藥物分析學(xué)：樣品前處理和藥物提取技術(shù)

1、第三章 樣品前處理和藥物提取技術(shù)【體內(nèi)藥物分析】1、體內(nèi)樣品的特點：采樣量少；待測物濃度低；干擾物質(zhì)多2、體內(nèi)藥物分析的特點：體內(nèi)樣品需經(jīng)分離與濃集，或經(jīng)化學(xué)衍生化處理后才能進(jìn)行分析；對分析方法的靈敏度及專屬性要求較高；分析工作量大3、測定方法：色譜分析法，免疫分析法和生物學(xué)方法第一節(jié) 生物樣品的采集、制備、貯存一、體內(nèi)樣品的種類二、體內(nèi)樣品的采集和制備（一）血樣血漿、血清和全血體現(xiàn)藥物濃度和治療作用之間的關(guān)系。最常用的生物樣本。1、血樣的采集：注射器 、毛細(xì)管眼眶采血、靜脈插管手術(shù)、 滯留針股靜脈取血動物實驗時，采血量不宜超過動物總血量的十分之一。2、血樣的制備：測定血中藥物的濃度，通常是指

2、測定血漿或血清中的藥物濃度，尤其是血漿，并非指全血。（1）血漿（ plasma ）的制備抗凝劑：肝素（最常用）、EDTA、枸櫞酸鹽、草酸、 氟化鈉。（2）血清（ serum ）的制備血漿比血清的分離快，而且制取的量約為全血的50%60%，血清只為全血的20%40%，多數(shù)研究者用血漿進(jìn)行分析測定。（3）全血（ whole blood）的制備應(yīng)用：若需專門測定平均分布于血細(xì)胞內(nèi)、外的藥物濃度；血漿內(nèi)藥物濃度波動太大，且難以控制血樣主要用于藥物動力學(xué)、生物利用度等研究及臨床治療藥物濃度監(jiān)測最常用的生物樣本。（二）尿樣體內(nèi)藥物清除主要是通過尿液排出，藥物可以原型、相及相代謝物等多種形式排出。用于藥物劑

3、量回收、尿清除率、生物利用度、內(nèi)源性活性物質(zhì)、藥物代謝分型及代謝物等的研究測定。1、尿樣的特點尿液中藥物濃度較高，收集量可以很大，但易受食物種類、飲水多少、排汗情況的影響。一般以某一段時間或單位時間內(nèi)尿中藥物的總量（排泄量或排泄率）表示。2、尿樣的采集采集的尿是自然排尿。尿包括隨時尿、晨尿、白天尿、夜間尿及時間尿幾種。（1）測定方式測定一定時間內(nèi)排入尿中的藥物總量（2）樣本采集時間尿（在規(guī)定時間區(qū)間內(nèi)采集），并測量每次收集的尿液體積。（三）唾液（saliva）一些藥物的唾液藥濃(S）與血漿游離藥濃（P）密切相關(guān)，因此：TDM中利用對S的測定代替對P的監(jiān)測藥代動力學(xué)的研究1、唾樣的采集：在潄口后

4、15min，安靜狀態(tài)下采集口腔內(nèi)自然流出的唾液；也可在刺激下快速采樣(需注意干擾)。（1）物理法(口嚼石臘片、聚四氟乙烯塊或紗布球等)（2）化學(xué)法(將檸檬酸或維生素C等置于舌尖)棄去初始部分后采集2、唾樣的制備：唾樣采集后，立即測量其除去泡沫部分的體積，以3000rpm離心10min，取上清液直接測定或冷凍保存。（四）組織用于在藥物的動物試驗及臨床上由于過量服用藥物而引起的中毒死亡時，為藥物的體內(nèi)動力學(xué)過程提供重要信息。常用的組織：胃、肝、腎、肺、心、腦等1、組織樣品的制備：制成勻漿溶液2、組織樣品的處理：沉淀蛋白法；酸水解或堿水解；酶水解法（五）頭發(fā)可用于體內(nèi)微量元素的含量測定；也可用于用藥

5、史的估計、臨床用藥物和非法濫用藥物的甄別1、頭發(fā)樣品的采集：微量元素在前額部位的頭發(fā)中含量最低，枕部含量最高，應(yīng)從枕部取樣，采集時從發(fā)根部（靠近頭皮約1cm處)，剪取0.5-1g的頭發(fā)2、頭發(fā)樣品的洗滌：丙酮-水-丙酮3、頭發(fā)樣品的處理：直接甲醇提?。凰崴猓?.1mol/L鹽酸）；堿水解（1mol/L氫氧化鈉）；酶水解（最常用）。三、體內(nèi)樣品的貯存與處理（一）最常用的方法冷藏或冷凍冷藏冰箱(4)中短期保存(12d) 冷凍冷柜(-20)或低溫冷柜(-80)中長期保存冷藏或冷凍的時限：經(jīng)穩(wěn)定性考察后確定1、血樣的貯藏采集后及時分離血漿和血清（2h），分離后置硬質(zhì)玻璃試管中或EP管中完全密塞后再貯

6、存。2、唾液樣品的貯藏（1）測定唾液pH時應(yīng)在取樣的當(dāng)時測定。（2）為阻止酶催化生成粘蛋白，應(yīng)在4以下保存（3）冷凍保存唾液時，解凍后應(yīng)用前搖勻。3、尿樣的貯藏 采集后應(yīng)立即測定（24h），若不能立即測定，加入防腐劑后保存。保存時間為2436h(4)或長期(-20)（二）去活性 為防止含酶樣品在采樣后酶對待測組分進(jìn)一步代謝，采樣后必須立即終止酶的活性。常采用的方法：液氮中快速冷凍、微波照射、勻漿及沉淀、加入酶活性阻斷劑（如氟化鈉、四氫尿苷、三氯醋酸）或抗氧化劑（如維生素C等）、樣品煮沸。第二節(jié) 生物樣品的預(yù)處理一、游離藥物濃度測定方法1、平衡透析法：用半透膜只允許小分子藥物通過，而不允許蛋白質(zhì)

7、等大分子物質(zhì)通過的原理而分離游離型藥物。缺點為所需血樣量較多，且耗時長。2、超濾法：超濾法是以多孔性半透膜-超濾膜作為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)。在超濾法中超濾膜是超濾技術(shù)的關(guān)鍵。超濾膜是一種具有不對稱結(jié)構(gòu)的多孔膜，膜的正面有一層起分離作用的較為緊密的薄層，稱為有效層，其厚度只占總厚度的幾百分之一，其余部分則是孔徑較大的多孔支撐層。3、超離心法4、凝膠過濾法二、生物樣品分析前處理的目的在測定體內(nèi)藥物及其代謝物時，首先需對復(fù)雜的生物樣品實施分離、凈化、濃集、化學(xué)衍生化等樣品預(yù)處理過程為藥物的最終測定創(chuàng)造良好條件。(1) 使待測藥物游離測定藥物的總濃度(2) 使樣品純化消除生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾

8、(3) 提高檢測靈敏度適應(yīng)和符合測定方法要求的靈敏度(4) 防止分析儀器的污染和劣化提高分析儀器的耐受程度、改善分析結(jié)果三、樣品制備時應(yīng)考慮的影響因素1、藥物的理化性質(zhì)和存在形式藥物的酸堿性（pKa）、未電離分子的親脂性、揮發(fā)性等物理參數(shù)2、待測藥物的濃度范圍3、藥物測定目的4、選用的生物樣品類型5、樣品預(yù)處理與分析技術(shù)的關(guān)系四、生物樣品的預(yù)處理技術(shù)（一）去除蛋白質(zhì)法目的：結(jié)合型藥物釋放、減少乳化的產(chǎn)生、保護(hù)儀器常用方法：1、溶劑沉淀法蛋白質(zhì)脫水沉淀（1）常用的有機(jī)溶劑乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氫呋喃等（2）血樣與溶劑的體積比1(1-3)除去90%以上蛋白質(zhì)（3）離心分離高速(15000

9、 g)離心5min（4）上清液pH pH8.59.52、中性鹽析法“鹽析”沉淀蛋白質(zhì)（1）常用中性鹽飽和(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4、NaCl、Na3PO4等（2）試劑用量血樣與飽和(NH4)2SO4的比例為12時除去90%以上的蛋白質(zhì)（3）離心分離高速離心2min（4）上清液pH pH7.07.73、強(qiáng)酸沉淀法與蛋白質(zhì)陽離子(銨基)形成不溶性鹽沉淀（1）常用的強(qiáng)酸10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等（2）試劑用量血清與強(qiáng)酸的比例為10.6時；除去90%以上的蛋白質(zhì)（3）離心分離高速(10000r/min)離心12min（4）上清液pH pH 044、熱凝固法蛋白質(zhì)受熱變性

10、當(dāng)待測物熱穩(wěn)定性好時可采用。通?？杉訜嶂?0，只能除去熱變性蛋白。第三節(jié) 提取分離及相關(guān)技術(shù)【目的】1、消除內(nèi)源性物質(zhì)、代謝物及其他共存物質(zhì)的干擾；2、提取濃縮待測物質(zhì)，使其易于檢測【方法】液-液萃取法(傳統(tǒng)的方法)；固相萃取法(液固萃取法)；自動化固相萃?。还滔辔⑤腿。怀瑸V；微透析技術(shù)一、液液萃取法 (liquid-liquid extraction, LLE)（1）溶劑的選擇試驗成功的主要條件 （相似相溶原則）考慮：提取效率和選擇性；操作是否方便對藥物的未電離分子可溶、電離形式分子不溶沸點低、易揮發(fā)與水部相混溶無毒、不易燃燒具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性不影響紫外檢測（2）溶劑的用量萃取次數(shù)通

11、常為1次(萃取R在70%以上)；必要時23次(萃取R在50%以下)每次用量和水相的體積比通常為1:1或25:1萃取方式渦流混合（3）水相pH值水相pH值藥物的pKa確定90%以上的非電離形式堿性藥物最佳pH值：高于pKa值12個 pH單位酸性藥物最佳pH值：低于pKa值12個pH單位一般規(guī)則：堿性藥物在堿性pH值、酸性藥物在酸性pH值介質(zhì)中提??；生物樣品宜在堿性或近中性提取生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)多為酸性，在堿性下不易萃取二、離子對提取法Q+aq（被測藥物）+X-aq（反離子）QXorg（離子對）提取常數(shù)：分配系數(shù)：影響提取效率的因素（1）測定堿性藥物時，一般用烷基磺酸類（RSO3H）作為反離子；

12、如戊烷磺酸、己烷磺酸、庚烷磺酸、辛烷磺酸、月桂磺酸等；（2）測定酸性藥物時，一般用烷基季銨類化合物（R4N+X-）作為反離子，如四丁基銨、四乙基銨、四辛基銨等。（3）欲提高藥物提取入有機(jī)相的量，應(yīng)選擇對離子對溶解度大的有機(jī)溶劑；常用的提取溶劑為氯仿、二氯甲烷等。三、固相萃取法（Solid-phase extraction, SPE）1、SPE原理將不同填料作為固定相裝入微型小柱，當(dāng)含有藥物的生物樣品溶液通過時，由于受到吸附、分配、離子交換或其它親和力作用，藥物或雜質(zhì)被保留在固定相上，用適當(dāng)溶劑清洗雜質(zhì)，再用適當(dāng)溶劑洗脫藥物。2、洗脫方式A: 藥物與固定相的親和力比雜質(zhì)強(qiáng)而被保留，用一種對藥物親

13、和力更強(qiáng)的溶劑洗脫B: 雜質(zhì)與固定相親和力比藥物強(qiáng)，藥物被直接洗脫通常為A模式3、固相的選擇原則固相與被測組分應(yīng)具有相似的極性SPE的填料種類繁多，可分成三類1）親脂型（大孔吸附樹脂、親脂性鍵合相硅膠）2）親水型（硅膠、硅藻土、棉纖維）3）離子交換型4、試驗步驟五步1）用甲醇活化填料2）用水或適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗小柱除去殘留的甲醇3）加樣使樣品經(jīng)過小柱，棄去廢液4）用水或適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗小柱除去殘留的干擾物5）選擇適當(dāng)?shù)南疵撊軇_洗小柱洗脫被分析物，收集洗脫液，揮干溶劑，備用或直接進(jìn)行在線分析5、方法特點優(yōu)點：1）引入雜質(zhì)少2）完全避免乳化的形成 3）較高萃取率、重現(xiàn)性較好4）使用溶劑多數(shù)與水混溶

14、，易于自動化缺點：1）價格昂貴 2）技術(shù)要求高四、固相微萃取技術(shù) （SPME）五、湍流色譜（TFC）1、由有孔的填料代替了無孔填料， 當(dāng)使用內(nèi)徑為1.0mm的柱子時，流速可以達(dá)到35ml/min而柱回壓（column back-pressure）較低；且溶劑前沿峰呈現(xiàn)塞子樣的輪廓而非拋物線的形狀，既非線性液流；這兩個特點提高了滲透速率，可以盡快達(dá)到吸附平衡。2、TFC是一種直接進(jìn)樣預(yù)處理技術(shù)，在對血漿和血清樣品的處理上實用性很強(qiáng)，利用分子排阻原理，使得大分子的生物基質(zhì)成分與小分子藥物得到很好分離。這樣，樣品的預(yù)處理過程簡化為離心后就可以直接進(jìn)樣處理。3、TFC 一般用于蛋白結(jié)合率高的樣品，通常

15、的樣品不需要特殊的處理其回收率就能達(dá)到 70-100% ，而與蛋白結(jié)合非常強(qiáng)的藥物在進(jìn)行TFC 時要調(diào)低流速（0.5 ml/min) 或在萃取前進(jìn)行酸化。六、膜萃取技術(shù)利用膜在兩相間的選擇性屏障作用進(jìn)行分離富集的方法。包括有孔膜萃取和無孔膜萃取七、微透析目前微透析技術(shù)廣泛應(yīng)用于色譜分析，特別是在用毛細(xì)管電泳分析生物樣品時。原理如下圖所示：八、超臨界流體萃取藥物分析中廣泛采用SEF與其它多種分析儀器聯(lián)用技術(shù)。如：SFE-GC、SFE-HPLC、SFE-FTIR（fourier transform infra-red spectroscopy，傅立葉變換紅外光譜）、SFE-NMR（nuclear

16、magnetic resonance，核磁共振）、SFE-MS（mass spectrography，質(zhì)譜法）及SFE-SFC（supercritical fluid chromatography，超臨界流體色譜法）聯(lián)用等。優(yōu)點如下：回收率高，不易乳化分析速度快，適于批量處理適用范圍廣易于聯(lián)用減少了有毒性的有機(jī)溶劑的使用九、柱切換技術(shù)柱切換技術(shù)可用于：(1)樣品沉淀蛋白后進(jìn)樣(2)體液直接進(jìn)樣(在線去蛋白)(3)全血或組織勻漿直接進(jìn)樣(4)其他聯(lián)用：在線透析、在線衍生化等第四節(jié) 化學(xué)衍生化某些藥物或代謝物極性大、揮發(fā)性低或?qū)z測器不夠靈敏，使常規(guī)的HPLC或GC難以有效測定需衍生化。藥物分子中

17、含有活潑氫者均可被化學(xué)衍生化如R-COOH、R-OH、R-NH2、R-NH-R化學(xué)衍生化的目的使藥物變成具有能被分離的性質(zhì)提高檢測的靈敏度增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性提高對光學(xué)異構(gòu)體分離的能力等1、GC法中的化學(xué)衍生化主要衍生化反應(yīng)：a: 烷基化b: ?；痗: 硅烷化應(yīng)用最廣泛d: 不對稱衍生化：使對映異構(gòu)體藥物生成非對映異構(gòu)體衍生物2、HPLC法中的化學(xué)衍生化(1)目的：a: 提高對樣品的檢則靈敏度b: 改善色譜分離效果(2)化學(xué)衍生反應(yīng)的要求a.反應(yīng)條件不苛刻、能迅速定量進(jìn)行b.生成單一衍生物，反應(yīng)副產(chǎn)物、包括過量的衍生試劑不干擾被測樣品的分離和檢測c.衍生試劑方便易得、通用性好(3)衍生化分類柱前衍生法