不同處理和保存條件下體外HCV RNA穩(wěn)定性研究

1、差異處置懲罰和保存條件下體外HCV RNA不變性研究劉長利任芙蓉呂秋霜劉景漢莊輝【摘要】對獻血者或病人舉行HV核酸檢測時，假設標本的網羅、處置懲罰、保存不妥，會造成病毒核酸落解，從而影響檢測效果的真實性。本研究的目的是對差異抗凝劑、差異溫度、差異保存時間下的HVRNA病毒不變性舉行研究，以觀察通例采供血歷程中，標本網羅及保存方法對NAT檢測的影響。網羅7例HVRNA陽性獻血者的血樣，接納差異的抗凝劑、經差異的溫度和差異的時間保存后，接納熒光定量PR要領測定HVRNA病毒含量，觀察HVRNA的不變性。效果表白：差異抗凝劑抗凝的全血于4保存48小時歷程中,病毒含量落落至原滴度的42.7%；EDTA

2、抗凝組各時間點的滴度均低于別的3組別離相稱于別的3組的67.6%-25.1%。AD抗凝的全血在4、25和37保存48小時，病毒含量別離落落到原滴度的53.8%、72.5%、29.8%。AD抗凝的全血離心分散出血漿，4或25繼承保存7天,病毒含量別離落落至原滴度的70.9%和25.1%。AD抗凝的全血分散的血漿，重復凍融4次，病毒含量落落到原滴度的38.9%。結論：用于核酸檢測的標本應該用無菌采血管采樣；在無菌采血管采樣的條件下，核酸檢測標本用未抗凝血、EDTA、AD、PDA抗凝血均可；網羅的全血應制止安排37以上，AD抗凝全血在4、25保存48小時內、37保存14小時內,HVRNA病毒仍較為不

3、變；分散后的血漿應制止安排25以上，AD抗凝全血分散后的血漿在4保存7天，25保存3天，HVRNA病毒仍比力不變；血漿標本應制止屢次凍融，但凍融3次的血漿HVRNA病毒含量仍舊較為不變；無菌采樣對維持病毒的不變性非常緊張；單純的機器性溶血并不會顯著導致病毒的落解；只要留意無菌的題目和有符合的核酸提取要領去除血紅素，HVRNA病毒現實上比從前以為的要不變得多?！娟P鍵詞】丙型肝炎病毒；丙型肝炎病毒RNA；病毒不變性；保存條件；抗凝劑StabilityfHepatitisVirusRNAinVariusPressingandStragenditinsKeyrdsHV;HVRNA;virusstabi

4、lity;stragenditin;antiagulant血漿中HVRNA病毒含量測定通常被用于評估丙型肝炎病人的療效及闡發(fā)預后等。對付檢測效果的正確性來說，標本的網羅、處置懲罰、保存是否恰當黑白常緊張的。一樣平常以為，RNA病毒離體后輕易受到外界情況的影響而落解，因此對樣品的處置懲罰方法、保存溫度、時間、是否溶血等都有較高的要求。核酸檢測技能已在很多國度的獻血員血液篩查中應用，我國一些血液中央也在連續(xù)舉行一些核酸檢測可行性和需要性的評估事情。但如今，對付HVRNA樣本的網羅、處置懲罰、保存不變性研究缺乏全面的報道，尤其是針對在采、供血機構中用于核酸檢測血液篩查標本的網羅、處置懲罰、保存的尺度

5、未見報道。在本研究中，我們對差異抗凝劑、差異時間和溫度條件下處置懲罰和保存的HVRNA病毒舉行定量測定，以探究影響體外RNA病毒不變性的因素。質料和要領樣原泉源血液樣原來自2022年到2022年北京血液中央無償獻血的獻血者中7例HVRNA陽性且未顛末治療的無償獻血者。樣本網羅根據通例獻血員血液網羅的尺度操縱規(guī)程和要領網羅HVRNA陽性者血液約100l，別離用AD、PDA、EDTA抗凝或不抗凝未抗凝血。網羅后的血液立即移至百級凈化臺內舉行無菌分裝，將3種抗凝血分裝于2l無菌Ep管中，每管1.0l，用于用差異抗凝劑網羅血液、差異時間分散血漿血清及差異溫度保存全血的研究。將分裝完時作為0小時比較。同

6、時將一部門AD抗凝血置于50l無菌離心管中美國rning公司產物,25安排6小時后1000g離心10分鐘分散血漿，然后分裝于1.5l無菌Ep管，每管0.5l，用于差異溫度保存的血漿及重復凍融血漿處置懲罰的研究。以上樣品處置懲罰操縱均為無菌操縱。樣本處置懲罰差異抗凝劑網羅和保存的全血將未抗凝的血和PDA、EDTA、AD抗凝血置4冰箱中靜止保存，于1、3、6、12、24、48小時各取2管Ep管，顛倒混勻3次后，41000g離心10分鐘分出血漿或血清。別的PDA、EDTA、AD抗凝血于分裝后馬上離心分出血漿，作為0小時比較。-80凍存，等候同一檢測。差異溫度保存的全血選用AD抗凝全血，別離保存于4冰

7、箱、25水寓37水浴，然后于1、3、6、12、24、48小時各取2管，顛倒混勻3次后，41000g離心分出血漿或血清，-80凍存，等候同一檢測。差異溫度保存的血漿選用AD抗凝血25保存6小時離心后分裝的血漿，于4、25繼承保存1、3、5、7天，-80凍存，等候同一檢測。凍融處置懲罰選用AD抗凝于25保存6小時離心后分裝的血漿，做1-4次凍融處置懲罰，凍融條件：-80凍存至少1天；室溫1小時，顛倒混勻后，放入-80。-80凍存，等候同一檢測。RNA病毒含量檢測利用Rhe核酸提取柱提取核酸，用深圳匹基公司HV熒光定量PR檢測試劑盒和美國Researh公司的ptin熒光定量PR檢測儀舉行擴增和檢測。

8、為制止核酸定量存在批間差異，每例HVRNA陽性獻血者的全部處置懲罰樣品均在同一次Run中舉行。核酸提取利用Rhe核酸提取柱，按試劑盒說明提取核酸。每個2.0l離心管中參加200l待檢測樣本，各參加200l結合緩沖液bindingbuffer事情液及50l卵白酶K溶液，敏捷混淆勻稱，于72溫浴15分鐘HB-1000型恒溫金屬浴，杭州大和公司FerrTe產物。各管中參加125l異丙醇，混淆勻稱，轉入加套管的提取柱，8000g離心1分鐘。將裝有濾出液的套管拋棄，換上新套管，向提取柱中參加500l除按捺物緩沖液inhibitrrevalbuffer事情液于8000g離心1分鐘；換上新集液管，向提取柱中

9、參加450l洗滌緩沖液ashbuffer事情液于8000g離心1分鐘；換套管，再次用450l洗滌緩沖液事情液洗滌后，起首以8000g離心1分鐘，然后13000g離心10秒以去除痕量的洗滌緩沖液。每個提取柱換上1.5l離心管，室溫安排3分鐘，向提取柱中參加50l洗脫緩沖液elutinbuffer，于8000g離心1分鐘網絡濾出液，于4保存?zhèn)溆?。核酸擴增和檢測接納深圳匹基公司HV熒光定量PR檢測試劑盒，美國ptin熒光PR儀舉行檢測。按試劑盒要求配制反響液。每個反響體系含：HVRT-PR反響液29.6l,Enhaner0.4l,RT-PR逆轉錄酶0.25l。取待測樣品濾出液或陽性參控品各20l,反

10、響總體積50l,擴增和檢測參數為：4230分鐘;953分鐘;9510秒；5530秒；7260秒，共5個循環(huán);然后955秒,6030秒,共42個循環(huán)，然后讀取熒光。效果判斷擴增的效果由儀器軟件主動闡發(fā)給出效果。實行數據可靠性為制止核酸定量存在批間差異，同1例HVRNA陽性獻血者的全部處置懲罰樣品均在同一次Run中舉行。為確保定量事情的正確性，接納了Rhe核酸提取柱以確保核酸提取歷程中的接納率和重復性。實行所用的匹基公司的熒光PR核酸檢測試劑是海內最早得到容許文號的HVPR臨床診斷試劑。本實行室于2022年5月被衛(wèi)生部臨床查驗中央容許為核酸檢測實行室，并曾利用該要領舉行了大標本量的核酸檢測事情1。

11、統(tǒng)計學闡發(fā)凍融對HVRNA的影響接納SPSS10.0軟件舉行雙因素方差闡發(fā)，別的組內統(tǒng)計資料接納SPSS10.0軟件舉行重復丈量方差闡發(fā)；組間統(tǒng)計資料接納SAS6.12軟件舉行重復丈量資料趨勢性方差闡發(fā)。效果HVRNA陽性獻血者病毒含量本研究中的7例HVRNA陽性獻血者病毒含量見表1。7例陽性標本經采血后立即檢測，其HVRNA病毒含量都在106pies/l擺布，均屬于HV病毒強陽性標本。Table1.AuntfHVRNAfsevenuntreateddnrs略差異抗凝劑對全血中HVRNA不變性的影響用差異抗凝劑抗凝的全血于4保存48小時,其HVRNA的變革見表2。效果表白，各抗凝組在4保存48小時歷程中，病毒含量均略有落落，落落幅度不大，0.37Lg,亦即遍地理組4保存48小時的病毒滴度落落至原滴度的42.7%。但EDTA抗凝組各時間點均勻低于別的3組0.17-0.60Lg重復丈量資料趨勢性方差闡發(fā)P0.05，即別的3組的67.6%-25.1%。差異保存溫度對全血中HVRNA不變性的影響差異溫度下保存的血漿樣品中HVRNA