要為黃酮類梔子清熱瀉火藥，主含梔子甙朱砂安神藥，主含硫化汞（HgS）郁金活血去瘀藥，主含揮發(fā)油 示例 萬氏牛黃清心丸黃芩苷供試品黃芩空白梔子苷供試品 梔子空白檢查項(xiàng)目意義方法水分貯藏過程中保證質(zhì)量的中藥指標(biāo)，霉變、粘結(jié)、成分分解烘干法、甲苯法、減壓干燥法總灰分和酸不溶性灰分控制藥材中泥土、砂土的量熾灼殘?jiān)ㄖ亟饘賹θ梭w有嚴(yán)重危害，藥材由于環(huán)境污染等原因易引入重金屬雜質(zhì)，嚴(yán)重影響中藥出口干法、濕法破壞-硫代乙酰胺法砷鹽藥材由于受除草劑、殺蟲劑、化學(xué)肥料等影響易引入砷鹽古蔡法、二乙

8、基二硫代氨基甲酸銀法等農(nóng)藥殘留藥材栽培為了減少蟲害，噴灑農(nóng)藥，土壤中殘存的農(nóng)藥，含磷、含氯，嚴(yán)重影響中藥出口氧瓶燃燒法(不明農(nóng)藥測定總氯/磷量)、GC (已知農(nóng)藥)、比色等中藥及其制劑分析的雜質(zhì)檢查中藥制劑特有的劑型及檢查項(xiàng)目 丸劑-水分、溶散時(shí)限 散劑-粒度（外用）、外觀均勻度 煎膏劑（膏滋）-相對密度、不溶物 流浸膏劑與浸膏劑-乙醇量 茶劑-水分、溶化性 膠劑-總灰分、重金屬、砷鹽 酒劑-乙醇量、總固體、甲醇量 露劑-pH值烘干法（不含或少含揮發(fā)性成分）甲苯法 （含揮發(fā)性成分）減壓干燥法（含揮發(fā)性成分貴重藥） GC法水分的測定酸不溶性灰分的測定總灰分的測定含量測定限度規(guī)定中藥及其制劑中待測

9、成分的含量限度，一般規(guī)定下限，如馬鞭草按干燥品計(jì)算，含熊果酸不得少于0.36%。毒性中藥應(yīng)規(guī)定上下限。例如馬錢子按干燥品計(jì)算，含士的寧應(yīng)為1.202.20%。多植物來源的藥材，如藥材能區(qū)分開的，其含量差異較大的，可制訂兩個(gè)指標(biāo)。 含量測定常用定量方法化學(xué)分析法揮發(fā)油測定法分光分度法HPLCGC薄層色譜掃描法含量測定相對校正因子法同時(shí)測定中藥多指標(biāo)成分的含量 原理：又稱為一測多評法，是基于中藥中常含有具有相似母核結(jié)構(gòu)的同一類成分，通過實(shí)驗(yàn)計(jì)算出各成分吸收系數(shù)間穩(wěn)定的相關(guān)數(shù)值，僅測定1個(gè)有對照品的目標(biāo)成分，進(jìn)而計(jì)算出其他同類成分的含量。所選擇的質(zhì)控指標(biāo)應(yīng)是藥材中的有效成分或指標(biāo)性成分，待測成分應(yīng)有

10、相對較高的含量；樣品收集應(yīng)選擇有代表性的藥材，樣本數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；并進(jìn)行各項(xiàng)分析方法學(xué)指標(biāo)驗(yàn)證。中國藥典采用此法對黃連中的表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿進(jìn)行含量測定 中藥安全性相關(guān)的質(zhì)量控制項(xiàng)目重金屬與砷鹽檢查農(nóng)藥殘留量分析黃曲霉素測定：桃仁、杏仁及相應(yīng)制劑中藥注射劑：重金屬和有害元素限度中藥摻偽摻假和非法添加的檢查毒性成分的控制：附子：含雙酯型生物堿，毒性強(qiáng)，采用TLC對烏頭堿限量檢查；重金屬與砷鹽檢查ChP附錄收載有四種重金屬檢查法，參見總論第5章砷鹽檢查法：古蔡法和二乙基二硫代氨基甲酸銀法雙硫腙比色法：選擇性地測定制劑中的鉛原子吸收分光光度法：鉛使用鉛空心陰極燈測定；砷用砷空心陰極燈

11、高效液相色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜：測定中藥中不同價(jià)態(tài)重金屬離子的含量殘留農(nóng)藥種類有機(jī)氯類：六六六、DDT、五氯硝基苯、艾氏劑有機(jī)磷類：磷酸酯類（敵敵畏、敵百蟲）、硫代磷酸酯類（對硫磷）、磷酰胺及硫代磷酰胺（甲胺磷）擬除蟲菊酯類：氯氰菊酯、溴氰菊酯氨基甲酸酯類：西維因、呋喃丹農(nóng)藥殘留量分析ChP2010一部附錄IX Q 農(nóng)藥殘留量測定法 有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留量測定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)： SE-54（30m 0.32mm 0.25um）或DB-1701，63Ni- ECD電子捕獲檢測器。進(jìn)樣口溫度：230；檢測器溫度：300；不分流進(jìn)樣；程序升溫：初始100，每分鐘10升至220，每分鐘8升至25

12、0，保持10分鐘。理論塔板數(shù)按-BHC峰計(jì)算，不低于106，分離度應(yīng)大于1.5。 混合對照品溶液：BHC（、-BHC），DDT（PP-DDE、PP-DDD、OP-DDT、PP-DDT），五氯硝基苯（PCNB），溶劑為石油醚（60-90）；供試品溶液制備：藥材、中藥制劑進(jìn)樣量：1ul按外標(biāo)法計(jì)算9種農(nóng)藥殘留量中藥摻偽造假摻雜摻偽造假用白芍的根莖部分染色加工成川烏、草烏用紅薯染色加工成制首烏；用淀粉壓模制成冬蟲夏草； 西洋參摻入生曬參短枝用薄紙切細(xì)絲染色摻雜于西紅花中；濫用硫磺熏蒸藥材使美觀和防蟲蛀 莪術(shù)偽充三七的鑒別三七具有散瘀止血、消腫定痛等功能，因其療效顯著，商品價(jià)格昂貴，一些不法商販在利益

13、驅(qū)動(dòng)下，以廉價(jià)的莪術(shù)偽充。莪術(shù)作用峻猛，偽充三七可能產(chǎn)生副作用，故應(yīng)加以區(qū)別應(yīng)用 粉末顯微鑒別薄層色譜鑒別 粉末顯微鑒別三七（1）木栓細(xì)胞呈長方形或多角形，壁薄，棕色；（2）淀粉粒眾多，單粒呈類圓形、多角形或不規(guī)則形，直徑330 m；（3）樹脂道內(nèi)含棕黃色滴狀或塊狀分泌物；（4）導(dǎo)管以網(wǎng)紋多見，直徑1640 m；（5）草酸鈣簇晶稀少，棱角較鈍莪術(shù)（1）非腺毛多已呈碎片，完整者極少；（2）淀粉粒大多糊化成團(tuán)塊，未糊化淀粉粒多為單粒，卵圓形，短桿狀，長2341 m，寬1924 m，有明顯層紋；（3、4）導(dǎo)管多為螺紋、梯紋，少數(shù)導(dǎo)管伴有桿狀纖維群，纖維壁孔明顯，導(dǎo)管及纖維均木化。 中藥指紋圖譜 定義

14、：運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)表征和評價(jià)具有代表性中藥化學(xué)成分群信息?！艾F(xiàn)代分析技術(shù)”：光譜、色譜、波譜、聯(lián)用技術(shù)，以及化學(xué)計(jì)量學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)等。“中藥化學(xué)成分群”：藥材、飲片、中藥提取物和成藥中與藥理活性相關(guān)的，由次生代謝產(chǎn)物組成的化合物群?！按硇浴保褐兴幓瘜W(xué)成分群信息須具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的樣本數(shù)。國外應(yīng)用情況美國FDA允許草藥類食品添加劑申報(bào)中可以提供色譜指紋圖譜。WHO在草藥評價(jià)指導(dǎo)原則中規(guī)定若活性成分不明，可以提供色譜指紋圖譜以證明產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。歐共體在草藥質(zhì)量評價(jià)的指南中指出，單靠測定某有效成分的穩(wěn)定性是不夠的。國際上基本認(rèn)可，草藥色譜指紋圖譜可以提供復(fù)雜成分的定性甚至定量信息，考察生產(chǎn)中的影

15、響，控制產(chǎn)品的一致性。色譜指紋圖譜的基本屬性模糊性 強(qiáng)調(diào)分析、比較指紋圖譜的相似性，而不是完全相同。是一種綜合的、量化的色譜鑒別手段。整體性 將指紋圖譜作為一個(gè)整體來分析和比較它的綜合特征以達(dá)到鑒別的目的。系統(tǒng)性：指圖譜所反映的化學(xué)成分全部信息，其中包括中藥有效部位所含主要成分的種類，或指標(biāo)成分的全部。特征性：指圖譜中反映的化學(xué)成分信息是具有高度選擇性的，這些信息的綜合結(jié)果，將有助于特征區(qū)分中藥的真?zhèn)闻c優(yōu)劣。穩(wěn)定性：在規(guī)定的方法與條件下，不同的操作者和不同的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能作出相同的指紋圖譜。指紋圖譜的制定原則中藥預(yù)處理中藥液相色譜分析條件分離色譜條件初始化指導(dǎo)方法學(xué)考察指紋圖譜調(diào)整色譜條件N其他1

16、.計(jì)算機(jī)輔助指紋圖譜評價(jià)2.多成分定量分析方法建立色譜指紋圖譜平臺(tái)流程中藥指紋圖譜工作站軟件中藥體內(nèi)分析中藥體內(nèi)定量分析方法中藥藥代動(dòng)力學(xué)代謝組學(xué)研究示例：基于RPLC-HILIC-TOFMS技術(shù)的四逆湯治療心肌梗死作用的血清代謝組學(xué)研究采用親水色譜和反相色譜相結(jié)合的策略進(jìn)行研究，更加全面的發(fā)現(xiàn)心肌梗死的血清標(biāo)志物，分析四逆湯對機(jī)體的調(diào)節(jié)作用 Fig. Typical serum total ion chromatograms separated on (a) RPLC and (b) HILIC. (c) Responses of standard L-isoleucine ion m/z 132.10 on RPLCMS and HILICMS.RPLC-Q-TOFMS HILIC-Q-TOFMS 對極性代謝物具有更好的保留 質(zhì)譜響應(yīng)增強(qiáng)，靈敏度提高 這是得到的反相和親水的總離子流圖，以異亮氨酸為例，我們發(fā)現(xiàn)相同的濃度下，在親水模式下，具有更好的質(zhì)譜響應(yīng)，同時(shí)，我們能夠觀察到，在反相體系下，其流出接近于死時(shí)間，而在親水色譜條件下，具有更好的保留行為。Fig. PLS-DA scores plot from RPLC-MS