腺病毒載體操作手冊1407R

1、腺病毒載體操作手冊 一、實(shí)驗(yàn)流程 制備腺病毒穿梭質(zhì)粒，分別高純度無內(nèi)毒素抽提腺病毒穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)十幾天，在中間四五天左右更換一次新鮮培養(yǎng)基，然后收集細(xì)胞和1ml培液置于15ml離心管后，液氮/37度凍融三次（凍-融要徹底），2000rpm離心5分鐘，取上清即為病毒液初代原液。連續(xù)三代反復(fù)擴(kuò)增收集病毒后，行病毒的大量擴(kuò)增，然后通過CsCl密度梯度離心-透析聯(lián)用法純化病毒。二、實(shí)驗(yàn)材料（一）腺病毒載體、包裝細(xì)胞和菌株該病毒包裝系統(tǒng)為兩質(zhì)粒系統(tǒng)，組成為穿梭質(zhì)粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,p

2、HBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP）和骨架質(zhì)粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。其中穿梭質(zhì)粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）。pHBAd-CMV-IRES-RFP和 pHBAd-U6-RFP能表達(dá)紅色熒光蛋白（RFP）。1、載體信息腺病毒克隆載體圖譜如下： 各載體用途如下表：腺病毒載體名稱干擾pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP過表達(dá)pHBAd-CMV-IRES-GFP, pHBAd-CMV-IRES-RFP標(biāo)記示蹤pHBAd-CMV-IRES-GFP, pHBAd-CMV-IRES-RFP, pH

3、BAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP2） 骨架質(zhì)粒信息如下： 2、細(xì)胞株 293A，腺病毒的包裝細(xì)胞，為貼壁依賴型成上皮樣細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)生長增殖形成單層細(xì)胞,生長培養(yǎng)基為DMEM(含10% FBS)。3、菌株 大腸桿菌菌株DH5。用于擴(kuò)增腺病毒載體和腺病毒骨架載體質(zhì)粒。三、包裝細(xì)胞293A細(xì)胞的培養(yǎng)（一） 293A細(xì)胞的凍存 293A細(xì)胞來源于一個(gè)用作空斑測定的亞克隆，具有易使用和易轉(zhuǎn)染的特性。該細(xì)胞株對于高細(xì)胞密度很敏感，當(dāng)細(xì)胞超過70%匯合時(shí)，一些細(xì)胞可能會丟失它們的表型。若細(xì)胞密度持續(xù)在70%以下，QBI-293A細(xì)胞則能連續(xù)培養(yǎng)34個(gè)月維持原有細(xì)胞特性。若以購買得到的293A作

4、為第一代，則30代內(nèi)能得到最佳結(jié)果。隨著傳代的次數(shù)增加，293A細(xì)胞會出現(xiàn)生長狀態(tài)下降、突變等。為了防止此類現(xiàn)象的出現(xiàn)，我們需要在開始就對細(xì)胞進(jìn)行大量凍存，以保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和持續(xù)性。在細(xì)胞對數(shù)生長期進(jìn)行凍存，增加細(xì)胞復(fù)蘇成活率。1、去掉上清液，加入PBS洗去殘留的培養(yǎng)基；2、加入0.25%的胰酶，消化12min后，鏡下觀察細(xì)胞變圓，細(xì)胞間間隙加大時(shí)，去除胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻，移入離心管中。3、細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞全部晃下，加入 3mL 37 預(yù)熱的 10 DMEM，用 10mL 移液管進(jìn)行吹打，較大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，將所有細(xì)胞吸出，置于15mL 離心管中，取 50u

5、l 混勻后的細(xì)胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul 10 DMEM，即為 10 倍稀釋，混勻，取 10ul 細(xì)胞于計(jì)數(shù)板 中計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板上共 4 大格，每大格 16 小格。計(jì)數(shù)時(shí)，4 大格均計(jì) 數(shù)，總數(shù)除以 4（得每大格細(xì)胞數(shù)），再乘以 10（10 倍稀釋），即 為實(shí)際 n萬/mL 細(xì)胞濃度。4、細(xì)胞離心，1000rpm，5min。去掉上清。5、根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果加入細(xì)胞凍存液（70%完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO）,重懸細(xì)胞，密度為3 x 106個(gè)/ml。6、分裝進(jìn)細(xì)胞凍存管，放入凍存盒中，放入-80超低溫冰箱。7、第二天將細(xì)胞放于液氮罐中長久保存，并作記錄

6、。保存過程中，要不時(shí)復(fù)蘇細(xì)胞檢測細(xì)胞存活率，觀察細(xì)胞狀態(tài)等。（二）293A細(xì)胞的傳代當(dāng)細(xì)胞生長到匯合率達(dá)到80%90%時(shí)需要對細(xì)胞進(jìn)行傳代操作，以擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量，維持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。1、消化細(xì)胞，方法同細(xì)胞凍存。2、細(xì)胞離心結(jié)束后，加入完全培養(yǎng)基重懸。3、根據(jù)具體情況，將細(xì)胞分到10cm培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿補(bǔ)足到10ml培養(yǎng)基。4、將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放回37、5%CO2和95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（三）293A細(xì)胞的復(fù)蘇當(dāng)細(xì)胞傳代次數(shù)過多，細(xì)胞狀態(tài)變差時(shí)，或者細(xì)胞出現(xiàn)污染事故時(shí)，需要丟棄并對最初凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇。1、設(shè)置溫度為3742的水浴。2、查看細(xì)胞庫記錄，根據(jù)記錄從液氮罐中取出凍存的細(xì)

7、胞（需戴上棉手套，防止被凍傷），迅速丟入水浴鍋中并快速晃動(dòng)，盡量在12 min內(nèi)使細(xì)胞溶液完全溶解。3、將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，并在其中加上1ml新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻后離心，1000rpm，5min。4、去掉上清，加入5ml新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻沉淀后，轉(zhuǎn)入6cm培養(yǎng)皿。5、將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放入37、5%CO2和95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6、第二天觀察細(xì)胞存活率。給細(xì)胞換一下培養(yǎng)基。以后每天觀察細(xì)胞生長情況。四、腺病毒包裝、擴(kuò)增和純化（一）腺病毒包裝 事先準(zhǔn)備好用于包裝病毒的293A細(xì)胞和病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染每個(gè)直徑為6cm的培養(yǎng)皿complex成分如下：穿梭質(zhì)粒2gp-BHG(delt

8、a)E1,3 cre4gOpti MEM需在37度水浴中預(yù)熱，LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑需恢復(fù)至室溫方可使用，使用前需搖勻。轉(zhuǎn)染后6h換新鮮培液。注：LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑為漢恒生物產(chǎn)品，使用說明參考LipofiterTM說明書。 轉(zhuǎn)染前細(xì)胞必須處于良好的生長狀態(tài)。 病毒實(shí)驗(yàn)帶有一定的危險(xiǎn)性，為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套，在生物安全柜里進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。 （二）病毒收集病毒收集前要觀察病毒空斑是否形成，為限制病毒的擴(kuò)散及空斑更好的形成，通常在培養(yǎng)液中加入瓊脂糖，感染后7天左右可以在顯微鏡下看到小的空斑，一般在10至21天內(nèi)形成，空斑形成后連著瓊脂糖一起將空斑挑起，放入新

9、鮮培養(yǎng)基中過夜。（三） 病毒擴(kuò)增第二天，將培養(yǎng)基中病毒加入新鮮293A細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行病毒少量擴(kuò)增。至細(xì)胞再次出現(xiàn)空斑，收集細(xì)胞及上清，反復(fù)凍融三次收集病毒，以此病毒為P1代病毒，以P1代腺病毒感染293A細(xì)胞，連續(xù)進(jìn)行三代感染，至P4代進(jìn)行腺病毒的大量擴(kuò)增，待空斑形成后收集病毒并對病毒進(jìn)行體外純化和濃縮。 （四）病毒純化病毒純化采用CsCl密度梯度離心-透析聯(lián)用法純化病毒，CsCl梯度的制備方法如下：加入2.0ml密度為1.40g/ml的CsCl溶液（溶劑同上），然后緩慢加入3.0ml密度為1.30g/ml的CsCl溶液，再加入5ml的病毒懸浮液。20000rpm，室溫離心2小時(shí)。收集密度在

10、1.30g/ml和1.40g/ml之間的病毒條帶至透析袋中（透析袋使用前用10mM的EDTANa2煮沸10min）。在透析緩沖液（50g蔗糖，10ml 1M Tris-HCl，PH8.0，2ml 1M MgCl2定容至1L）中，4攪拌透析過夜，中間換一次透析液。收集病毒，測定病毒滴度。（五）病毒重懸和保存500ul PBS重懸病毒沉淀，一周內(nèi)使用則置于4度冰箱保存，如需長時(shí)間存放需置于-80度甚至液氮保存。五、感染目的細(xì)胞因?yàn)椴煌?xì)胞的MOI不同，所以在將病毒感染正式感染目的細(xì)胞前，需要做一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定目的細(xì)胞中加入的病毒數(shù)。（一）細(xì)胞準(zhǔn)備將狀態(tài)良好的目的細(xì)胞接種到24孔板，使細(xì)胞濃度為11

11、05/ml細(xì)胞，接種細(xì)胞數(shù)量因細(xì)胞的生長速度而略有不同，一般是保證第二天進(jìn)行病毒感染的時(shí)候細(xì)胞匯合率介于50%至70%直接。病毒感染1.polybrene的選擇：Polybrene:是帶正電的小分子，與細(xì)胞表面的陰離子結(jié)合，提高腺病毒對細(xì)胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率210倍。Polybrene有一定的細(xì)胞毒性，有的細(xì)胞對polybrene的毒理反應(yīng)明顯，因此細(xì)胞感染時(shí)是否適合polybrene需要摸索；不同細(xì)胞對polybrene的敏感度不同，可以用110g/ml的范圍篩選合適的濃度，以24h內(nèi)細(xì)胞無明顯毒性反應(yīng)為佳，可參考文獻(xiàn)并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，polybrene最常

12、用的工作濃度為58g/ml。注： 1）漢恒生物的自產(chǎn)的Polybrene 產(chǎn)品，用戶可用以進(jìn)行輔助感染。提供的Polybrene母液保存在-20（可保存1年以上），避免反復(fù)凍融3次以上，否則活性受影響。4可保存2周。 2） Polybrene預(yù)實(shí)驗(yàn)請先以對照病毒進(jìn)行摸索，大部分腺病毒感染的細(xì)胞可不加Polybrene即獲得很高轉(zhuǎn)染效率。具體情況以預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)！2. 感染細(xì)胞最佳MOI的測定MOI（Multiplicity of Infection，感染復(fù)數(shù)）是指每個(gè)細(xì)胞感染的病毒數(shù)。通常MOI越高，腺病毒感染后宿主細(xì)胞內(nèi)保留的腺病毒基因組數(shù)量以及目的蛋白的表達(dá)量越高。腺病毒對于不同種類不同來

13、源的細(xì)胞，其最適MOI各有差別，原則上最適MOI是感染效率較好的最低MOI。原則上每種細(xì)胞對應(yīng)每種類型的病毒都應(yīng)該進(jìn)行最適MOI摸索實(shí)驗(yàn)，設(shè)置MOI梯度摸索實(shí)驗(yàn)，選擇適合的MOI進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MOI一般以1：3：5或者1:3:10進(jìn)行梯度摸索，一般的細(xì)胞基礎(chǔ)腺病毒感染MOI可以10為開始，即10，30，50或者10，30，100。MOI對應(yīng)病毒體積的換算轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞數(shù)（一般以傳代計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)2計(jì)算）MOI=病毒個(gè)數(shù)；則加入的病毒體積數(shù)=病毒個(gè)數(shù)/病毒滴度。例子：轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)為105個(gè)，MOI為100，則需要病毒的個(gè)數(shù)為107個(gè)，病毒如果滴度為1010 PFU/ml,則需要加入的病毒體積為107/（101

14、0 PFU/ml）=10-3ml=1ul。同理，300，500相應(yīng)為3ul，5ul。詳細(xì)的細(xì)胞數(shù)/MOI/病毒體積換算參見附1表格I、貼壁細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)分為兩組，分別添加相應(yīng)腺體病毒載體和等滴度同體積的對照病毒載體，1/2體積培養(yǎng)液感染（詳見下表格）。加入的病毒量范圍推薦MOI為=10，30，100，300，500內(nèi)，每個(gè)MOI值加兩個(gè)孔。對于增殖能力較弱的細(xì)胞，比如特別是一些原代細(xì)胞如神經(jīng)元、心肌細(xì)胞，1/2體積感染2小時(shí)足夠，2小時(shí)后只換成新鮮培液。對于增殖能力較強(qiáng)的細(xì)胞，如BMSC（骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞），1/2體積感染2小時(shí)后，不換液，而是追加1/2新鮮培液，繼續(xù)37度感染過夜，有利于提高感

15、染效率。對于polybrene適用的細(xì)胞，1/2體積感染的培液中，polybrene濃度為固定值（58ug/ml）；如2小時(shí)后停止感染置換新鮮培液，則無需再加入polybrene（針對上述增殖能力弱的細(xì)胞）；如2小時(shí)1/2體積感染后繼續(xù)追加培液感染過夜，則補(bǔ)充的新鮮培液中要含有等終濃度的polybrene。病毒小培養(yǎng)體積感染表培養(yǎng)皿表面積對應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液體積病毒感染對應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液體積類型/cm296-well0.3cm2100ul50ul24-well2cm2500ul250ul12-well4cm21ml500ul6-well10cm22ml1ml60mm 20cm24ml2ml100mm 6

16、0cm210ml5ml慢病毒感染4小時(shí)后補(bǔ)足至培養(yǎng)體積，感染24小時(shí)后換液，腺病毒感染2小時(shí)后直接換液II、懸浮細(xì)胞上面介紹的是針對貼壁細(xì)胞的感染方法，若是懸浮或半懸浮細(xì)胞，則需要通過平角離心轉(zhuǎn)染法，即將適量的病毒液加入細(xì)胞培養(yǎng)板后（感染體系同貼壁細(xì)胞中病毒小培養(yǎng)體積感染表），封好口，放入平角離心機(jī)后，低速（900g1500g）離心1h，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)感染1小時(shí)即可，這樣總共感染了2小時(shí)。若由于實(shí)驗(yàn)條件有限，沒有平角離心機(jī)，可用離心管代替，將細(xì)胞吹打吸入離心管中，進(jìn)行低速離心，去掉大部分上清，然后加入適量的病毒液，室溫放置10min（不能超過半小時(shí)），然后將細(xì)胞和病毒液同時(shí)吸出轉(zhuǎn)入培

17、養(yǎng)皿中繼續(xù)病毒感染至2小時(shí)后換液即可。注：懸浮細(xì)胞離心感染1小時(shí)+離心后37度小體積感染1小時(shí)，一般直置換新鮮培液。對于少數(shù)感染效果較差的懸浮細(xì)胞，追加1/2新鮮培液持續(xù)感染過夜也有助于提高感染效率，但要注意不能影響細(xì)胞狀態(tài)，具體步驟以實(shí)驗(yàn)摸索結(jié)果為準(zhǔn)。Polybrene的使用事項(xiàng)同樣適用于懸浮細(xì)胞。（三）觀察感染情況感染24小時(shí)后，可以開始觀察到GFP/RFP表達(dá)（只對于有GFP/RFP獨(dú)立表達(dá)框的腺病毒載體），過表達(dá)和干擾的感染時(shí)間以36-48小時(shí)實(shí)驗(yàn)為最佳。 六、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)例子：小鼠尾靜脈注射將純化過的腺病毒以每只小鼠 1-5109毒量注射，比如純化腺病毒滴度為 11011PFU，則每只小

18、鼠注射體積約為 10-50ul。具體的注射量需要實(shí)驗(yàn)摸索，注意注射體積不要超過 200ul，最好控制在100ul以下，注射劑量過多，也會發(fā)生充血性心衰。其他病毒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可與我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)工程師溝通細(xì)節(jié)尋求幫助。附1：漢恒生物腺病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）與體積對應(yīng)表規(guī)格大約數(shù)目MOI值加入病毒數(shù)量腺病毒MOI摸索時(shí)的體積梯度/ul96well2-510450-1001-51060.1；0.3；148well1-210550-1000.5-21070.5-2ul0.5；2；624well2-310550-1001-31071-3ul1；3；1012well510550-1002.5-51072.5-5

19、ul2.5；7.5；256well1-210650-1000.5-21085-20ul5；15；5035mmdish1-210650-1000.5-21085-20ul5；15；5060mmdish2-410650-1001-410810-40ul10；30；100100mmdish6-1010650-1003-1010830-80ul30；100；300150mmdish1-210750-1000.5-210950-200ul60；180；600腺病毒滴度以1010/ml為準(zhǔn)，其他滴度需相應(yīng)換算；大約細(xì)胞數(shù)目是根據(jù)80%100%細(xì)胞密度估算而出，具體細(xì)胞數(shù)請種細(xì)胞時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。注： 1）2

20、4板長滿了細(xì)胞大約有3105個(gè)細(xì)胞。 如果一天后要長到70（2.1105）， 建議1.21.4105個(gè)細(xì)胞。因?yàn)榧?xì)胞剛放進(jìn)去的前幾個(gè)小時(shí)需要粘在生長表面及適應(yīng)新的生長條件，不會達(dá)到24小時(shí)翻一倍的速度。其他規(guī)格培養(yǎng)可參照此確定相應(yīng)culture細(xì)胞量。2）MOI值: MOI 是multiplicity of infection的縮寫，中文譯為感染復(fù)數(shù),實(shí)際的含義即為每個(gè)細(xì)胞被多少個(gè)有活力病毒所感染。各種細(xì)胞的最適MOI值有差別，請客戶正式實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最適MOI。 附2：漢恒生物各病毒載體感染目的細(xì)胞比較腺病毒慢病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒感染方式直接加入直接加入直接加入換液時(shí)間感染后2h感染后24

21、h感染后24h是否需要篩選不需要，腺病毒感染能力很強(qiáng)需要篩選獲得穩(wěn)定感染株，慢病毒的感染能力不強(qiáng)需要篩選獲得穩(wěn)定感染株，逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染能力不強(qiáng)觀察時(shí)間如帶有GFP等熒光標(biāo)簽，24h后可觀察到熒光，36h可達(dá)到表達(dá)高峰，若不帶有熒光標(biāo)簽，則需要鑒定帶有GFP等熒光標(biāo)簽，24h后可以觀察到表達(dá)，36h達(dá)到高峰，若不帶有熒光標(biāo)簽，則不可直接觀察到，需要鑒定帶有GFP等熒光標(biāo)簽，24h后可以觀察到表達(dá)，36h達(dá)到高峰，若不帶有熒光標(biāo)簽，則不可直接觀察到，需要鑒定是否需要助轉(zhuǎn)劑不需要有時(shí)需要，但是根據(jù)具體情況操作，因?yàn)橹D(zhuǎn)劑，如polybrene，對細(xì)胞的傷害比較大，有的細(xì)胞可能承受不了有時(shí)需要，但是根據(jù)具體情況操作，因?yàn)橹D(zhuǎn)劑，如polybrene，對細(xì)胞的傷害比較大，有的細(xì)胞可能承受不了附3：各種病毒載體感染目的細(xì)胞操作區(qū)別腺病毒慢病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒感染方式直接加入直接加入直接加入換液時(shí)間感染后2h感染后24h感染后2