第15章現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)

1、第15章現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù) 第一節(jié) 免疫微粒技術(shù) 免疫微粒技術(shù)是利用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作為載體，包被上具有特異性親和力的各種免疫活性物質(zhì)(抗原或抗體)，使其致敏為免疫微粒，用于免疫學(xué)及其他生物學(xué)檢測與分離的一項(xiàng)技術(shù)。作為載體的微粒通常是以某種高分子有機(jī)單體為原料經(jīng)過高分子聚合方法制備而成。由于制備材料及工藝不同，現(xiàn)已制成惰性微粒、活性微粒、磁性微粒及標(biāo)記微粒等四大類微粒，數(shù)量多達(dá)幾十種。將制備好的微粒與抗原(或抗體)經(jīng)物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)及生物素親合親橋聯(lián)法等方法形成免疫微粒，廣泛應(yīng)用于各種可溶性大分子物質(zhì)的檢測、分離與純化、細(xì)胞標(biāo)記與識(shí)別等。近年來，微粒技術(shù)在核酸分子雜交、DNA

2、與RNA的分離及PCR等研究領(lǐng)域亦顯示出廣闊的應(yīng)用前景。 膠乳微粒免疫檢測技術(shù) 膠乳微粒免疫檢測技術(shù)是在膠乳凝集定性試驗(yàn)基礎(chǔ)上發(fā)展建立的一種非放射性均相免疫測定法，可以對(duì)各種微量的抗原物質(zhì)和小分子半抗原進(jìn)行精確的定量測定。根據(jù)特異性抗體致敏的膠乳微粒，與待測標(biāo)本中的相應(yīng)抗原相遇時(shí)發(fā)生凝集反應(yīng)，膠乳凝集程度與被測物的濃度呈函數(shù)關(guān)系，由此可測出標(biāo)本中待測物的含量。測定方法主要有粒子計(jì)數(shù)法和濁度法兩種。 免疫磁性微粒分離與純化技術(shù) 磁性微粒(MMS) 是以金屬離子為核心，外層均勻地包裹高分子聚合體的固相微粒。在液相中，受外加磁場的吸引作用，MMS可快速沉降而自行分離，無需進(jìn)行離心沉淀。經(jīng)過特異性抗體

3、包被制成免疫M(jìn)MS，與檢樣中的抗原結(jié)合形成免疫M(jìn)MS靶分子(或靶細(xì)胞)復(fù)合體，通過外加磁場的作用即可與其他成分分離開來。再以適當(dāng)方式使復(fù)合體解離，在磁場吸引下除去游離的免疫M(jìn)MS，即可獲得純化的靶分子或細(xì)胞。 免疫微粒技術(shù) 免疫磁性分離原理示意圖細(xì)胞裂解液濃度調(diào)整免疫磁性微球吸附洗滌解離超濾凝膠過濾-2b干擾素純品 磁鐵免疫磁性微球-2b干擾素雜蛋白細(xì)胞裂解液基因工程-2b干擾素的免疫磁性分離系統(tǒng)的開發(fā)10ml干擾素裂解液 （蛋白濃度4mg/ml）20倍稀釋后加入抗體致敏的磁性微球10ml用50ml PBS洗滌3次加入甘氨酸-HCl裂解液（pH2.8）20ml超濾濃縮得純化-2b干擾素收率60

4、%，純度80%，生物學(xué)活性108 IU/mg第二節(jié) 免疫組織化學(xué)技術(shù) 免疫組織化學(xué)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測定的一項(xiàng)新技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原物質(zhì)。 免疫組化技術(shù)由免疫熒光技術(shù)逐漸發(fā)展建立起高度敏感，且更為實(shí)用的免疫酶技術(shù)。免疫組織化學(xué)的全過程包括：抗原的提取與純化；免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合；制備特異性抗體以及抗體的純化；將顯色劑與抗體結(jié)合形成標(biāo)記抗體；標(biāo)本的制備；免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)以及呈色反應(yīng)；觀察結(jié)果。

5、 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是采用熒光素標(biāo)記的已知抗體(或抗原)作為探針，對(duì)檢測待測組織、細(xì)胞標(biāo)本中的靶抗原(或抗體)，進(jìn)行定位、定性和定量的目的。免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 免疫酶技術(shù)就是用酶標(biāo)記已知抗體(或抗原)，然后與組織標(biāo)本在一定條件下反應(yīng)，如果組織中含有相應(yīng)抗原(或抗體)，抗原抗體相互結(jié)合形成的復(fù)合物中所帶酶分子遇到底物時(shí)，能催化底物水解、產(chǎn)生顯色反應(yīng)，識(shí)別出標(biāo)本抗原(抗體)分布的位置和性質(zhì)，通過圖像分析并可達(dá)到定量的目的。免疫熒光技術(shù)雖已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)的研究與診斷，為免疫病理研究開辟了一條新途徑。另外，酶顯色產(chǎn)物具有較高的電子密度，經(jīng)過適當(dāng)處理還可以進(jìn)行免疫電鏡觀察 抗體

6、與靶抗原結(jié)合之后，形成的抗原抗體復(fù)合物在顯微鏡下是不可見的，如將抗體與某種顯色劑偶聯(lián)，抗原與抗體結(jié)合形成的復(fù)合物就由不可見而成為可見，從而可以確定組織中是否存在某種抗原。 第三節(jié) 免疫電子顯微鏡技術(shù) 免疫電鏡技術(shù)(Immune electron microscopy，IEM)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與電子顯微鏡的高分辨力相結(jié)合，在亞細(xì)胞和超微結(jié)構(gòu)水平上對(duì)抗原物質(zhì)進(jìn)行定位分析的一種高度精確、靈敏的方法。特異性抗體用電子致密物質(zhì)，如鐵蛋白、膠體金等標(biāo)記后，使之與組織超薄切片中的抗原結(jié)合，在電鏡下觀察到標(biāo)記物所在位置，即為抗原抗體反應(yīng)的部位。 免疫電鏡技術(shù)常用標(biāo)記原理 I鐵蛋白標(biāo)記 鐵蛋白是一種含鐵

7、23，分子量約750kDa，直徑為1214nm的球形蛋白。其核心是由4個(gè)亞基組成的高電子密度氫氧化鐵膠態(tài)分子團(tuán)，外層由24個(gè)蛋白質(zhì)亞單位組成近似球形的外殼。在電鏡下，鐵很容易和其他粒子相區(qū)別，顯像清晰。可通過雙功能交聯(lián)劑可與抗體、SPA等共價(jià)結(jié)合；用于免疫電鏡檢測的優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記物呈顆粒狀，分辨率高。但其缺點(diǎn)是Fe的分子量太大，難以透過細(xì)胞膜和組織，只適用于細(xì)胞表面抗原定位；而且Fe染色標(biāo)本只適合電鏡檢查，不能用普通光學(xué)顯微鏡觀察。酶標(biāo)記將酶標(biāo)抗體用于免疫組化技術(shù)，以HRP標(biāo)記抗體，通過H2O2DAB底物系統(tǒng)被酶分解的呈色反應(yīng)，來顯示抗原抗體反應(yīng)部位。DAB分解產(chǎn)物為不溶性的棕色吩嗪衍生物，經(jīng)過O

8、sO4處理后變黑，具有高電子密度，十分適合于電鏡觀察。而且HRP的分子量(40kDa)比鐵蛋白(750kDa)將近小20倍，酶標(biāo)抗體較易透過經(jīng)適當(dāng)處理后的組織細(xì)胞膜，能用于定位細(xì)胞內(nèi)抗原。但酶反應(yīng)產(chǎn)物的分辨率不如顆粒性標(biāo)記物(鐵蛋白膠體金)高。 免疫電鏡技術(shù)常用標(biāo)記技術(shù) II酶標(biāo)記膠體金標(biāo)記膠體金是氯金酸(HAuCl4)的水溶膠顆粒，如同鐵蛋白一樣具有高電子密度，在電鏡比鐵蛋白顆粒更致密，易于辨認(rèn)，定位比酶反應(yīng)物精確。膠體金容易和多種大分子物質(zhì)、包括抗體、A蛋白、凝集素等結(jié)合。根據(jù)制備方法不同，可以得到直徑在3150nm之間的各種大小的膠體金顆粒；分別使用不同直徑的膠體金顆粒制備標(biāo)記物，可以在

9、同一標(biāo)本片上顯示兩種或多種抗原物質(zhì)，即所謂雙標(biāo)記或多標(biāo)記。膠體金標(biāo)記物還可代替鐵蛋白作為掃描免疫電鏡的標(biāo)記物。因此，膠體金成為當(dāng)前免疫電鏡工作者最感興趣的標(biāo)記物。免疫電鏡技術(shù)常用標(biāo)記技術(shù) III膠體金標(biāo)記凝集素標(biāo)記物 凝集素是一類從各種植物種子和動(dòng)物組織中提取的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白。因其能凝集紅細(xì)胞，故名凝集素，亦稱外源凝集素。常用的為植物凝集素有刀豆素A、麥胚凝集素、植物血激素、花生凝集素等。凝集素最大的特點(diǎn)是能識(shí)別糖蛋白和糖脂，特別是細(xì)胞膜中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞膜表面的糖基。一種凝集素具有只對(duì)某一種特異性糖基專一性結(jié)合的能力因此，凝集親可以作為研究細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的探針。另一方面，凝集素

10、具有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、酶、生物素、鐵蛋白及膠體金等結(jié)合、而不影響其生物活性，可用于光鏡或電鏡水平的免疫細(xì)胞化學(xué)研究工作。第四節(jié) 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞儀(Flow cytometer，F(xiàn)CM)能快速、精確地測量通過檢測區(qū)液流中的細(xì)胞、大分子、乳膠滴或其他粒子。流式細(xì)胞術(shù)是應(yīng)用一個(gè)激光和有關(guān)的光學(xué)檢測系統(tǒng)來收集這些信號(hào)以供分析。為免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、病理學(xué)、放射生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究提供強(qiáng)而有力的手段。FCM主要可定量分析細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原，以及對(duì)細(xì)胞分子水平的核酸含量的測量，預(yù)示各種病理狀態(tài)下細(xì)胞的生物行為。FCM是集現(xiàn)代電子物理技術(shù)、激光技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)于一身的

11、先進(jìn)科學(xué)儀器，開創(chuàng)了熒光技術(shù)的又一個(gè)嶄新的領(lǐng)域。流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分析原理：待測細(xì)胞被制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后加入樣品管中，在氣體壓力推動(dòng)下進(jìn)入流動(dòng)室。流動(dòng)室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的約束下，細(xì)胞排成單列出流動(dòng)室噴嘴口，并被鞘液包繞形成細(xì)胞液柱，進(jìn)入流動(dòng)室。被熒光染料染色的細(xì)胞受到強(qiáng)烈的激光照時(shí)后發(fā)出熒光，被熒光光電倍增管接收，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的定量分析。再通過流束形成含有細(xì)胞的帶電液滴而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的分選。 流式細(xì)胞儀第五節(jié) 免疫印跡技術(shù) 免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)，是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。該法是在凝膠電泳和固相免

12、疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。將含有目標(biāo)蛋白(抗原)的樣品首先用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)或非變性電泳(NativePAGE)等分離后，通過轉(zhuǎn)移電泳原位轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面，然后將膜表面的蛋白質(zhì)再用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異性檢測。Western blot method第六節(jié) 酶聯(lián)免疫分析技術(shù) 免疫技術(shù)為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。其基本原理是先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相裁體上，并保持其免疫活性。測定時(shí)，將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不

13、同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離成分。然后加入酶的作用底物催化顯色，進(jìn)行定性或定量測定。酶聯(lián)免疫分析的基本原理和方法類型 ELISA可用于測定抗體，也可用于檢測抗原。根據(jù)檢測目的和操作步驟不向，有以下三種類型的常用方法。 間接法 雙抗體夾心法 竟?fàn)幏ㄩg接法此法是測定抗體最常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。洗滌后，加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體(酶標(biāo)抗抗體)和底物進(jìn)行測定。 雙抗體夾心法此法常用于測定抗原。 將已知抗體吸附于固相載體加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合。溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測定。 竟?fàn)幏ù?/p>

14、法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。 以測定抗原為例將持異性抗體吸附于固相載體；加入待測抗原和一定量的酶標(biāo)已知抗原，使二者競爭與固相抗體結(jié)合；經(jīng)過洗滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測抗原含量呈負(fù)相關(guān)。 ELlSA方法的技術(shù)要點(diǎn) I與固相載體結(jié)合的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過程稱為包被(coating)，由于載體不同，包被的方法也不同。使用聚苯乙烯制品為載體一般多采用物理吸附法。除載體的理化性質(zhì)外，受緩沖液的離子強(qiáng)度、pH值、包被時(shí)的溫度和時(shí)間等多種因素的影響。用抗原或抗體包被后。固相載體表面往往尚殘留少量未飽和的吸附位點(diǎn)，產(chǎn)生非特異吸附，導(dǎo)致本底偏高。為此

15、常用15BSA，或含520小牛血清的PH9.6碳酸鹽緩沖液注滿凹孔，37作用1h，可以消除此種干擾。這一過程稱為封閉(blocking)。固相載體和免疫吸附劑的制備 ELlSA方法的技術(shù)要點(diǎn) II抗原和抗體用于制備酶標(biāo)記物和包被固相載體的抗原要求純度高，抗原性完整；抗體需特異、效價(jià)高、親和力強(qiáng)，并具有較高的比活性。如將抗體IgG用木瓜蛋白酶水解為Fab片段，再與酶連接，可以減少非特異性吸附，檢測效果更佳。McAb的應(yīng)用，進(jìn)一步提高ELISA法的特異性和靈敏度。使用針對(duì)抗原分子中不同決定簇的兩種McAb分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體用于雙位點(diǎn)夾心法，簡化了操作程序。通常采用特異性較高的McAb作為固

16、相包被抗體，與酶標(biāo)記的多克隆抗體相結(jié)合進(jìn)行檢測，結(jié)果更為滿意。 在ELISA法中，用于標(biāo)記抗體或抗原的酶與免疫酶組織化學(xué)技術(shù)基本上相同。但所用底物被酶裂解后，應(yīng)能生成可溶性有色產(chǎn)物，適合用分光光度計(jì)(酶標(biāo)儀)測量光密度值，籍以定量測定樣品中待撿抗原或抗體的含量。ELlSA方法的技術(shù)要點(diǎn) III常用的酶及其底物 辣根過氧化物酶(HRP)OPD, TMB堿性磷酸酶(AP)PNP半乳糖苷酶(Gal)NPG葡萄糖氧化酶(GOP)PAP第七節(jié) 膠體金試紙條技術(shù) 膠體金標(biāo)記技術(shù) (Immunogold labeling technique) 是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù).膠體金是由氯金酸在還原劑等作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱