保元排毒丸微生物限度檢查法的驗證研究

1、保元排毒丸微生物限度檢查法的驗證研究【摘要】目確實認(rèn)所采用的方法合適于供試品的微生物限度檢查。即確認(rèn)供試品在該檢驗量、該檢驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性被充分消除到可以忽略不計。方法采用2022版?中國藥典?規(guī)定的驗證方法。結(jié)果計數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確，符合要求。結(jié)論該實驗合適保元排毒丸微生物限度檢查方法的驗證。【關(guān)鍵詞】保元排毒丸微生物限度檢查方法驗證從理論上來講，每個樣品對微生物都會有影響，影響的程度有多大，檢驗方法能否保證污染的微生物可以檢驗出來，要通過試驗來驗證，才能保證微生物限度檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性，而藥品質(zhì)量監(jiān)視抽驗合格率存在不盡明晰、全面、真實的突出問題1。按照?中國藥典?2022版前規(guī)定的微生

2、物限度檢驗方法，有很多菌檢不出，這就很難保證藥品微生物限度檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，也給臨床使用帶來隱患。保元排毒丸系我院著名老中醫(yī)張志堅主任醫(yī)師長期臨床理論經(jīng)歷方。臨床用于慢性腎炎，慢性腎功能衰竭，見有頭昏乏力，神疲肢軟，尿少足腫，腰膝酸痛，納呆泛嘔，夜不能寐，面色晦暗，舌淡嫩，苔薄黃膩等病癥，臨床使用較廣，因此必須保證保元排毒丸微生物限度檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。1器材1.2培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)20220309；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，宜興市永信生物050915；pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，宜興市永信生物051027；膽鹽乳酸培養(yǎng)基，宜興市永信生物050509；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)

3、基，宜興市永信生物051206；甘露醇高鹽瓊脂，青島高科園海博生物技術(shù)20220112；溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基，宜興市永信生物050921；改進(jìn)馬丁培養(yǎng)基，宜興市永信生物050829。1.3驗證用菌株大腸埃希菌Esherihiali(B)44102，第4代；金黃色葡萄球菌Staphylusaureus(B)26003，第4代；枯草芽孢桿菌(Baillussubtilis)(B)63501，第4代；銅綠假單胞菌(Pseudnasaeruginsa)(B)10104，第3代；白色念珠菌(andidaalbians)(F)98001第4代；黑曲霉Aspergillusniger(F)98003

4、第3代。1.4供試品及試劑保元排毒丸060810，江蘇省常州市中醫(yī)醫(yī)院制劑；氯化鈉溶液，分析純。2方法2.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證22.1.1供試液制備取供試品保元排毒丸10g，加pH無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100l，于45水浴中保溫，浸泡，振蕩溶解，制成110的供試液。2.1.2菌液制備將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新穎培養(yǎng)物分別接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)2448h，分別取上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每毫升含50100個fu菌落數(shù)的菌液。將白色念珠菌的新穎培養(yǎng)物分別接種至改進(jìn)馬丁培養(yǎng)基中，置2328培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2448h，取上述培養(yǎng)物用0.9%無

5、菌氯化鈉溶液制成每毫升含50100個fu的菌液。將黑曲霉的新穎培養(yǎng)物分別接種至改進(jìn)馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，2328培養(yǎng)7d，使大量孢子產(chǎn)生。再參加5l0.9%無菌氯化鈉溶液，用無菌玻棒輕輕將孢子洗脫，然后用一支管口包有無菌棉花且能過濾菌絲的10l吸管吸出孢子液至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液將菌液稀釋至每毫升含50100個fu的菌液。2.1.3驗證方法平皿法常規(guī)法。實驗組:取10個平皿，2個一組分成5組，分別做好大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的標(biāo)記。各取110供試品保元排毒丸1l,分別參加10個平皿中，再依次參加上述5種菌的菌懸液1l(50100個fu),每株

6、菌平行制備2個平皿，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，分別置3035培養(yǎng)48h和2328培養(yǎng)72h，測定試驗組的菌數(shù)。菌液組：分別取上述稀釋的菌液1l，注入平皿內(nèi)，每個菌平行制備2個平皿，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，分別置3035培養(yǎng)48h和2328培養(yǎng)72h，測定所加的試驗菌數(shù)。供試品對照組：各取110供試液保元排毒丸1l分別注入4個平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，分別置3035培養(yǎng)48h和2328培養(yǎng)72h，以測定供試品的本底數(shù)。稀釋劑對照組：本品未采用特殊方式處理和制備，故未做。上述方法平行實驗3次。菌回收率計算：實驗組的菌回收率%=實驗組的

7、平均菌落數(shù)供試品對照組的平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)100%實驗結(jié)果：見表1。2.2控制菌檢查方法的驗證22.2.1大腸埃希菌檢查方法的驗證實驗組：取110的供試液10l，接種至100l的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基內(nèi)，參加47fu/l大腸埃希菌1l，3537培養(yǎng)1824h，取上述培養(yǎng)液0.2l接種至5lUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)5，24h，在345n紫外線下觀察，均見熒光反響，滴加靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色。陰性菌對照組：取110的供試液10l，接種至100l的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基內(nèi)，參加66fu/l金黃色葡萄球菌1l，3537培養(yǎng)1824h，取上述培養(yǎng)液0.2l接種至5lUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)5，24

8、h，在365n紫外線下觀察，均無熒光反響，滴加靛基質(zhì)試液，液面呈試劑本色。2.2.2大腸菌群檢查方法的驗證實驗組：取110的供試液1l，接種10l膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管內(nèi)，參加47fu/l的大腸埃希菌1l，置3537培養(yǎng)1824h。培養(yǎng)基出現(xiàn)混濁，產(chǎn)酸產(chǎn)氣。表1保元排毒丸細(xì)菌、霉菌和酵母菌回收率的測定平皿法略陰性菌對照組：取110的供試液1l，接種10l膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管內(nèi)，參加66fu/l的金黃色葡萄球菌1l，置3537培養(yǎng)1824h。未見產(chǎn)酸產(chǎn)氣。2.2.3沙門菌檢查方法的驗證實驗組：取10g的供試液直接接種至200l的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，參加含66fu/l金黃色葡萄球菌1l，置3537培養(yǎng)

9、1824h，取上述培養(yǎng)液1l，接種至10l四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824h，劃線接種于沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824h，平板上生長出無色，半透明，菌落中心為暗色的菌落。陰性菌對照組：取10g供試品直接接種至200l的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，混勻，參加含66fu/l金黃色葡萄球菌1l，置3537培養(yǎng)1824h，取上述培養(yǎng)液1l，接種至10l四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824h，劃線接種于沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824h，平板上無菌落生長。3討論由表1可見保元排毒丸用平皿菌落計數(shù)法，3次平行實驗中大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌落回收率都到達(dá)了70%以上，說明該方法用于細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)結(jié)果是準(zhǔn)確的?？刂凭鷻z查方法的驗證實驗說明：實驗組檢出了大腸埃希菌，乙型副傷寒沙門菌；陰性菌對照組未檢出金黃色葡萄球菌；乙型副傷寒沙門菌。說明保元排毒丸對大腸埃希菌無抑制作用，對大腸菌群無抑制作用，對沙門菌無抑制作用。本品稀釋劑對照組未作特殊方式處理和制備，對細(xì)菌無損傷，故未做驗證。在制備需測定菌落數(shù)的菌液過程中，經(jīng)過實驗探索本實驗室每種菌的稀釋級別為：金黃色葡萄球菌10-6，白色念珠菌1