第11部分動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)教學(xué)內(nèi)容教學(xué)課件

1、第11部分動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)教學(xué)內(nèi)容教學(xué)課件第十一章 動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)本章內(nèi)容提要 在生物技術(shù)中，人們已廣泛地圍繞著細(xì)菌、酵母、絲狀真菌等微生物的大量培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)各種酶、抗生素、蛋白質(zhì)等產(chǎn)物。然而，許多有重要價(jià)值的蛋白質(zhì)等生物物質(zhì)，必須借助于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)來(lái)獲得，例如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等，如表11-1所示的是一些已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化和正在研究開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品。 大規(guī)模的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)開(kāi)始于本世紀(jì)50年代，經(jīng)過(guò)多年來(lái)的研究，人類(lèi)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了大量的研究開(kāi)發(fā)，取得了很大的進(jìn)展。盡管如此，目前的技術(shù)水平還遠(yuǎn)不能滿足細(xì)胞生物產(chǎn)品研究和生產(chǎn)的要求，隨著動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用日趨廣泛，已顯示出很廣闊

2、的發(fā)展前景。 目前由動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物包括哪幾類(lèi)？請(qǐng)分別列舉出2-3個(gè)產(chǎn)物。 問(wèn)題表11-1 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物 疫苗人小兒麻痹癥疫苗、狂犬疫苗、風(fēng)疹疫苗、腦炎疫苗、皰疹疫苗等動(dòng)物牛病毒性腹瀉疫苗、牛痢疾疫苗、犬傳染性肝炎疫苗、雞痘病疫苗、豬霍亂疫苗、牛疫狂犬疫苗、草魚(yú)出血熱疫苗單克隆抗體IgG、IgM、IgA等免疫調(diào)節(jié)劑-細(xì)胞生長(zhǎng)因子、干擾素、白細(xì)胞活化因子、血清胸腺因子、白細(xì)胞介素、胸腺素、巨噬細(xì)胞毒力因子等酶尿激酶、天門(mén)冬氨酰胺酶、膠原酶、細(xì)胞色素P、450、纖維蛋白溶酶原激活劑、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酷氨酸脫羥酶等激素絨膜促性腺激素、促紅細(xì)胞生成素、促濾泡激素、生長(zhǎng)激素、促間質(zhì)細(xì)胞激素、

3、促黃體激素等補(bǔ)充內(nèi)容（一）單克隆抗體 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有一套復(fù)雜的防御系統(tǒng)保護(hù)自己不受有毒物質(zhì)和病原物的侵害，其中一部分防御反應(yīng)就是淋巴細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異的蛋白，這些蛋白可以在其他免疫系統(tǒng)蛋白的幫助下與外來(lái)物質(zhì)結(jié)合，并抵消其生物學(xué)功能。這些特異的蛋白，就是抗體；相對(duì)于抗體，誘發(fā)產(chǎn)生抗體的外來(lái)物質(zhì)即稱(chēng)為抗原。 抗體最早是由德國(guó)微生物學(xué)家貝林發(fā)現(xiàn)的，它們存在于人和脊椎動(dòng)物的血清之中，是這些生物體內(nèi)免疫系統(tǒng)的重要組成成分。由于抗體分子具有極其精確的結(jié)合特異性，可以識(shí)別各種不同的抗原，還可以激活細(xì)胞的其他防衛(wèi)系統(tǒng)以消滅抗原，因此抗體在基礎(chǔ)研究和臨床診斷中獲得了廣泛的重視和應(yīng)用。隨著雜交瘤技術(shù)、蛋白質(zhì)工程

4、和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等技術(shù)的發(fā)展，抗體已逐步在疾病治療等應(yīng)用領(lǐng)域顯示出越來(lái)越廣闊的應(yīng)用前景?？贵w 由B細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白，它能識(shí)別抗原的某一特定位點(diǎn)。抗體分子由兩個(gè)完全相同的重鏈分子以及兩個(gè)完全相同的輕鏈分子組成。存在于人或哺乳動(dòng)物的血清之中?？乖?指誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的物質(zhì)。 如前所述，抗體分子是免疫系統(tǒng)反應(yīng)的一個(gè)重要組分，因?yàn)榭贵w分子可以識(shí)別各種不同的外來(lái)抗原，同時(shí)可激活宿主的防衛(wèi)系統(tǒng)。 對(duì)于一個(gè)免疫刺激（有毒物質(zhì)或病原物侵入，即抗原），每一個(gè)淋巴細(xì)胞都會(huì)合成并分泌一種單個(gè)的抗體，這些抗體可以高度特異地識(shí)別免疫抗原的特定區(qū)域，也就是抗原決定簇。由于一個(gè)抗原通常都有幾個(gè)不同的抗原決定簇，因此每個(gè)免疫淋巴

5、細(xì)胞都可能產(chǎn)生一種針對(duì)某一個(gè)抗原決定簇的抗體，這些由同一抗原而產(chǎn)生的不同的抗體統(tǒng)稱(chēng)為多克隆抗體。有毒物質(zhì)或病原物侵入，即抗原侵入抗體2抗體1 于是，人們認(rèn)識(shí)到要把抗體應(yīng)用于臨床診斷或是治療，必須要制備單一類(lèi)型的只對(duì)某一特定抗原決定簇的抗體分子，也就是單克隆抗體。多克隆抗體 在一個(gè)血清樣品中包含了對(duì)同一抗原分子上不同抗原決定簇的多種抗體。單克隆抗體 由雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的針對(duì)某一特定抗原決定簇的單一類(lèi)型的抗體。補(bǔ)充內(nèi)容（二）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)步驟 培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞一般可按以下步驟進(jìn)行： 無(wú)菌取出目的細(xì)胞所在組織，用培養(yǎng)液漂洗干凈 以鋒利無(wú)菌刀具割舍多余部分，切成小組織塊 將小組織塊置解離液離散細(xì)胞。解離液含

6、蛋白酶類(lèi)，無(wú)鈣、鎂離子 低速離心洗滌細(xì)胞后，將目的細(xì)胞吸移培養(yǎng)瓶培養(yǎng) 一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基 1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境 動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖和代謝等生理性質(zhì)在很大程度上受到各種環(huán)境因素的影響。為了使動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)處于最佳狀態(tài)，了解環(huán)境因素對(duì)其影響無(wú)疑是很重要的，影響動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖的環(huán)境因素很多，主要有溫度、PH值、營(yíng)養(yǎng)成分、溶氧、氣體環(huán)境、滲透壓以及其他因素。 溫 度 細(xì)胞在體外生存的基本條件之一，來(lái)源不同的動(dòng)物細(xì)胞，其最適的生長(zhǎng)溫度是不盡相同的，例如昆蟲(chóng)細(xì)胞的最適溫度是25-28，人和哺乳動(dòng)物的細(xì)胞的最適溫度是37.細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比，高于最適溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝和生長(zhǎng)將會(huì)受到影響，

7、甚至導(dǎo)致死亡?？偟膩?lái)說(shuō)，動(dòng)物細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力比對(duì)高溫的耐受力強(qiáng)，如溫度升至45時(shí)，1h內(nèi)人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞將被殺死；相反，降低細(xì)胞置于25-35時(shí)，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，但速度減慢，并維持長(zhǎng)時(shí)間不死，甚至于放在4，數(shù)小時(shí)后再置于37培養(yǎng)，細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)。 PH 值 合適的PH值是細(xì)胞生存的必要的條件之一。動(dòng)物細(xì)胞合適的PH值一般在，低于6.8或高于7.6時(shí)都對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利的影響，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞退變或死亡。不同的細(xì)胞對(duì)PH值也有不同的要求，原代培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)PH值的變化耐受性差，傳代細(xì)胞對(duì)PH值變化的耐受性較強(qiáng)。而對(duì)于同一種細(xì)胞，增長(zhǎng)期和維持期的最適PH也不盡相同，對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，偏堿性環(huán)境比酸性環(huán)

8、境更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。 營(yíng)養(yǎng)成分 細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖以及產(chǎn)物的合成都必須從環(huán)境中攝取各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以合成細(xì)胞物質(zhì)及在新陳代謝中起調(diào)節(jié)作用。這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括碳源、氮源、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、生長(zhǎng)因子等。 溶氧及氣體環(huán)境（P205）滲透壓等其它因素（P205）1、影響動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖的環(huán)境因素有哪些？問(wèn)題2、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)合適的PH值為多少？2、培養(yǎng)基的組成 培養(yǎng)基是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的基本溶液，是組織細(xì)胞培養(yǎng)最重要的條件。用于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基可以分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基兩 大類(lèi)。 天然培養(yǎng)基是使用最早、最為有效的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，它主要取自于動(dòng)物體液或從動(dòng)物組織分離提取而得，其優(yōu)點(diǎn)是營(yíng)養(yǎng)成

9、分豐富、培養(yǎng)效果良好；缺點(diǎn)是成分復(fù)雜、個(gè)體差異大、來(lái)源有限。 天然培養(yǎng)基的種類(lèi)有很多，包括生物性液體（如血清）、組織浸出液（如胚胎浸出液）、凝固劑（如血漿）等。3、溶氧濃度過(guò)高過(guò)低對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有何影響？4、細(xì)胞代謝產(chǎn)物CO2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有何作用？1、天然培養(yǎng)基有哪些？它有何優(yōu)缺點(diǎn)？問(wèn)題2、血清和血漿分別如何取得？ 血液組成：紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和血漿。高速離心，分三層：上層為血漿40%多。 血漿冷凍到-30度，離心，分層：上層為血清，下層為雜蛋白（少）。3、最廣泛使用的血清是什么動(dòng)物血清？它有何營(yíng)養(yǎng)成分？血漿 組織浸出液血清 組織細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的天然培養(yǎng)基是血清，這是因?yàn)檠逯泻邪ù蠓肿拥?/p>

10、蛋白質(zhì)和核酸等豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖、粘附及中和某些物質(zhì)的毒性起著一定的作用。用于組織細(xì)胞培養(yǎng)的血清的種類(lèi)很多，其來(lái)源主要?jiǎng)游?，有小牛血清、胎牛血清、馬血清、兔血清以及人血清等，最廣泛使用的是小牛血清和胎牛血清。優(yōu)質(zhì)的血清外觀應(yīng)為透明、無(wú)溶血、淡黃色、無(wú)沉淀物。 血漿不僅可用來(lái)支持培養(yǎng)組織塊，而且還供給細(xì)胞生物匠營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但由于血漿很容易發(fā)生液人經(jīng)，目前已很少單獨(dú)使用。一般使用的是禽類(lèi)血漿。 組織浸出液常用的是胚胎浸出液（如雞胚浸出液），它的主要成分含有大分子核蛋白和小分子的氨基酸，有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。 水解乳蛋白 水解乳蛋白是常用的一種天然培養(yǎng)基，是由乳白蛋白經(jīng)水解而制得，氨基

11、酸的含量較高。一般配制成0.5%的溶液，或與合成培養(yǎng)基以1：1共同使用。 合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞體內(nèi)生存環(huán)境中各種已知物質(zhì)在體外人工條件的模擬，經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)篩選、強(qiáng)化和重新組合后形成的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基在很多方面有天然培養(yǎng)基所無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，它既能經(jīng)細(xì)胞提供一個(gè)近似于體內(nèi)的生存環(huán)境，又便于控制和提供標(biāo)準(zhǔn)化體外生存環(huán)境。 目前所有的細(xì)胞培養(yǎng)都已采用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)、組成和含量都相對(duì)固定的各種合成培養(yǎng)基，并已有配制好的干粉型商品。盡管現(xiàn)在的合成培養(yǎng)基成分和含量已經(jīng)較為復(fù)雜，但仍然不能完全滿足體外培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的需要，合成培養(yǎng)基中還是需要加入一定量的天然培養(yǎng)基予以補(bǔ)充。合成培養(yǎng)

12、基中一般都有哪些營(yíng)養(yǎng)成分？問(wèn)題3、常用的合成培養(yǎng)基 目前合成培養(yǎng)基的種類(lèi)已有數(shù)十種，大多數(shù)培養(yǎng)基都是為適應(yīng)某種組織細(xì)胞的生長(zhǎng)而在某種合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改良而來(lái)的。目前較為常用的有199培養(yǎng)液、 Eagle (MEM、DMEM)培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液、HAM培養(yǎng)液等。表11-2為常用的培養(yǎng)基的成分和配方。 1、目前較常用的合成培養(yǎng)基有哪些？問(wèn)題2、為什么在要求較高的基礎(chǔ)性研究中要用無(wú)血清培養(yǎng)液？3、無(wú)血清培養(yǎng)液由哪兩部分組成？P208表11-4 微生物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞性質(zhì)的比較性質(zhì) 微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞大小1-10m10-100m代謝調(diào)節(jié)方式內(nèi)部?jī)?nèi)部和激素營(yíng)養(yǎng)要求寬松，可利用多種底物苛刻生長(zhǎng)

13、速率倍增時(shí)間一般為0.5-2h倍增時(shí)間一般為12-60h機(jī)械強(qiáng)度較好很差，缺乏保護(hù)性細(xì)胞壁環(huán)境適應(yīng)好 差 二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法 所謂動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是將動(dòng)物組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，分散成單個(gè)細(xì)胞，給予必要的生長(zhǎng)條件，模擬體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，使其在體外繼續(xù)生長(zhǎng)和繁殖。表11-4，表11-5是微生物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞性質(zhì)和培養(yǎng)方法的比較。表11-5 微生物和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法的比較微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞PH控制添加酸、堿CO2-HCO3緩沖液攪拌速度速度快、范圍廣較慢溶氧控制改變攪拌速度、通氣量、進(jìn)氣氧濃度改變進(jìn)入氣體的氧濃度培養(yǎng)基滅菌方法高溫蒸煮過(guò)濾培養(yǎng)時(shí)間幾小時(shí)幾天幾天3、4周對(duì)水純度的要求較低很高 與微生物細(xì)胞培

14、養(yǎng)類(lèi)似，動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)有兩種類(lèi)型：一類(lèi)是非貼壁依賴性細(xì)胞，這類(lèi)細(xì)胞可以采用與微生物培養(yǎng)類(lèi)似的方法進(jìn)行懸浮培養(yǎng)；另一類(lèi)是貼壁依賴性細(xì)胞，它們需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面上生長(zhǎng)。 1、懸浮培養(yǎng) P209 1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)有哪三種類(lèi)型？提問(wèn)1、懸浮培養(yǎng)是用培養(yǎng)哪一類(lèi)細(xì)胞的？問(wèn)題2、懸浮培養(yǎng)有何優(yōu)缺點(diǎn)？2、貼壁培養(yǎng) 貼壁指必須貼附在固體介質(zhì)表面上生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)，主要用于非淋巴組織和許多單倍體等貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)。由于大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于貼壁依賴性細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的一種重要方法。 在貼壁培養(yǎng)過(guò)程中，貼壁依賴性細(xì)胞需要附著在帶適量正電荷或半固體的表面上，原來(lái)是圓形的細(xì)胞一經(jīng)貼

15、壁就迅速鋪展開(kāi)來(lái)，然后開(kāi)始有絲分裂，并很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。一般可在數(shù)天后鋪滿生長(zhǎng)表面，形成致密的細(xì)胞單層。 在貼壁培養(yǎng)依賴性細(xì)胞中，請(qǐng)比較滾瓶培養(yǎng)系統(tǒng)和微載體培養(yǎng)系統(tǒng)？問(wèn)題 細(xì)胞貼壁一般分為貼壁因子吸附于培養(yǎng)表面、細(xì)胞與表面接觸、細(xì)胞貼壁于培養(yǎng)表面和貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)表面上擴(kuò)展等幾個(gè)步驟。圖11-1為細(xì)胞在培養(yǎng)表面貼壁過(guò)程示意圖。 3、固定化培養(yǎng) 固定化培養(yǎng)是既適用于貼壁依賴性細(xì)胞，又適用于非貼壁依賴性細(xì)胞的包埋培養(yǎng)方式，具有細(xì)胞生長(zhǎng)密度高、抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。 由于所培養(yǎng)的細(xì)胞的不同，固定化培養(yǎng)的方式也有不同，一般對(duì)于貼壁依賴性細(xì)胞通常采用膠原包埋，而對(duì)于非貼壁依賴性細(xì)胞則常用海藻酸鈣

16、包埋。 常用的細(xì)胞固定化的方法主要有吸附、共價(jià)貼附、離子/共價(jià)交聯(lián)、包埋和微囊化等。三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器 自70年代以來(lái)，用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的生長(zhǎng)反應(yīng)器有了很大的發(fā)展，種類(lèi)越來(lái)越多，規(guī)模也越來(lái)越大。根據(jù)生物反應(yīng)器的不同用途，有懸浮培養(yǎng)用、貼壁培養(yǎng)用、包埋培養(yǎng)用生物反應(yīng)器等，其種類(lèi)大致上有塑料增殖器、填充床增殖器、多層板增殖器、螺旋增殖器、管式螺旋增殖器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀增殖器、流化床反應(yīng)器、中空纖維及其他膜式反應(yīng)器、槳式攪拌反應(yīng)器、棒式攪拌反應(yīng)器、船舶推進(jìn)槳反應(yīng)器、傾斜槳葉攪拌反應(yīng)器、般帆形攪拌反應(yīng)器、往復(fù)振動(dòng)錐孔篩板攪拌反應(yīng)器、籠式通氣攪拌反應(yīng)器、雙層籠式通氣攪拌反應(yīng)器、空氣提升式反應(yīng)

17、器等。1、氣升式細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器 氣升式反應(yīng)器的基本原理如圖11-2所示。氣體混合物從底部的噴射管進(jìn)入反應(yīng)器的中央導(dǎo)流管使得中央導(dǎo)流管側(cè)的液體密度低于外部區(qū)域從而形成循環(huán)。氣升式生物反應(yīng)器主要采用內(nèi)循環(huán)式，但也有采用外循環(huán)式。 與攪拌式生長(zhǎng)反應(yīng)器相比，氣升式生物反應(yīng)器產(chǎn)生的湍流溫和而均勻，剪切力相當(dāng)小，反應(yīng)器內(nèi)沒(méi)有機(jī)械運(yùn)動(dòng)部件，因而細(xì)胞損傷率比較低；同時(shí)由于采用直接噴射空氣供氧，氧傳遞速率高；液體循環(huán)量大，能使細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)成分均勻地分布于培養(yǎng)基中。 表11-9列出了八種細(xì)胞的有關(guān)培養(yǎng)數(shù)據(jù)，可以看出同傳統(tǒng)的方法（培養(yǎng)瓶和滾瓶）相比，氣升反應(yīng)器的抗體產(chǎn)量平均提高4.6倍。 在氣升式生物反應(yīng)器中，溶

18、氧的控制可以通過(guò)自動(dòng)調(diào)節(jié)進(jìn)入空氣的速率來(lái)實(shí)現(xiàn)；PH值可通過(guò)在進(jìn)氣中加入二氧化碳或加入氫氧化鈉來(lái)控制。 優(yōu)點(diǎn)請(qǐng)畫(huà)出氣升式反應(yīng)器的簡(jiǎn)圖，并說(shuō)說(shuō)溶氧濃度和PH值是如何控制的？問(wèn)題表11-9 氣升式反應(yīng)器和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的抗體產(chǎn)率比較 細(xì)胞系抗體類(lèi)型抗體產(chǎn)量，mm/l氣升式/傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶滾瓶氣升式1IgG1420865.12IgM701272953.03IgG910737.74IgG28301003.45IgG60762603.86IgM20251125.07IgG30382005.98IgG1201003503.2圖11-3 中空纖維反應(yīng)器示意圖細(xì)胞培養(yǎng)基入口培養(yǎng)基出口2、中空纖維管生物反應(yīng)器 中空纖維

19、管生物反應(yīng)器如圖11-3所示，它的用途較廣，既可培養(yǎng)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞，細(xì)胞的密度最高可達(dá)109/ml數(shù)量級(jí)。如果控制系統(tǒng)不受污染，能長(zhǎng)期運(yùn)轉(zhuǎn)。已用這種反應(yīng)器培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞型和生產(chǎn)的分泌產(chǎn)物如表11-10所示。 生長(zhǎng)的細(xì)胞型雜交瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、乳腺組織細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、垂體腫瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞、BHK-2細(xì)胞、肺細(xì)胞等分泌的產(chǎn)物IgG、IgM、IgA、干擾素、激素、尿激酶、蛋白質(zhì)C、病毒蛋白、乙型肝炎表面抗原、T抑制因子、促細(xì)胞生長(zhǎng)素、白細(xì)胞介素等空氣與CO2出口空氣與CO2入口 中空纖維管生物反應(yīng)器已進(jìn)入工業(yè)生產(chǎn)，主要用

20、于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。（重點(diǎn)掌握） 3、通氣攪拌反應(yīng)器通氣攪拌反應(yīng)器有哪些型式？問(wèn)題4、流化床生物反應(yīng)器 流化床生物反應(yīng)器的基本原理類(lèi)似于流態(tài)床化學(xué)反應(yīng)器，不同的是，流態(tài)化的固體是帶有細(xì)胞的微粒。培養(yǎng)液通過(guò)反應(yīng)器垂直向上循環(huán)流動(dòng)不斷提供給細(xì)胞必要的營(yíng)養(yǎng)成分，使細(xì)胞得以在微粒中生長(zhǎng)；同時(shí)，不斷地加入新鮮的培養(yǎng)液，并不斷地排除培養(yǎng)產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物。圖11-7為生產(chǎn)用CF-IMMOTM流化床生物反應(yīng)器的示意圖，這種反應(yīng)器的傳質(zhì)性能很好，并在循環(huán)系統(tǒng)中采用膜氣體交換器，能快速提供給高密度細(xì)胞所需的氧，同時(shí)排除代謝產(chǎn)物；反應(yīng)器中的液體流速足以使細(xì)胞微粒懸浮卻不會(huì)損壞脆弱的細(xì)胞。由于流化床生物反應(yīng)

21、器滿足了高密度細(xì)胞培養(yǎng)、使高產(chǎn)量細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間停留在所應(yīng)器中、優(yōu)化細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成的環(huán)境等細(xì)胞培養(yǎng)的要求，流化床生物反應(yīng)器既可用于貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)。表11-11為流化床生物反應(yīng)器達(dá)到的細(xì)胞密度。 氣體交換氧氣回流收獲營(yíng)養(yǎng)液泵反應(yīng)塔加熱器PH傳感器TDOCO2圖11-7 生產(chǎn)用CF-IMMOTM流化床生物反應(yīng)器示意圖5、無(wú)泡沫攪拌生物反應(yīng)器（了解） 表11-11流化床生物反應(yīng)器與其它方法培養(yǎng)達(dá)到的細(xì)胞比較培養(yǎng)類(lèi)型細(xì)胞類(lèi)型細(xì)胞密度（個(gè)/ml）流化床雜交瘤0.3*108貼壁依賴性細(xì)胞1.3*108恒化器雜交瘤2*106微載體攪拌釜貼壁依賴性細(xì)胞0.2*107-2*1

22、07四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 動(dòng)物細(xì)胞無(wú)論是貼壁培養(yǎng)或是懸浮培養(yǎng)，均可分為分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式等多種培養(yǎng)方式。1、分批式培養(yǎng)定義 分批式培養(yǎng)是指先將細(xì)胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，同時(shí)產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后，終止培養(yǎng)。 在細(xì)胞分批培養(yǎng)過(guò)程中，不向培養(yǎng)系統(tǒng)補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而只向培養(yǎng)基通入氧，能夠控制的參數(shù)只有PH、溫度和通氣量，因此細(xì)胞所處的生長(zhǎng)環(huán)境隨著營(yíng)養(yǎng)物的消耗和產(chǎn)物、副產(chǎn)物的積累時(shí)刻都在發(fā)生變化，不能使細(xì)胞自始至終處于最優(yōu)的條件下，因而分批培養(yǎng)并不是一種很好的培養(yǎng)方式。分批培養(yǎng)過(guò)程的持征如圖11-8所示。0時(shí)間分批圖11-8 分批式培養(yǎng)過(guò)程的特征營(yíng)

23、養(yǎng)物廢產(chǎn)物PH、溫度、DO0培養(yǎng)時(shí)間（d）細(xì)胞密度圖11-9分批式培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期減速期平穩(wěn)期衰退期延滯期為什么說(shuō)采用分批式培養(yǎng)細(xì)胞效果不佳？問(wèn)題 細(xì)胞分批式培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線如圖11-9所示。在分批式培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞的生長(zhǎng)可分為延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期等五個(gè)階段。 2、流加式培養(yǎng)（補(bǔ)料分批式） 定義 流加式培養(yǎng)是指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適宜的條件下接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，產(chǎn)物不斷形成，而在此過(guò)程中隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，不斷地向系統(tǒng)中補(bǔ)充新的營(yíng)養(yǎng)成分，使細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)代謝，直到整個(gè)培養(yǎng)結(jié)束后取出產(chǎn)物。 流加式培養(yǎng)只是向培養(yǎng)系統(tǒng)補(bǔ)加必要的營(yíng)養(yǎng)成分，以

24、維持營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度不變。由于流加式培養(yǎng)能控制更多的環(huán)境參數(shù)（ ），使得細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成容易維持在優(yōu)化狀態(tài)。流加式培養(yǎng)有何特點(diǎn)？（P219）問(wèn)題0時(shí)間流加圖11-11 流加式培養(yǎng)過(guò)程的特征PH、溫度、DO廢產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)物 根據(jù)流加控制方式不同，有兩種流加式培養(yǎng)方式：無(wú)反饋控制流加和有反饋控制流加。無(wú)反饋控制流加包括定流量加和間斷流加等；有反饋控制流加一般是連續(xù)或間斷地測(cè)定系統(tǒng)中限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度，并以此為控制指標(biāo)來(lái)調(diào)節(jié)流加速率或流加液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度等。3、半連續(xù)式培養(yǎng) 半連續(xù)式培養(yǎng)又可稱(chēng)為反復(fù)分批式培養(yǎng)，是指在分批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，將分批培養(yǎng)的培養(yǎng)液部分取出，并重新補(bǔ)充加入等量的新鮮培養(yǎng)基，從而

25、使反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變的培養(yǎng)方式。定義4、連續(xù)式培養(yǎng) 連續(xù)式培養(yǎng)是指將細(xì)胞種子和培養(yǎng)液一起加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮的培養(yǎng)液不斷加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將反應(yīng)器液連續(xù)不斷地取出，使反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。 定義 與分批式培養(yǎng)和半連續(xù)式培養(yǎng)不同，連續(xù)式培養(yǎng)可以保持細(xì)胞所處的環(huán)境條件長(zhǎng)時(shí)間地穩(wěn)定，可以使細(xì)胞維持在優(yōu)化的狀態(tài)下，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成。由于連續(xù)式培養(yǎng)過(guò)程中連續(xù)不斷地收獲產(chǎn)物，并能提高細(xì)胞密度，在生產(chǎn)上已被應(yīng)用于培養(yǎng)非貼壁依賴性細(xì)胞。 請(qǐng)比較半連續(xù)式培養(yǎng)和連續(xù)式培養(yǎng)？問(wèn)題圖11-14 細(xì)胞灌注培養(yǎng)系統(tǒng)實(shí)例液位控制細(xì)胞懸液細(xì)胞新鮮培養(yǎng)基收液過(guò)濾器細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 動(dòng)物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)一般是采用灌注培養(yǎng)。灌注培養(yǎng)是把細(xì)胞接種后進(jìn)行培養(yǎng)，一方面連續(xù)向反應(yīng)器中注入新鮮的培養(yǎng)基，同時(shí)又連續(xù)不斷地取出等量的培養(yǎng)液，但是過(guò)程中不取出細(xì)胞，細(xì)胞仍留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種營(yíng)養(yǎng)不斷的狀態(tài)。當(dāng)高密度培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，必須確保補(bǔ)充給細(xì)胞以足夠的營(yíng)養(yǎng)以及除去有