DNA重組實驗常見問題分析

1、Sirtuins as potential targetsfor metabolic syndromeLeonard Guarente1Metabolic syndrome threatens health gains made during the past century. Physiological processes degradedby this syndrome are often oppositely affected by calorie restriction, which extends lifespan and preventsdisease in rodents. Re

2、cent research in the field of ageing has begun to identify important mediators ofcalorie restriction, offering the hope of new drugs to improve healthspan. Moreover, if metabolic syndromeand calorie restriction are opposite extremes of the same metabolic spectrum, calorie restriction mimeticsmight p

3、rovide another therapeutic approach to metabolic syndrome. Sirtuins and other important metabolicpathways that affect calorie restriction may serve as entry points for drugs to treat metabolic syndrome.長壽蛋白作為代謝綜合癥的潛在目標(biāo)在二十世紀(jì)，代謝綜合癥威脅著人類的健康。相反地，該綜合癥導(dǎo)致的生理過 程退化常常受到卡路里限制?？防锵拗茣娱L壽命，保護嚙齒類不生病。在 有關(guān)老齡化的領(lǐng)域里，最近

4、有研究開始鑒別卡路里限制的重要中介，這為研制 新的藥物提高壽命提供了希望。并且，如果代謝綜合癥和卡路里限制是同樣代 謝光譜的兩個相反極端的話，卡路里限制模仿將為治療代謝綜合癥提供了新的 途徑。長壽蛋白和其他重要的影響卡路里限制的蛋白途徑可能作為治療代謝綜 合癥藥物的入口點。載體用NotI單酶切，目的片段也用NotI單酶切，并對載體進行去磷酸化，但一直也沒連上？參考見解：1、用NEB的高效連接酶連看看，用400U或2000U的試試2、16度過夜連接，或更長3、單酶切用PCR來鑒定方向方便些4、去磷酸化后，將去磷酸化酶失活很重要，否則可能根本連不上。5、失活的方法很多了，可以加熱（有的熱敏感酶可以

5、），可以直接過膠回收柱子，但比較放心的方法就 是跑膠回收。PCR擴增到特異性產(chǎn)物后，回收PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物用BamHI和EcoRI （NEB公司的酶）在隨 EcoRI的BUFFER中雙酶切8小時，同時，p UC18同樣酶切，連接片段和載體DNA酶切均用 QIAGEN quick spin column回收片段，按NEB連接酶說明過夜連接，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化。但是，看 轉(zhuǎn)化結(jié)果，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的平板大部分是藍斑？什么原因？ 參考見解：1、柱子回收一般沒有問題，但會不會存在操作問題，所以回收產(chǎn)物可以跑膠或用紫外分光系統(tǒng)檢測一下 有沒有DNA。2、PCR產(chǎn)物直接酶切，在設(shè)計引物的時候有沒有在酶切位點兩

6、邊加保護堿基？這里pcr產(chǎn)物酶切出問 題的可能性很大。3、酶有沒有問題？可以用這兩個酶切一些已知的質(zhì)?？纯茨懿荒艿玫剿钠瑪?。4、大部分是藍斑說明可能是載體酶切不完全，也可能是沒有在載體酶切后跑膠回收載體，這樣不能完全 除去酶切掉的小片斷（Qiagen的柱子對小片斷的回收比較好），后來連接反應(yīng)中小片斷可能又連上了。5、大部分是藍斑，那就是還有白色的。挑了白色的搖了提質(zhì)?？纯窗?，說不定就有陽性的。6、建議在載體酶切后用堿性磷酸酶進行去磷酸化，這樣可以徹底防止載體的自身環(huán)化。酶切目的基因及質(zhì)粒載體后加Loading buffer終止反應(yīng)，然后要直接進行連接反應(yīng)，可以嗎？要是不行， 還有一種方法就

7、是加熱滅活限制酶（用的是Hind3/EcoR1雙酶切），多高溫度適合??？參考見解：1、一般直接用2倍體積的無水乙醇沉淀目的片段，干燥后直接用水溶解連接即可。比較適用于載體和 PCR產(chǎn)物的連接。效果很好。2、酶切后要膠回收后再連接，另外酶切結(jié)束后,直接電泳回收不用加終止液，對連接沒有影響.3、 有的公司的限制酶（如NEB）是不需要熱滅活的，而有的公司的限制酶（如MBI）則需要熱滅活， 一幫是65攝氏度，10分鐘。然后經(jīng)凝膠回收后再作連接，目的片段與質(zhì)粒的摩爾比在310： 1的范 圍內(nèi)連接效果都不錯。4、通常隨酶附送的loading buffer是含有SDS起到滅活的作用，但在上樣時會產(chǎn)生很多泡沫

8、。一個質(zhì)粒的雙酶切，兩種酶buffer 一樣，同時切膠。跑膠時，一個小片段看不到，大概600bp，怎么 辦？根據(jù)Marker把需要的4900bp的片段進行膠回收，效果特別差。用乙醇沉淀法回收，然后跑膠， 回收，效果也不好?，F(xiàn)在要做連接，可雙酶切后質(zhì)粒的回收不好，用于連接的質(zhì)粒雙酶切后怎么處理？把 乙醇沉淀回收的雙酶切質(zhì)粒直接用于連接，這樣可以嗎？參考見解：1、做雙酶切的時候用的buffer都是根據(jù)公司提供的雙酶切最適buffer，每個公司應(yīng)該都提供雙酶切 使用的buffer列表。2、酶切后電泳條帶比較好，切膠回收的效果不好，可能是回收過程中操作出現(xiàn)問題，或者是回收試劑盒 有問題?？梢試L試更換試

9、劑盒做回收試試，或者看看酶切電泳后目的條帶有沒有彌散，如果有，切膠回收 得不到好的效果。3、用于連接的的片段應(yīng)是單一的，如果將雙酶切的質(zhì)粒直接用于連接，即使得到了轉(zhuǎn)化子，鑒定也比較 麻煩，自己都不知道連上的到底是目的片段還是非目的片斷。最好用回收產(chǎn)物做連接。4、酶切時如果質(zhì)粒很大7kb那么希望得到的600bp亮度相對vector太暗了，可能看不到，如果 600的帶看不到，可以試試加大酶切的質(zhì)粒的量。相同mol數(shù)600和4900的帶亮度差別會很大。5、如果酶沒有問題那就要確定雙酶切是否已經(jīng)切開了，已經(jīng)切開了，只是600bp比較弱的話，可以嘗 試加大酶切體系（如增大酶切體系為原來的兩倍或三倍），酶

10、切后乙醇沉淀富集酶切片斷后用小體積TE 溶解后電泳，效果可能有所改善。如果根本就沒有切開的話，那就要考慮是否是酶的問題，buffer的問 題或質(zhì)粒的問題。將載體和目的片段（PCR擴增產(chǎn)物，約500bp,兩端設(shè)有酶切位點）分別用EcoR1和BamH1雙酶切 后，定向連接。但載體上該雙酶切位點間有一個800bp的片段，酶切后電泳可見這一片段，表明酶切成 功，膠回收了大片段。連接轉(zhuǎn)化成功后，挑選的單菌落提質(zhì)粒，PCR鑒定表明有目的片段，約500bp， 但雙酶切卻仍然是800bp的原片段長度。目的片段不含有雙酶切位點。請問連接是否成功？若成功了， 為何會出現(xiàn)這種奇怪的現(xiàn)象？參考見解：如果pCR沒有污染

11、1、假設(shè)挑選的是單菌落，則有可能是因為自己引物非特異擴增。PCR比酶切更易出問題，相信酶切結(jié) 果，沒連上。2、假如PCR沒有問題，最可能是菌被污染，連上了，但有污染。這種可能性大。假陽性產(chǎn)生的可能性 極大。3、最好重新挑科隆，搖菌。如果不行再用通用引物確定是否沒有連上。4、應(yīng)該使用載體引物來作PCR鑒定，因為自己的引物作很有可能出現(xiàn)假陽性。5、片斷是500bp的，而載體切下來的片斷中含有800bp，是否是因為重組質(zhì)粒的濃度太低，使得 800bp的片斷可以見到，而沒有辦法看見500bp的，所以建議將重組質(zhì)粒酶切量增加，電泳時上樣量 增加。6、可以看到800bp的片斷，應(yīng)該是載體自連接，因為插入片

12、斷后載體的酶切位點移位，應(yīng)該沒有辦法 再次切下800bp的片斷，所以建議重新挑菌再作。7、如果您能通過PCR檢測出您提取的質(zhì)粒中含有目的片斷，而雙酶切時卻只能顯示應(yīng)該切除的片斷，說 明可能出現(xiàn)的情況是:您的連接成功，但是您挑取的菌落并不是單克隆，而是包含有假陽性（也就是自連接的 質(zhì)粒菌落）的混合菌落，而且假陽性菌落比例高于需要的陽性菌落，導(dǎo)致在進行搖菌擴增質(zhì)粒時，同時大量擴 增了假陽性質(zhì)粒，從而出現(xiàn)上面描述的情況8、如果打算從新開始酶切，連接，轉(zhuǎn)化的話，建議加大酶切時酶的使用量，在酶切片斷回收時盡量不要切下 雜帶，這樣可以盡量減少自連假陽性的可能性。9、如果不打算從新做過，建議在原來已經(jīng)鋪好細(xì)

13、菌的LB固體培養(yǎng)基上，再挑取一些菌落，可以一次性 多挑幾個單克?。ㄓ涀。欢ㄒ菃慰寺?，否則很難處理），中心的和周邊的，大的和小的，都挑一些， 然后用國產(chǎn)質(zhì)粒提取試劑盒進行小量提取，并且酶切鑒定，這樣可以節(jié)省大量的時間，并且取的不錯的效 果，在用試劑盒提取之前每個菌落保留12ml菌液，凍存，并標(biāo)記好對應(yīng)的試管，如果之后發(fā)現(xiàn)那個菌 落是陽性克隆的話，回過頭來就可以使用凍存的菌液大量提取了。TaKaRa的內(nèi)切酶和NEB的內(nèi)切酶哪個更好一些？參考見解：TaKaRa的內(nèi)切酶、NEB的內(nèi)切酶兩個公司的酶的品質(zhì)都非常好。NEB公司的酶的活性很 高，切出兩條小帶可能是因為出現(xiàn)星活性，可以試試把酶量減半。NE

14、B的酶很多都是克隆的，所以純度 比較高。應(yīng)用磁性微球提取人全血基因組DNA，將提取出的DNA直接用于限制性酶切反應(yīng)，應(yīng)用Taq1酶，但 發(fā)現(xiàn)酶切后產(chǎn)生的是smier片斷，即切碎的狀態(tài)。不知原因是什么？在做這類實驗時，一般是將PCR產(chǎn) 物進行酶切，這與實驗結(jié)果有聯(lián)系嗎？是不是直接提取出的DNA必須要做PCR擴增，才能應(yīng)用酶切？參考見解：為建立基因組文庫時一般才用限制性內(nèi)切酶酶切人基因組DNA目的是為獲得含有人全部DNA的隨 機片段的總和.然后再用載體和宿主細(xì)胞構(gòu)建克隆.關(guān)于文庫建立園內(nèi)資料很多.lyz703lyz戰(zhàn)友感興趣的 話可以自己搜索下電泳圖，酶切后是一片彌散的帶，是因為基因組中存在大量T

15、aq1酶的酶切位點，由于操作屬于隨機酶切, 所以得到的DNA也是隨機的，而不是大量均一的.那么電泳后的出現(xiàn)這樣的結(jié)果也很容易解釋.一般在PCR后采用酶切是由于酶切模板數(shù)目巨大且均一，在了解了被切DNA上有關(guān)限制性內(nèi)切酶位 點的信息后，我們就可以根據(jù)自己的目的來選擇合適的內(nèi)切酶進行酶切.做抑制差減雜交，需要回收細(xì)菌基因組酶切（Alu1酶）后的全部片段,要求回收后至少是6微升，濃度要有 0.3微克微升，按照抑制差減雜交說明書，采用酚仿抽提和無水乙醇沉淀法，只要酶切2微克基因組就能滿 足條件，可已經(jīng)把酶切量擴大到10多微克了，回收還是達不到濃度（大約只有0.06微克微升），又不敢切 膠回收，怕EB對

16、后續(xù)反應(yīng)造成影響。請教該怎么辦？參考見解：回收酶切產(chǎn)物濃度低的原因可能是：苯酚/氯仿抽提時損失太多。說明書上說苯酚/氯仿/異戊 醇和氯仿各抽提兩次，這樣經(jīng)過四次抽提DNA損失得非常多，解決辦法是將50?l酶切產(chǎn)物加等體積的 滅菌去離子水，然后再抽提，損失會減少很多；另外乙醇沉淀時可以延長，低溫沉淀會提高得率；還有用 80%乙醇洗滌沉淀棄上清時，要輕輕用移液槍吸出，防止將沉淀隨上清倒出。注意這幾點應(yīng)該可以回收到 理想濃度的DNA 了。做PCR將分別將50和300bp片段擴出后，將兩個片段連接到一起為550bp，要將550bp片段連到 載體上，但550bp片段中間產(chǎn)生了新的酶切位點跟設(shè)計的酶切位點

17、AseI 一樣，想通過部分酶切方法得 到550的片段，如果完全酶切就分成原來的兩個片段，求教部分酶切的詳細(xì)方法？參考見解：可以選擇那個和設(shè)計不相同的那一端的酶切位點先做連接，之后再進行平化連接，這樣就可以 避免所設(shè)計中的有重復(fù)酶切位點的問題了。部分酶切關(guān)鍵是酶切時間，可以先摸索一下酶切的時間。在一 個大一點的體系中（比如50微升體系），37度酶切，然后每隔一段時間取出一部分（比如5微升或10 微升），然后一起進行核酸電泳，摸索一下合適的酶切時間。部分酶切的話，時間應(yīng)該不能太長，可以每 間隔5分鐘或10分鐘左右就取一次。要將PCR片段連入表達載體中,選的是TaKaRa的BamH I和Hind I

18、II,請問這個雙酶切是在37度 反應(yīng)還是30度，要酶切多長時間？PCR片段比較難切嗎,引物兩端都各加了 3個保護堿基？參考見解：一般37度2小時就行，在酶切時，由于你所選用的酶都是效率比較高的，酶切一個小時就已 經(jīng)足夠了。不過若不放心，過夜也沒問題。buffer需要共用buffer（比如Y buffer）。PCR片段的酶 切效率與引物兩端所加保護堿基有很大關(guān)系。如果保護堿基加的恰當(dāng)，酶切應(yīng)該不成問題。PCR產(chǎn)物， 由于濃度較低，并不難切，只是在連接轉(zhuǎn)化時難以成功。BamH I 一般加CGGGATCCCG的酶切效率 高達90%。其它酶的具體情況可以查NEW ENGLAND BioLabs的目錄。

19、按new england biolab 的介紹，hindIII切割的時間較長，如果，直接切pcr產(chǎn)物再連接有時效率不高，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率低。如 果有條件的話，可以先做at克隆，再酶切。TaKaRa的產(chǎn)品目錄的A部分里有關(guān)于雙酶切所用buffer 的詳細(xì)說明，最好依照執(zhí)行。PCR反應(yīng)后，是否可以直接用來酶切，而不需要從凝膠上回收后再酶切！酶切后直接在4%瓊脂糖凝膠上 電泳分型，有四種片段91, 83, 72, 48BP,想用凝膠電泳對其六種表現(xiàn)型分型，不知可行否？ 參考見解：理論上是可行的但是主要取決于PCR產(chǎn)物與酶切產(chǎn)物的大小差距，差距太小不容易獲得很純 的片斷，為什么不在酶切后連在載體質(zhì)粒上呢，

20、再篩選陽性克隆，是否作表達？至于看六種表型建議用 PAGE膠電泳做SSCP，用銀染分辨率高，可能能解決問題。PCR產(chǎn)物經(jīng)過酶切連接到載體上，所用酶切位點是（BamHI,EcoRI）均有8個保護堿基。但是無論怎 么切，總是連接不上？什么原因？ 參考見解：1、PCR產(chǎn)物是否經(jīng)過純化了？ PCR產(chǎn)物中有較高的離子強度，會影響酶切，如果不經(jīng)過純化，則酶切 體系中的PCR產(chǎn)物應(yīng)該適當(dāng)減少。2、vector是T-vector還是其他的，如果是其他的話，那要考慮vector在酶切時，是否是切完全了的， 將PCR產(chǎn)物測序，看是否有要的酶切site.3、雖說有這么多的保護堿基，假設(shè)它們對酶切足夠的，但也要遵循其

21、它的條件，如這兩個酶在做雙酶切 時，是否用了它們能通用的緩沖液？也就是說這兩種在這種緩沖液中必須要有足夠的酶切效率。有兩種方 法可以上試：（1）分兩次酶切。即先用一種酶切，膠回收后再用另一種酶切。這種方法保證了在各自的 酶切緩沖液中都得到了最大的酶切效率。（2）克隆到T載體中。不知道加的是什么保護堿基，是不是有 足夠的保護作用？克隆到T載體中，則不要考慮受這個條件的限制。4、按照NEB公司推薦的保護堿基經(jīng)驗，BamH1和EcoRI前加CG就夠了，用不著加那么多。當(dāng)然， 加那么多不大會是試驗失敗的原因。5、BamH1和EcoRI都是甘油濃度敏感型的，就是說酶量加的太多了會引起Star活性。不知你

22、的酶 切體系如何設(shè)定的。6、先檢查設(shè)計引物設(shè)計中酶切位點是否正確，然后再重復(fù)一次。當(dāng)然先連到T載體是萬無一失，但是克 隆周期也延長了。加了保護堿基，卻切不動？參考見解：1、酶切緩沖液。每種酶都有公司提供的最佳緩沖液，它們的差別只是離子濃度與體系的不同，如Na、 k、Mg等，還有PH值及緩沖體系（一般Tris-HCl），另外酶加甘油和DTT作為保護劑。在雙酶切的 時候常會遇到兩種酶有各自的緩沖液，要達到高酶切效率，選擇是個問題，如果酶切時間和量足夠，解決的方法：1）使用其中一個酶的緩沖液，但要考慮到另一酶的反應(yīng)效率，反應(yīng)效率如何，可以查查酶在不同buffer 里的效率參數(shù)，具體見公司網(wǎng)站，如NE

23、B提供了很好的buffer參數(shù)：2）使用它們的通用的緩沖液，使兩種酶在同一緩沖液里達到也足夠的酶切效率；沒有通用的BUFFER 怎么辦呢？分兩次酶切。即先用一種酶切，膠回收后再用另一種酶切。一般先低鹽后高鹽，這種方法保 證了在各自的酶切緩沖液中都得到最大的酶切效率，但缺點是要回收，損失大；3）克隆到T載體中，值得推薦的方法，克隆到T載體中，不須要考慮受這個條件的限制，酶切位點也可 以用T載體上自帶的。2、酶切溫度。酶切溫度也很重要，一般的酶切最適溫度為37度，有些特殊的酶的反應(yīng)溫度不同，如 Sma I為30度。雙酶切時這種情況下最好分開切，先低溫后高溫。3、酶切時間。酶切時間直接影響到酶切是否

24、完全，一般為1-3h，這個時間已經(jīng)足夠，對于一些活性較 好的酶，30min就可以酶切完全，建議在酶切1h后取5ul跑電泳以鑒定酶切效率；PCR產(chǎn)物的酶切時 間較長，一般過夜。4、酶失活。如果使用酶解凍后放置太久，可能導(dǎo)致酶失活。這種情況較少見，只能換新酶。如果拿了不 同公司的酶，buffer也不一樣，怎么辦？放心，可以用不同公司的酶進行雙酶切，一般不會有問題的。 可以先查查NEB的酶在不同緩沖液中的活性百分比，選擇它們都有適中活性的buffer，每個公司生產(chǎn)的酶反應(yīng)緩沖液針對特定內(nèi)切酶是最合適的！5、酶切體系。選用多大的酶切體系取決于你的樣品濃度，在雙酶切的時候為了得到質(zhì)量高的電泳圖，尤 其插

25、入的是小片段DNA，酶切后產(chǎn)物量較少，可以增加酶切重組DNA的量和增加上樣量，建議酶切前 測定一下DNA濃度或跑電泳看看DNA有多濃，做到心中有數(shù)。要將目的片段插進載體，選擇的酶切位點是Xho1和EcoR1,但是這兩個位點共用一個堿基G，即 CTCGAGAATTC。還有一對位點是Xba1和Sal1，中間沒有空，即TCTAGAGTCGAG。請問這兩種 情況能不能切開，或是只能通過單酶切來實現(xiàn)？參考見解：1、還是有可能切開的，雙酶切不行就分開切試試。再不行，又實在想用這個載體的話，可以變通一下。設(shè)計一個短片段DNA，兩頭帶EcoR I的粘性末端，與EcoR I酶切后的載體連接，獲得新的載體，以 后

26、再做就不會遇到這個問題了。2、可以先接上一個片段，再做兩次單酶切。例如：載體用BamH I切開，連上兩端都是BamH I末端的一個片段用EcoR I酶切，回收后再用BamH I切。3、先用BamH I和EcoR I同時雙酶切試試。不行的話，就先用BamH I酶切再用EcoR I酶切。怎么才能鑒定質(zhì)粒有沒有被雙酶切？參考見解：酶切后作個質(zhì)粒自連實驗，在感受態(tài)、連接酶等沒問題的情況下，如果沒有菌落長出，說明雙 酶切是成功的。當(dāng)然，如果只長了很少的菌落，也是可以的。如果長了很多的菌落，那說明酶切不完全， 這時候就只有一個酶切位點切開了，質(zhì)粒發(fā)生了自連。目的片段連pET32a，16度過夜，酶連體系為目

27、的片段5叫載體3pl,T4連接酶1叫10*Buffer1pl. 轉(zhuǎn)化后涂LBAMP平板，過夜平板長有菌落，但菌落不大，都很孤立，挑取菌落于LB-AMP液體搖菌 過夜，試劑盒提取質(zhì)粒后電泳一片彌散，無目的條帶，這是哪個步驟出問題了？參考見解：1、覺得是連接體系可能有問題，目的基因并沒有跟載體連上，之所以長菌是由于AMP抗性的篩選壓力不夠，長了雜菌。2、連接體系可能還需要再考慮，首先是目的片斷與載體應(yīng)該是摩爾數(shù)之比為3： 16： 1；其次轉(zhuǎn)化是 否也存在問題？即使是空質(zhì)粒也是有條帶的。還有可以在轉(zhuǎn)化質(zhì)粒時，以空質(zhì)粒為對照這樣來比較。電泳了純化后的目的片段和載體都有，但載體沒目的片段亮，酶連時是不是

28、需要測核酸濃度后再算體積 比？參考見解：必須計算濃度來估計：質(zhì)粒加DNA濃度計算：質(zhì)粒 PCR產(chǎn)物電泳后濃度(OD值)A(18) B(14)相對分子量 C (7300) D(100)摩爾濃度A/C B/D體積比x yx.a/c/(y.b/d)=1/3=x/y=bc/3ad(x+y=12Ul,水為 12ul)x/y=16/1,x+y=12x=16ul,y=1ulhPerllpl 1plPGBKT7 16/ 16plT4 ligase?1，混勻10*t4 ligase 2ul水 12ul載體用CIAP,37度處理30分鐘后，用連接酶自連，轉(zhuǎn)化一個克隆沒有，同時用處理過的載體與100bp的 外源片段

29、連接，轉(zhuǎn)化后也一個克隆都不長.載體和目的片段的摩爾比在1:10。陽性對照長的也很好,該怎么 辦？參考見解：1、片斷回收后電泳驗證；如果外源片斷是切膠回收，一定要在長波下操作2、載體與目的片段的摩爾比應(yīng)該是1:1,質(zhì)量比可以在1:3-10,多做幾個梯度，不可能什么都不長的。3、插入片斷要求酶切好，很多時候是酶切不完全而根本不能連接。比例是載體：目的片段=1： 2到1： 3之間。很容易連上。需要做PCR-based siRNA，其中的質(zhì)粒模板不夠，所以做轉(zhuǎn)化擴增后再抽提質(zhì)粒。做了 3次轉(zhuǎn)化都出 不來，總結(jié)問題如下：質(zhì)粒是以前抽提過的，濃度很大，但沒有做過電泳，直接加1ul轉(zhuǎn)的感受態(tài)制備好的，在冰上

30、直接化開作的。3直接用分子克隆上的方法，100ul感受態(tài)+1ul質(zhì)粒 冰上30min,42度熱激90se c,冰上2min, 加LB復(fù)蘇150rpm 45min,涂Amp板100ul, 16h，但是只有第3次長了 1各菌落，懷疑沒有轉(zhuǎn) 好長得雜菌。請問這里有什么問題，有哪些要改進的？參考見解：感受態(tài)保存時間不要太長，最好3個月以內(nèi)，保存負(fù)70度，時間長效率會降低的。如果合適，可以用藍白篩選陽性菌落，X-GAL和IPTG是40： 7,蘭色為陰性，白色陽性保存正確的溫度最少是-20C,般長期保存需要放置-70C,就算是-70C保存，一般經(jīng)過3個月以上后， 質(zhì)粒會降解非常大.在做轉(zhuǎn)化之前一定是先要鑒

31、定質(zhì)粒的濃度和質(zhì)量的.如果有條件可以利用儀器測試濃度, 簡單的辦法就是取一定量(根據(jù)質(zhì)粒濃度決定)進行電泳,然后和marker比較,來測定濃度。轉(zhuǎn)化過程中的溫度非常重要，特別是42C這步,都精確到考慮Ep管管壁厚薄的影響.關(guān)于只有第3次長了 1各菌落，懷疑沒有轉(zhuǎn)好長得雜菌?！笔紫?16h是不夠的,最少也要觀察48h, 因為轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒的細(xì)菌不比正常細(xì)菌，受了傷長得很慢而且數(shù)量不會很多,有56個菌落就是非常好的現(xiàn) 象.就算長了一個菌落可以挑出來搖搖看，也許就是需要的。底物DNA沒有被所用限制酶切斷，怎么辦？參考見解：底物DNA沒有被所用限制酶切斷，可以考慮以下幾種情況：1、底物DNA上沒有該限制酶

32、的識別、切斷位點。特別是一些經(jīng)過重組等處理的DNA，堿基易發(fā)生缺 失、變化等。2、限制酶識別位點上的A或C被甲基化。部分限制酶對識別位點中的堿基是否被甲基化比較敏感，從 而無法切斷該位點。有關(guān)甲基化對限制酶的酶切反應(yīng)的影響，3、底物不純。如果底物DNA中含有限制酶阻害物質(zhì)，會影響限制酶的酶切作用。在此種情況下，底物 DNA須重新進行純化。4、限制酶的識別、切斷位點在底物DNA的高級構(gòu)造中所處的位置，對酶切反應(yīng)也有一定的影響。5、測定Sac?II酶是否失活，可用確定帶該酶的一個底物，做個酶切驗證就行。請問感受態(tài)細(xì)胞里自身沒有質(zhì)粒嗎？感受態(tài)細(xì)胞里自身染色體上有轉(zhuǎn)座子對導(dǎo)入的DNA有影響嗎？ 參考見

33、解：1、感受態(tài)細(xì)胞自身有沒有質(zhì)粒同制備感受態(tài)之前的細(xì)胞有關(guān)，在制備感受態(tài)細(xì)胞的過程中，不會對細(xì)胞 自身的質(zhì)粒造成什么影響。2、感受態(tài)細(xì)胞里自身染色體上有轉(zhuǎn)座子對導(dǎo)入的DNA不會有影響，轉(zhuǎn)座子也會插入到導(dǎo)入的質(zhì)粒上， 可能因為發(fā)生的頻率比較低，所以不考慮。實驗需用PZero T載體，該載體需用高轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞(=1*108cfu/ug DNA)進行轉(zhuǎn)化反 應(yīng)，請問哪種感受態(tài)細(xì)胞是高轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞？參考見解：其實DH10B，DH5a，TOPl 0都可以，關(guān)鍵不是看用什么細(xì)胞，而是用什么方法制 備感受態(tài)細(xì)胞，一般電轉(zhuǎn)化都輕松可以達到5 *10A9cfu/ug DNA以上.C aCL2處理一般都是5 *106cfu/ug DNA-5 *10A7cfu/ug。買回來的菌種均為感受態(tài)細(xì)胞，能否將它們象菌種一樣制備感受態(tài)細(xì)胞，有沒有影響？參考見解：1、保存這樣的菌種，不如將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進去后，再保留有重組質(zhì)粒的細(xì)菌，加入等量的30%甘油后，可 以長期保存。如果直接將感受態(tài)細(xì)菌接種，肯定喪失了攝取外源基因的能力，但可以用來重新制備感受態(tài) 細(xì)胞。如果加入甘油后保存在-70度冰箱內(nèi)，