第三篇核酸組化染色六

1、第五節(jié)核酸 1世上物質(zhì)萬(wàn)種，名目繁多，但不管是動(dòng)物還是生物，都含有核酸，它是生物在發(fā)育，繁殖，遺傳和變異的主要物質(zhì)，因而它成為人們的主要研究對(duì)象，在病理學(xué)的范疇中，主要是在形態(tài)學(xué)方面對(duì)核酸的顯示。 2核酸分為脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）兩大類。組成核苷酸的物質(zhì)有含氮的有機(jī)堿或稱為堿基、戊糖和磷酸三種。 在正常的情況下，DNA和RNA都是由核苷酸組成的，它們的含量約占細(xì)胞干重的5-15%，約90%的DNA存在于細(xì)胞核內(nèi)，而少量的 RNA（約10%）存在于細(xì)胞核中，RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，約占75%

2、，另有10 % 在細(xì)胞核內(nèi)，15%在細(xì)胞器中。29 RNA分為核蛋白體RNA（rRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）和信使RNA（mRNA）， 3人體在合成蛋白質(zhì)始終遵循著“中心法則”由DNA到RNA再到蛋白質(zhì)這一過(guò)程式不可以有任何差錯(cuò)的，否則細(xì)胞便不能合成應(yīng)有的蛋白質(zhì)，甚至?xí)铣慑e(cuò)誤的蛋白質(zhì)，如癌蛋白，于是出現(xiàn)了癌細(xì)胞，導(dǎo)致癌癥發(fā)生。 4從分子學(xué)的水平角度來(lái)認(rèn)識(shí)癌細(xì)胞，癌細(xì)胞也可分為癌細(xì)胞核、癌細(xì)胞漿和癌細(xì)胞膜。中心是癌細(xì)胞核，內(nèi)部有染色體，染色體包含一條很長(zhǎng)的DNA鏈。 該鏈由不同的基因片斷組成。癌細(xì)胞在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，是這些基因在起作用的。 5細(xì)胞在受到各種有害物質(zhì)如化學(xué)物質(zhì)、病毒等毒害時(shí)，

3、細(xì)胞上DNA的核苷酸就會(huì)和這些物質(zhì)結(jié)合，形成加合物，直接損害核苷酸?；虻膿p害，功能的喪失，必定要有其它的基因來(lái)補(bǔ)充，突然間的點(diǎn)面上的基因又多了，然而這些增多的基因恰恰是加快細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白，或者是抑制細(xì)胞凋亡的蛋白對(duì)應(yīng)的基因， 于是乎細(xì)胞生長(zhǎng)加速增快，細(xì)胞不會(huì)凋亡，無(wú)休止的生長(zhǎng)，這就是腫瘤細(xì)胞的典型生長(zhǎng)情況 . 6 癌細(xì)胞的形成也是多基因的變異，一個(gè)基因的變異不會(huì)發(fā)展成癌細(xì)胞，只有在多基因的變異的情況下才可以發(fā)展成癌細(xì)胞。基因的變異是指某些基因擴(kuò)增，某些基因減少了，從目前的認(rèn)識(shí)水平上看，擴(kuò)增的基因有：AP-1Ctre、NF-KbCtre、ETsctre、C-Fos、C- jun、Myc、Ras

4、、Survivin等。 7被破壞的基因有：BRCA1、BRCA2、P53、P63、P73、Rb、P16等。 對(duì)于這些基因的檢測(cè)目前應(yīng)用的技術(shù)有免疫組織化學(xué)技術(shù)、包括原位分子雜交技術(shù)和PCR技術(shù)等。 8（一）、擴(kuò)增基因各自的功能。 1、C- jun癌基因。 C-jun癌基因與鳥(niǎo)類肉瘤 病毒17的轉(zhuǎn)化基因具有同源性，是早期應(yīng)答基因家族成員之一。 92、 C- myc基因。C-myc基因?qū)儆?myc 家族。同屬于此家族的還有N- myc 、L-myc， 其中C- myc與 胰腺癌的關(guān)系密切，該基因定位8 q24.1 在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合于單鏈或雙鏈DNA上，對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程突施調(diào)控。C-myc的表達(dá)活性與細(xì)胞生

5、長(zhǎng)分裂速度密切相關(guān)，而且也是細(xì)胞凋亡的潛在誘導(dǎo)因子，C-myc基因的表達(dá)與乳腺癌、結(jié)腸癌和膀胱癌等腫瘤的增殖有關(guān)。并與結(jié)腸癌的預(yù)后有關(guān)。 10 3、C-fos。C-fos是一種轉(zhuǎn)錄活化因子（AP-1），與C-jun 原癌基因產(chǎn)物形成一種復(fù)合物，參與多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)。正常組織幾乎不表達(dá)或弱表達(dá)。4、Survivin（存活素） 它是細(xì)胞凋亡抑制基因家族中的一個(gè)成員，在于細(xì)胞周期中的G2M其中有表達(dá)，在許多腫瘤中有表達(dá)。 11 5、NF-Kb。NF-Kb是由一組結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白家族組成。（二）、被破壞基因的各自功能: 1、 BRCA1：它是一種BRCA1 基因產(chǎn)物，是乳腺癌的易感基因之一 ，具有

6、對(duì)乳腺癌等腫瘤的抑制作用，BRCA1功能的丟失或者增加都可以造成對(duì)乳腺癌和卵巢癌的易感性。12 2、BRCA2：BRCA2又稱為乳腺癌易感蛋白，遺傳性BRCA2 基因突變可以增加乳腺的家族性高發(fā)的危險(xiǎn)性，且腫瘤發(fā)生與野生型等位基因丟失相關(guān)，BRCA2編碼為3418氨基酸蛋白，與其它蛋白很少有同源性. 13 3、P53。P53是一種抑癌基因，分為野生型和突變型兩種。應(yīng)用石蠟切片免疫組織化學(xué)檢測(cè)獲得陽(yáng)性的 P53 主要是突變型。這是由于突變型的半衰期時(shí)間較長(zhǎng)，約為4-8 小時(shí)，而野生型的半衰期時(shí)間較短， 大約僅有20分鐘左右，因此應(yīng)用石蠟切片根本無(wú)法完成。P53可作為細(xì)胞凋亡中的一個(gè)調(diào)控因子。14

7、 4、P63。P63 是P53基因家族成員之一，該基因定位于染色體3 q27-28，編碼6種以上主要異構(gòu)體分別待遇轉(zhuǎn)錄激酶活性，死亡誘導(dǎo)活性（TAP63）和顯色失活活性。在胚胎時(shí)期，多種上皮和器官發(fā)育需要P63蛋白，P63 在肌上皮細(xì)胞中表達(dá)，且作用 優(yōu)于SMA，在肌纖維母細(xì)胞中不表達(dá)。 155、P16。P16是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白之一，又稱為“有絲分裂抑制因子”，其作用是與細(xì)胞周期素D竟?fàn)幮越Y(jié)合CdK4/ 6，阻止 細(xì)胞從G1期至S 期的進(jìn)程，從而對(duì)有絲分裂進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)。在腫瘤細(xì)胞中由于基因的突變或缺失，往往導(dǎo)致P16表達(dá)增加，但卻不對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)節(jié)。 16 6、P73蛋白。P73 蛋白是腫

8、瘤抑制基因P53蛋白的類似物，在P53 缺失表達(dá)的腫瘤中過(guò)度表達(dá)可以活化P53的表達(dá)。P73有六種異構(gòu)體，在正常組織中表達(dá)量很低，而在某些腫瘤中表達(dá)升高，例如：乳腺癌、肺腫瘤、肝細(xì)胞癌等。17 7、Rb（Retinoblastoma protein）視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因蛋白。它是一種腫瘤抑制基因，位于染色體13 q14，其基因的缺失或突變與許多腫瘤的發(fā)生相關(guān)，包括視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌和一些肉瘤。 18 （三）、堿基。構(gòu)成堿基的物質(zhì)有兩類: 一類是嘌呤和嘧啶。乳腺嘌呤和鳥(niǎo)嘧啶，DNA和RNA 都含有這兩種物質(zhì)。另一類為胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。胞嘧啶存在于DNA和 RNA中

9、，胸腺嘧啶只存在于DNA中，而尿嘧啶則僅存在于RNA中。19 （四）、戊糖。DNA中含有的戊糖主要是D-2脫氧核糖. RNA中所含的戊糖是 D-核糖。20 （五）、磷酸。磷酸的殘基與核苷構(gòu)成的化合物即核苷的磷酸酯。核苷酸是核酸分子的結(jié)構(gòu)單元。核苷酸分子中的核苷酸都以殘基形式存在，在細(xì)胞內(nèi)含有多種游離的核苷酸，其中包括一磷核苷、二磷酸核苷和三磷酸核苷。 21 （六）、DNA和RNA的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)。1、 一級(jí)結(jié)構(gòu)是由四種脫氧核糖核苷酸通過(guò)3,-5磷酸二酯鍵被此連接而成的線狀或環(huán)狀大分子，沒(méi)有側(cè)鏈。 222、二級(jí)結(jié)構(gòu)是雙螺旋結(jié)構(gòu)，以一共同軸為中心，以一條5-3，另一條為3-5相反向，但互相平行的脫氧核糖

10、苷酸鏈組成（即所稱的麻花結(jié)構(gòu)）。 3、三級(jí)結(jié)構(gòu)是指雙螺旋鏈作進(jìn)一步的扭曲構(gòu)象。 23 （七）、物理特性。1、DNA的變性。DNA的變性是指DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無(wú)規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。確切地說(shuō)是維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵和疏水鍵的斷裂。 24 2、DNAD 的復(fù)性 。DNA的復(fù)性是指變性DNA在適當(dāng)條件下，二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一個(gè)逆轉(zhuǎn)過(guò)程。熱變性DNA一般經(jīng)過(guò)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過(guò)程稱為退火。25 3、核酸分子雜交。核酸分子雜交的原理是應(yīng)用核酸分子的變性和復(fù)性的性質(zhì)，使來(lái)源不同的DNA（或RNA）片段，按堿基互補(bǔ)關(guān)系形成雜交雙鏈分子。雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間，也可以在RNA鏈與DNA鏈之間形成，雜交的本質(zhì)就是在一定的條件下使互補(bǔ)核酸鏈實(shí)現(xiàn)復(fù)性。 26二、核酸的顯示方法1、Feulgen顯示DNA法2、甲基綠-派若寧法顯示DNA和RNA3、膠性銀法顯示核仁組成區(qū) 4、核仁組成區(qū)和酸性粘多糖復(fù)合顯示法5 、黏多糖和核仁組成區(qū)雙染法27