重慶及三峽庫區(qū)博爾納病病毒

1、重慶及三峽庫區(qū)博爾納病病毒豬的自然感染狀況調查研究國家高技術研究發(fā)展（863）計劃資助項目（編號：2006AA02Z196）通訊作者：謝鵬，Email:peng.xie58 電者簡介：朱丹，女，漢族，重慶市人，博士研究生，主要從事中樞神經系統(tǒng)感染等方面的研究。Email:zhudan25,聯(lián)系電話丹1 ,謝鵬1,2,1 重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經內科 重慶 400016；2重慶醫(yī)科大學神經科學研究中心 重慶 400016；摘要 目的 探討重慶及三峽庫區(qū)豬的博爾納病病毒(BDV)自然感染狀況。 方法 采用巢式逆轉錄酶聚合酶鏈反應結合熒光定

2、量PCR(FQ-nRT-PCR)技術檢測了重慶三峽庫區(qū)豬的外周血PBMC中BDV p24基因片段，分別隨機選取每種樣本部分陽性產物進行了基因序列測定、同源性和氨基酸順序分析。結果 BDV p24基因片段陽性率在360只豬的PBMC BDV-p24基因的陽性檢出率為4.44%。序列分析結果表明，重慶及三峽庫區(qū)豬感染的BDV核苷酸序列與馬 He80同源性為100，并且編碼的氨基酸序列也相同。結論 證實重慶及三峽庫區(qū)豬中存在BDV的自然感染。該地區(qū)感染的BDVP24核苷酸序列與He80株具有高度同源性。 關鍵詞：博爾納病病毒；巢式RT-PCR；TaqMan探針，豬Epidemiological In

3、vestigation of Borna Disease Virus Natural Infection in pigs in shanxia ,chongqing ,AbstractObjective: To investigate the epidemiological pattern of BDV infection in pigs and analyze phylogenetic tree of derived BDV in Three Gorges,chongqing. Method: We established a modified nested RT-PCR(nRT-PCR)

4、to detect BDV P24 segment in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain tissues of 360 pigs in Three Gorges, chongqing. Positive products were analyzed by sequencing and homology analysis.Results: The positive rates of BDV infection in PMBCs and brain tissues were 4.44%. In the gene sequen

5、ce revealed in positive PCR samples, we noticed a high degree of identity 100% to standard strain He/80 in gene sequence of positive PCR samples.Conclusion: Our study suggested BDV natural infection in Three Gorges, pigs. The endemic BDV had a high degree of identity to standard strain He/80.Keyword

6、s: Borna Disease Virus (BDV); nested RT-PCR; TaqMan probe; pig博爾納病病毒(Borna Disease Virus，BDV)，是一種新發(fā)的屬于博爾納病毒屬的嗜神經病毒,可引起博爾納病。該疾病最初被認為主要起源于在馬，內科醫(yī)生和獸醫(yī)對其都知之甚少1，直致近年來，越來越多的動物種系被檢測出了BDV抗體及其核酸陽性，也在除中歐傳統(tǒng)的博爾納病流行區(qū)外，越來越多的國家與地區(qū)發(fā)現(xiàn)了動物與人有BDV感染的證據，BDV開始得以引起了人們的重視2。目前研究表明，BDV是一種非細胞溶解的單股負鏈嗜神經RNA病毒，自然感染以馬和羊為主，推測其幾乎可以感染

7、所有的溫血動物3，并造成Borna病(Borna disease，BD)，臨床上以精神、行為異常為主要表現(xiàn)。在我國哈爾濱、寧夏和重慶已有對BDV檢測的散在報道4，5，但BDV的致病機理和流行病學資料尚不清楚。近年來，隨著我國三峽水庫建成，由此引起的以重慶為中心，幅射到四川、湖北以及長江中下游地區(qū)的生態(tài)環(huán)境巨變，使該地區(qū)很可能會成為一個十分危險的疫源地，一種或多種新發(fā)生感染性疾病很可能在該地區(qū)首先出現(xiàn)，并迅速擴散到全地區(qū)并引起全國大流行甚至爆發(fā)流行，因此，加強該地區(qū)新發(fā)性感染疾病的系統(tǒng)監(jiān)測和進行深入研究已經成為當務之急。此外，重慶及三峽庫區(qū)居民肉類消費多以豬肉為主，而且重慶地區(qū)也是我國大的生豬飼

8、養(yǎng)基地，為此，在以前研究的基礎上，我們采用了改進的巢式逆轉錄酶聚合酶鏈反應 (nRT-PCR)檢測重慶三峽庫區(qū)健康豬的外周血單核細(PBMCs)和腦組織中的BDV P24基因片段，并對陽性產物進行測序分析，以了解重慶三峽庫區(qū)地區(qū)豬的博爾納病毒自然感染狀況，初步建立三峽庫區(qū)BDV感染的預防監(jiān)測體系。 1 材料與方法研究對象 標本：全部360例健康豬均來自重慶山峽庫區(qū)（包括合川、榮昌、涪陵、云陽等養(yǎng)豬大縣），其中雄性180例，雌性180例。每例豬采外周血10ml加EDTA抗凝，同時采取左側額葉腦組織100mg。引物和探針 根據Genbank中BDV基因組中的最保守區(qū)N基因，即編碼核蛋白（P24蛋白

9、）的核苷酸序列，設計了2對引物和1條探針，其中外引物序列為P1：5-TGA CCC AAC CAG TAG ACC A- 3， P2：5-GTC CCA TTC ATC CGT TGT C- 3，內引物序列為P3：5-CCC TCC AAG TGG AAA CCA T- 3, P4: 5-CAG TAT CTT GAT GTT CTC GCC A-3，引物由上海英駿生物有限公司合成；熒光探針序列為：5-FAM-TCA GCG GTG CGA CCA CTCC GAT AGC-TAMRA- 3，由中山醫(yī)科大學達暉基因診斷中心合成。RNA的提取將EDTA 抗凝的外周血用Ficoll-conray液

10、密度梯度離心法分離PBMCs，隨后用 Trizol一步法提取RNA。提取的RNA樣本用紫外分光光度計測OD260nm和OD280nm值,并計算二者比值以分析RNA樣品的純度。使用隨機數字表法選擇8例PBMCs樣本提取的RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳分析所提取的RNA樣品完整性。樣本的博爾納病毒檢測本研究采用改進的nRT-PCR方法，在常規(guī)nRT-PCR的基礎上，在第二輪PCR過程中加入TaqMan熒光探針。在進行BDV檢測的以下環(huán)節(jié)中，每次均設置非模板對照以排除假陽性結果，同時每次檢測時使用博爾納病毒質粒（本課題組保存）作為陽性對照和標準品以排除假陰性結果。1.4.1 逆轉錄反應 反應體系為10

11、l，RNA樣本5l，5逆轉錄緩沖液2 l，外上下游引物各0.2 l，10mmol/L dNTP 0.1l，20U/u L逆轉錄酶 0.5 l，DEPC水2 l。反應條件：37 60min，95 3 min。1.4.2 第一輪PCR 采用25l反應體系：5定性PCR緩沖液5 l，外上下游引物各0.3 l，10mmol/L dNTP 0.3l，3U/l Taq聚合酶ll，逆轉錄產物5 l，ddH2O 13.1 l。反應條件：93預變性2min；93變性1min，55退火30s，72延伸50s，共25個循環(huán)。1.4.3 熒光定量PCR（FQ-PCR） 用50l 反應體系：5定量PCR緩沖液(含25m

12、mol/L MgCl2) 10l，內上、下游引物各0.5l，10 mmol/L dNTP 0.5l，Taq聚合酶(3u/l)1l，熒光探針0.5l，PCR產物5l，ddH2O 32l。反應條件：93預變性2min；93變性1min，55退火1min，共40個循環(huán)。運用Roter-gene 6000熒光定量PCR儀自動進行實時定量分析。nRT-PCR擴增產物電泳和測序將nRT-PCR陽性擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠掃描系統(tǒng)觀察結果。同時將PCR產物送上海生工有限公司測序。序列分析登陸Genebank，用Blast 軟件對BDV P24陽性擴增產物的核苷酸及其編碼的氨基酸序列與國外人和動物來

13、源BDV分離株和標準株Strain V與He/80等進行比較分析。2 結 果2.1 RNA的提取質量 所選擇8例外周血樣本的RNA，用紫外分光光度計測OD260nm、OD260nm值，比值分別為1.88、1.80、1.91、1.97，1.88、1.84、1.94、1.93。瓊脂糖凝膠電泳可見明顯的28S、18S、5S三條帶，其中28S與18S的亮度約為2：1，提示所提取的RNA樣品純度較高、完整性良好。2.2 樣本的博爾納病毒檢測結果 使用改進的nRT-PCR方法對樣本RNA進行博爾納病毒檢測，結果發(fā)現(xiàn)，16例豬外周血樣本中的BDV P24基因片段檢測陽性（見圖1）；其余樣本均為陰性。 圖1

14、豬外周血單個核細胞的BDV熒光擴增曲線 2.3 PCR擴增產物的電泳和測序鑒定 瓊脂糖凝膠電泳顯示，陽性樣本PCR擴增產物的大小為86bp，與預期相符。其它陰性樣品未見此擴增條帶。PCR陽性樣本的擴增產物進行測序，并登陸美國國立衛(wèi)生院網站(/Blast.cgi)進行Blast檢索和序列比對。結果發(fā)現(xiàn)，16例樣本的PCR擴增產物序列與BDV 標準病毒株He/80（Access Number：L27077） 序列完全一致，同源性為86/86 (100.00%)；與其它標準病毒株Strain V（Access Number：HYPERLINK /entrez/query.fcgi?cmd=Retri

15、eve&db=Nucleotide&list_uids=439575&dopt=GenBank&RID=5ZRG3SY5012&log$=nucltop&blast_rank=10U04608.1）和Strain H1766（HYPERLINK /entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=15718099&dopt=GenBank&RID=5ZR8EHGF012&log$=nucltop&blast_rank=4AJ311523.1）相比，變異程度均小于7（見表1），所編碼的氨基酸序列亦無變化。1610 1620 1630 1

16、640 1650 1660 1670 1680 16905He/80CCCTCCAAGT GGAAACCATC CAGACAGCTC AGCGGTGCGA CCACTCCGAT AGCATCAGAA TCCTTGGCGA GAACATCAAG ATACTGH1766 C G TCT V TC G C ACQZ130 CQZ139 CQZ145 CQZ166 CQZ168 CQZ182 CQZ183 CQZ190 CQZ191 CQZ192 CQZ193 CQZ194 CQZ195 CQZ196 CQZ197 CQZ641 表1.擴增片段序列與BDV標準株He/80、H1766和V序列比對討論近

17、年來許多國家尼巴病毒（NiV）和西尼羅河病毒（WNV）腦炎的暴發(fā)流行，導致感染區(qū)內數千人短時間內迅速死亡；2004年以來爆發(fā)的禽流感病毒等都引起了人類極度恐慌和巨大的經濟損失。這些疾病的出現(xiàn)引起了研究者們對新發(fā)病毒感染性疾病的高度關注。BDV可能也是新發(fā)病毒感染性疾病中的一種病原體，研究者們近年亦對其進行了廣泛的研究，已有的研究6表明動物的BDV自然感染主要分布地區(qū)在歐洲、北美洲，主要感染動物是馬和綿羊。最初的研究認為僅選擇性在中樞神經系統(tǒng)的神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞中持續(xù)復制，但近來發(fā)現(xiàn)周圍神經、血液、胸腺及骨髓中的非神經細胞也是其復制部位7。因此，在外周血進行BDV檢測發(fā)現(xiàn)陽性時提

18、示可能同時存在中樞神經系統(tǒng)感染。BDV病毒是一種相對保守的病毒，從目前來源于馬的分離株H1766、strain V等來看，其基因序列存在高度同源性。多數國外研究中采用抗原和抗體等免疫學方法檢測BDV，近年來也開始使用分子生物學技術檢測BDV核酸。對BDV的核酸檢測中，普通PCR檢測方法可能敏感性不夠，導致出現(xiàn)假陰性結果的可能較大。巢式RT-PCR有很高的敏感性和特異性，可檢出每份標本中10100個BDV基因拷貝，但是存在反應結束后必須進行電泳才能明確檢測結果的問題。本研究對常規(guī)的巢式RT-PCR方法做了改進，在第二輪PCR過程中加入熒光探針，改進后的方法具有以下優(yōu)點：進一步增加了反應的特異性；

19、可以直觀的觀察PCR反應的結果；避免常規(guī)巢式RT-PCR反應后電泳等操作，減少了工作量；可對第二輪反應開始時的模板進行定量。此外研究也提示若標本保存處理不當可出現(xiàn)假陽性10。另外在我們的研究中都盡可能嚴格試驗分區(qū)，很好的避免了實驗室污染引起的假陽性結果，另外探針的引入增強了檢測的特異性，減少了擴增后產物處理的污染導致假陽性的可能8，9。 幾千年以來，重慶及三峽庫區(qū)居民獲取肉食資源的方式基本上主要都通過飼養(yǎng)家豬解決肉食問題，而重慶地區(qū)是我國大的生豬飼養(yǎng)基地，其中部分種豬還由德國、加拿大等國引進10，使國外疫病病原如博爾納病毒等有可能輸入該地區(qū)。另外隨著三峽水庫建成和由此引起的該地區(qū)生態(tài)環(huán)境巨變，

20、使其很可能會成為一個十分危險的疫源地，一種或多種新發(fā)生感染性疾病很可能在該地區(qū)首先出現(xiàn)，并迅速擴散到全地區(qū)并引起全國大流行甚至爆發(fā)流行（SARS/禽流感已經提供了先例），因此，加強該地區(qū)新發(fā)生感染疾病的系統(tǒng)監(jiān)測和進行深入研究已經成為當務之急。本研究關注重慶及三峽庫區(qū)豬的博爾納病毒自然感染情況，對360例豬的PBMCs進行了BDV檢測。結果發(fā)現(xiàn)所采集的豬外周血中BDV 陽性率均為4.44 (16360)，基因序列分析結果表明,重慶地區(qū)豬感染的BDV 的核苷酸序列與BDV 標準病毒株He/80（Access Number：L27077） 序列完全一致，同源性為86/86 (100.00%).這說明

21、重慶及三峽庫區(qū)健康豬中存在BDV 的自然感染。結合近年徐平等采用同樣的方法對來源于重慶地區(qū)的帕金森病、格林巴利綜合征、精神分裂癥患者、病毒性腦炎等疾病患者中檢測出BDV P24 片斷的報道11-12、趙立波等對重慶地區(qū)的山羊和家雞家鴨中BDV P24 片斷的檢出報道5，要考慮重慶地區(qū)有可能是BDV的流行地區(qū)之一。目前檢出的陽性樣本主要來自本地，但由于缺乏BDV分離株及其廣泛的分子流行病學研究，尚無法做出全面的解釋。因此需要加強BDV毒株分離，進行廣泛的分子流行病學研究，進一步揭示BDV的流行規(guī)律，為預防和控制BDV的流行打下基礎。參考文獻1 Fiona Wooda,Michael J. Blo

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