HiScreen預(yù)裝柱

1、GEHealthcareHiScreen層析柱數(shù)據(jù)文件28-9305-81AAHiScreen預(yù)裝柱HiScreen層析柱是GEHealthcare提供的匸藝過程開發(fā)平臺(tái)的一部分，圖1。這類層析柱預(yù)裝一系列BioProcess填料，被設(shè)計(jì)用J：進(jìn)行方法優(yōu)化和參數(shù)篩選。HiScree層析柱的柱床體積很小(4.7ml),減少了樣品和緩沖液的消耗。在HiScree層析柱中使用的填料還可用其它類型的層析柱均有人包裝層析填料，用從工藝開發(fā)到常規(guī)生產(chǎn)的不同規(guī)模的純化。HiScree層析柱有許多優(yōu)點(diǎn)：預(yù)裝十三種不同的BioProcess介質(zhì)，方便用于工藝開發(fā)由于只有10cm的柱床高度，因此極好的用于方法優(yōu)化

2、和參數(shù)篩選可輕松地串聯(lián),從而得到20cm的床高小柱床體積，可以快速得到結(jié)果，且樣品/緩沖液消耗最小結(jié)果具有良好的重復(fù)性，并通過填充相同的介質(zhì)以及使用和同的線性液體流速直接放人至BioProcess層析柱。圖l.GEHealthcare的過程開發(fā)平臺(tái)。圖2.預(yù)填充有BioProcess介質(zhì)的HiScreen層析柱，用丁T藝開發(fā)研究中的方法優(yōu)化，使用方便，結(jié)果具有重復(fù)性。穩(wěn)健性HiScreen層析柱預(yù)填充何穩(wěn)定的介質(zhì)，可以重復(fù)使用且結(jié)果具有良好的重復(fù)性。同樣的層析柱在重復(fù)使用10次以后対其動(dòng)態(tài)吸附容鼠(DBC)進(jìn)行測(cè)定，以確定其穩(wěn)定性。方案應(yīng)根據(jù)不同的介質(zhì)屬性進(jìn)行選擇，數(shù)據(jù)見第5頁和第7頁。方法優(yōu)

3、化和參數(shù)篩選當(dāng)需要進(jìn)行一項(xiàng)新的工藝開發(fā)時(shí)，需要在較小規(guī)模卜對(duì)一些參數(shù)如選擇性，容最，吸附和洗脫條件進(jìn)行篩選，以節(jié)省時(shí)間和金錢。10cm柱床高度具備足夠的保留時(shí)間，從而可作為線性工藝放人的基礎(chǔ)。如需要，兩個(gè)柱子可以很輕松地進(jìn)行串聯(lián)，從而得到20cm的柱床高度。放大層析步驟的放人可以通過直接增加層析柱直徑來滿足更人的上樣體積，同時(shí)床高和線性流速保持不變。由層析柱的柱床高度特點(diǎn)，以及可以將兩個(gè)層析柱在一個(gè)部件(見配件部分)內(nèi)進(jìn)行連接從而獲得20cm的柱床高度，使得該層析柱非常適合工藝開發(fā)過程的使用。HiScreen層析柱在過程開發(fā)中主耍用于三個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域：柱體積4.7ml親和層析：柱規(guī)格0.77x10

4、cmHiScreenNiFF最人流速*2-6nil/mm(240700cm/h)HiScreenIMACFF推薦流速*0.8-5ml/min(100-600ciwh)HiScreenBlueFF最大回壓3bar(OJNIPa)對(duì)單克隆抗體（MAb）進(jìn)行捕獲：拿取決丁介質(zhì)木身HiScreenMabSelectSuReHiScreenMabSelectHiScreenMabSelectXtra離子交換層析(IEX)HiScreenCaptoQHiScreenCaptoSHiScreenCaptoDEAEHiScreenCaptoMMCHiScreenCaptoadliereHiScreenQFFH

5、iScreenSPFFHiScreenDEAEFFHiScreenQHPHiScreenSPHP疏水作用層析(HIC)HiScreenButylFFHiScreenButyl-SFFHiScreenOctylFFHiScreenPhenylFF(highsub)HiScreenPhenylFF(lowsub)HiScreenPhenylHP層析柱特性HiScreen層析柱采用生物兼容性良好的聚丙烯材料制成，不會(huì)與其他的生物分子產(chǎn)生相互作用。層析柱可在蠕動(dòng)泵或?qū)游鱿到y(tǒng)如AKTAdesignI、進(jìn)行操作。層析柱運(yùn)輸過程中其入II和出II處用龕子進(jìn)行封閉。表1列出了HiScreen層析柱的一些特性。

6、提示:HiScreen層析柱不能打開或重新填充。表lJiiScreen層析柱的特性介質(zhì)特性MabSelectHiScreenMabSelectSuRe,HiScreenMabSelect和HiScreenMabSelectXtra層析柱均預(yù)填充有MabSelect蛋白A衍生介質(zhì)，用J：對(duì)單克隆抗體（MAbs）的捕獲。HiScreenMabSelect介質(zhì)特性見卜和表2。MabSelectSuRe設(shè)計(jì)時(shí)選用耐堿蛋白A衍生配體，可采用0.1-0.5M氫氧化鈉進(jìn)行在位清洗（CIP）。MabSelect專為快速純化人體積樣本中的單克隆抗體而設(shè)計(jì)，可與工藝放人過程中高流速和高操作壓耍求和匹配。MabSe

7、lectXtra專為獲取最人吸附容最而設(shè)計(jì)，可用單克隆抗體表達(dá)水平高的樣品的吸附。CaptoIEXHiScreenCaptoQ,HiScreenCaptoS,HiScreenCaptoDEAE,HiScreenCaptoMMC和HiScreenCaptoadhere層析柱填充有CaptoIEX介質(zhì)，可進(jìn)行捕獲和中間過程的純化。Capto介質(zhì)可作為常規(guī)工具在人規(guī)模生物過程運(yùn)作中運(yùn)用。Capto臬質(zhì)慕高強(qiáng)度的瓊脂糖，孔結(jié)構(gòu)經(jīng)過優(yōu)化，提供良好壓力/流速特性oCapto介質(zhì)結(jié)合了高容鼠，高流速和低回壓等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此很人程度上減少了工藝的循環(huán)數(shù)，并提升了產(chǎn)率。CaptoIEX基質(zhì)特性見下和表3。Cap

8、toS,CaptoQ和CaptoDEAE分另U為強(qiáng)陽離子，強(qiáng)陰離子和弱陰離子交換介質(zhì)。其帶電基團(tuán)與高流動(dòng)性瓊脂糖基質(zhì)相偶聯(lián)，瓊脂糖基質(zhì)采用葡聚糖表而増最劑進(jìn)行修飾，進(jìn)一步提升了容鼠和質(zhì)龜傳遞能力。CaptoS和CaptoQ作為強(qiáng)的離子交換劑，能在很寬的pH范禺保持電荷特性和功能,IfljCaptoDEAE為弱離子交換劑，其離子交換容磧具有pH値依賴性。此外，兩種陰離子交換介質(zhì)，CaptoQ和CaptoDEAE在選擇性上有所差異。CaptoMMC上偶聯(lián)有創(chuàng)新的耐鹽配體,可允許在上樣物質(zhì)導(dǎo)電性卜進(jìn)行蛋白吸附。CaptoMMC屬J：部分弱陽離子交換劑，同時(shí)還利用了氫鍵和疏水作用對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離。由J：

9、與目標(biāo)分子相互作用存在多樣性，因此CaptoMMC可作為傳統(tǒng)離子交換介質(zhì)外的又一選擇，CaptoMMC實(shí)際上是一種多模陽離子交換劑。Captoadhere是具有多模功能的強(qiáng)陰離子交換劑。多模功能性使其成為傳統(tǒng)陰離子交換劑外的又一選擇。Captoadhere設(shè)計(jì)在蛋白A純化單克隆抗體后進(jìn)行使用。在流穿模式卜，由層析柱的多模特性，抗體直接流出柱體，而溶出的蛋白A,聚合物，宿主細(xì)胞蛋白，核酸以及病毒等污染物則被吸附在柱上從而與抗體分開而被清除。表2.M2bSelect介質(zhì)特性MabSelectMabselectXtraMabSelectSuRe基質(zhì)強(qiáng)韌,高度交聯(lián)的瓊脂糖強(qiáng)韌,高度交聯(lián)的瓊脂糖強(qiáng)韌,高

10、度交聯(lián)的瓊脂糖配體重組蛋白A(大腸桿菌重組蛋白A(大腸桿菌)堿穩(wěn)定蛋白A衍生(大腸桿菌顆粒大小do/S5.mi75|im85j.im吸附能力約30mg人IgG/nil介質(zhì)約40mg人IgG/ml介質(zhì)約30mg人IgG/ml介質(zhì)？推薦流速100到500emF100到300cmi?100到500emh4PH穩(wěn)定性短期2至122至122至14長(zhǎng)期3至103至103至121如是指累計(jì)體枳分布的顆粒大小中間值2在柱床高度為20cm即停昭時(shí)間為2.4mm涼動(dòng)相流速為500cm.h.以及10%穿透惜況卜通過詢段分析法進(jìn)行測(cè)獻(xiàn)。停留時(shí)間等丁樣詁上樣時(shí)的柱床爲(wèi)度(cm)除以標(biāo)稱滾速(cmS。標(biāo)稱流速等丁體積流速

11、(mlh除以橫假聞積(cm2)在柱床高度為10cm即停昭時(shí)間為2.4mm涼動(dòng)相流速為250cmh以及10%穿透惜況門通過詢段分析法進(jìn)行測(cè)比25C時(shí)BPG300層析柱的柱床高度為20cm,操作壓=1.5bar.20弋時(shí)填充床高度為20cm,水操作壓=1.5bar。&小J*3(fjpHffiWIJr洗脫強(qiáng)吸附的抗體物質(zhì).然而.蛋門配體在極低的pH環(huán)境卜會(huì)發(fā)生水解；短期pH：介質(zhì)功能不發(fā)生明顯改變的在位淸洗或在位滅菌pH區(qū)間。長(zhǎng)期pH：功能不發(fā)生明顯改變的介質(zhì)I.作pH區(qū)間*表3.CaptoIEX介質(zhì)特性基質(zhì)顆粒大小，如帶電基團(tuán)CaptoQCaptoSCaptoDEAE高流動(dòng)瓊脂糖，并帶窗聚糖表而増

12、戢劑90pm.n*（ch3）390pm-SOfCH2CH3）2總離子容嵐0.16到0.22minolC17ml介0.11到0.14minolNa7ni1介0.29至lj035nmiolCT/ml介質(zhì)推薦流速質(zhì)質(zhì)在溫度為20C,柱床高度為20cm的1m層析柱的過程緩沖液推薦流速為700cm/h其中過程緩沖液在操作壓3bar(0.3MPG時(shí)粘滯度與水郴同。CaptoMMCCaptoadhere高度交聯(lián)瓊脂糖75pmvXz6xX/c75pm0.07到0.090.09到0.12nimolH7ml介mmolC17ml介質(zhì)質(zhì)在溫度為20C柱床高度為20cm的1m層析柱的過程緩沖液推薦流速為至少為600cn

13、ih.其中過程緩沖液在操作壓3bar(03MPa)時(shí)具備和水柑同的粘滯度。pH穩(wěn)定性2短期長(zhǎng)期2至143至142至142至124至122至122至142至142至123至12|(1派.是指累計(jì)體枳分布的顆粒大小中間值2短期PH*介質(zhì)功能不發(fā)生明顯改變的力位淸洗或在位滅WpH|x|iiJ;長(zhǎng)期PH：功能不發(fā)生明眾改變的介質(zhì)I作pHIX間。疏水作用層析介質(zhì)HiScreenPhenylFF(highsub),HiScreenPhenylFF(lowsub),HiScreenButylFF,HiScreenButyl-SFF和HiScreenOctylFF均屬J：疏水作用層析(HIC)柱。所有的介質(zhì)都

14、采用高度交聯(lián)的瓊脂糖珠基質(zhì)SepharoseFastFlow,同時(shí)又具備不同的固定化疏水配體。這些HIC介質(zhì)設(shè)計(jì)用捕獲純化和中間純化，具有良好的流動(dòng)特性和高度的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。這些介質(zhì)均為耐堿介質(zhì)，可允許使用0.5-1.0M的氫氧化鈉進(jìn)行在位清洗(CIP)oHiScreenHIC介質(zhì)的屬性如右和表4中所示。PhenylSepharose6FastFlow采用高或低程度的取代苯基，從I而獲得一系列具有不同選擇性，效能和吸附容杲的介質(zhì)。該系列介質(zhì)対中至高疏水性介質(zhì)要求的純化尤為適用。Butyl-SSepharose6FastFlow適用J低鹽濃度卜對(duì)疏水較強(qiáng)的分子的純化，如生物樣品中脂質(zhì)，脂蛋白

15、和色素等的去除。該系列為GEHealthcare系列產(chǎn)品中疏水性最低的介質(zhì)。ButylSepharose4FastFlow和OctylSepharose4FastFlow適用叫度或低至中度疏水純化，能在極低的鹽濃度卜有效工作。OctylSepharose4FastFlow貝有與苯基和J基配體不同的疏水特性，是其他疏水介質(zhì)產(chǎn)品的重耍補(bǔ)充。表4.HiScreenHIC介質(zhì)的特性PhenylSepharose6FastFlow(HighSub)PhenylSepharose6FastFlow(lowSub)Butyl-SSepharose4FastFlowButvl-SSepharose6FastF

16、lowOctylSepharose4FastFlow基質(zhì)6%交聯(lián)瓊脂糖6%交聯(lián)瓊脂糖4%交聯(lián)瓊脂糖6%交聯(lián)瓊脂糖4%交聯(lián)瓊脂糖珠珠珠珠珠疏水配體苯基苯基丁基丁基辛基-o-O-(P(CHJ廠CHj一S-(CHJ廠CH,-(P(CHJ-CH5配體密度40gmolnil介質(zhì)25pmol/ml介質(zhì)40pmol/ml介質(zhì)lOpmoLinl介質(zhì)5gmolinl介質(zhì)顆粒大小山“】90pm90pm90j.un90pm90pm最大流速450cm/h450cm/h240cm/h450cm/h240cm/h推薦流速300cm/h300cm/h150cm/h300cm/h150cm/hpH穩(wěn)定性2短期2至142至14

17、2至142至142至14長(zhǎng)期3至133至133至133至133至13d新是指累計(jì)體枳分布的顆粒大小平均值2短期pH：介質(zhì)功能不發(fā)生明顯改變的在位淸洗pH區(qū)間.長(zhǎng)期pH：功能不發(fā)生明顯改變的介質(zhì)l.fVpHI*何.HiScreenMabSelect/.HiScmenMabSelectXtra介質(zhì)的穩(wěn)健性研究HiScreenMabSelectXtra穩(wěn)健性通過對(duì)相同的層析柱重復(fù)進(jìn)行十次試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)樣品為含IgG的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清（圖3）。每次試驗(yàn)后用含50mM的lMNaCl進(jìn)行在位清洗（CIP）。每十五次試驗(yàn)前后對(duì)動(dòng)態(tài)吸附容起（DBC）進(jìn)行比較，測(cè)起柱性能的改變（表5）。每次試驗(yàn)的產(chǎn)竜通過

18、280nm紫外吸收值進(jìn)行測(cè)鼠（圖4）。與初始結(jié)果相比，DBC的改變小J：5%。所有的十次試驗(yàn)中產(chǎn)最人約為110mg,且非常穩(wěn)定。結(jié)果顯示產(chǎn)帚或DBC沒有礪顯的改變且純度非常高（圖4和5）?？偟膩碚f，HiScreenMabSelectXtra適合用J：方法優(yōu)化，為過程開發(fā)提供卓越的穩(wěn)健性。試驗(yàn)條件HiScreenMabSelectXtra,4.7ml470ml的CHO細(xì)胞上清.IgG平衡和清洗h25mM磷酸鈉.500mM虹化鈉.pH7.4緩沖液更換和25mM磷酸鈉.25mM酷酸鈉、pH7.5洗駆25mM磷酸鈉,25mM醋酸鈉,pH3.5CIP:50mNI包氧化鈉,1MX化鈉.流速為1潦速:mlm

19、in(130cmh)2.3mlnun(300cnrh),停留時(shí)何為2min動(dòng)態(tài)吸附容量（DBC）*3.6mg,ml.人IgGGammanonnOctapharma平衡和清洗:20mM磷酸鈉，150mM虹化鈉,pH7.4洗脫100mM檸檬酸鈉,pH3.0CIP:50mM疑氧化鈉,IM奴化鈉流速為1漁速:mlmin(130cmh)23mlmin(300cm.h),停留時(shí)間為2mm系統(tǒng):AKTAexplorer105BC定義為柱洗脫物濃度達(dá)到樣品濃度10%時(shí)何ml介質(zhì)的人IgG上樣就mg。UNICORN方法平衡:10倍體積（CV）上樣體枳:100CV6CV級(jí)沖液更換和清洗23CV洗鋭直到吸收值低l*

20、200mAU平衡:10CVCIP:10ml（接觸時(shí)間為10min）平衡:10CVnUjMW-=1fi環(huán)1環(huán)5xa.=循環(huán)10c.L4血血垃lrm圖4.HiScreenMabSelectXtra的穩(wěn)健性研究中循環(huán)1到循壞10的產(chǎn)雖（mg）。表5.起始,循環(huán)5和循環(huán)10后的DBCHiScreenMabSelectXtra人IgG的DBC(ing/ml介質(zhì))差異(%)新層析柱37-循環(huán)1到5后39+5循環(huán)6到10后39十4N8?0：0UOZOJgirKOj旳dJ-14曲j泳道12初始丿1:13初始彳1:5稀釋4洗脫,MabSelectXtra,循環(huán)11:100稀釋5洗脫,MabSelectXtra,

21、循環(huán)21:100稀釋6洗脫,MabSelectXtra,循環(huán)31:100稀釋7洗脫,MabSelectXtra,循環(huán)41:100稀釋S洗脫,MabSelectXtra,循環(huán)51:100稀釋9流穿,MabSelectXtra,循環(huán)1-51:5稀釋10洗脫,MabSelectXtra,循環(huán)6100稀釋11洗脫,MabSelectXtra.循環(huán)7100稀釋12洗脫,MabSelectXtra,循環(huán)S100稀釋13洗脫,MabSelectXtra,循環(huán)9100稀釋14洗脫,MabSelectXtra,循環(huán)101:100稀釋15流穿,MabSelectXtra,循環(huán)6-101:5稀釋16低分子量標(biāo)準(zhǔn)（L

22、MW）圖5還廉條件下SDS（ExcelGelSDS梯度8-18）考馬斯亮藍(lán)染色。對(duì)HiScreenMabSelectXtra上收集的10次洗脫峰混合物進(jìn)行分析。圖3.循環(huán)次數(shù)分別為1,5和10的HiScreenMabSelectXte色譜圖。循環(huán)1二藍(lán)色，循環(huán)5二橙色，循環(huán)10=紅色。XJ3DD911Ti7?2不同HiScreenMabSelect層析柱的吸附容量的比較容鼠是抗體純化最重要的參數(shù)因此，測(cè)起工藝開發(fā)中每個(gè)單獨(dú)抗體在不同環(huán)境卜的吸附容起對(duì)J發(fā)現(xiàn)最佳的介質(zhì)和吸附/洗脫條代，獲得最佳的終產(chǎn)物生產(chǎn)方法非常重耍。在這些實(shí)驗(yàn)中，通過比較HiScreenMabSelectSuRe,HiScre

23、enMabSelect和HiScreenMabSelectXtra三種不同停留時(shí)間卜的動(dòng)態(tài)吸附容看，對(duì)容鼠進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明HiScreenMabSelectXtra貝有最大容量,這一點(diǎn)與停留時(shí)間無關(guān)(圖6)。HiScreenMabSelectSuRe容啟比HiScreenMabSelect容竜有輕微的增高。在不同停留時(shí)間卜的容最差異更凸顯了優(yōu)化這些參數(shù)的重要性。實(shí)驗(yàn)條件層析柱:HiScreenMabSelectSuRe.4.7mlHiScreenMabSelect,4.7mlHiScreenMabSelectXtra.4.7m樣晶:3.6mgml.人gG.GainmanormOctaphar

24、ma,平衡粒清洗:20mM璘酸鈉，150mNINaCLpH7.4洗猊:100mM酷酸鈉,pH3.0在位清洗:50mMNaOH.1MNaCl(HiScreenMabSelect,和HiScreenMabSelectXtra)流速為1mlmin(130cmh)0.5MNaOH(HiScreenMabSelectSuRe).流速為1ml.min(130cmli)流速:1.15-3.9mlmin(150-500emh)系統(tǒng):AKTAexplorer10不同HiScreenMabSelect層析柱的動(dòng)態(tài)吸附容童:停留時(shí)間(min)cin-h:ml-minill圖6HiScreenMabSelectSuR

25、eHiScreenMabSelect和HiScreenMabSelectXtra的人IgG動(dòng)態(tài)吸附容呈(DBC)比較。3.HiScreenMabSelectSuRe到填充有MabSelectSuRe介質(zhì)的XK16/20層析柱的工藝放大這一應(yīng)用表明HiScreenMabSelectSuRe(4.7ml)可叔人至填充MabSelectSuRe介質(zhì)的XK16/20層析柱(21.5ml,柱床高度為10.7cm),放人4.6倍。放人過程線性流速保持恒定，樣品體積根據(jù)柱體積等比例增加。相同的UNICORN方法適用J：兩種不同的層析柱，僅需要在體積流速上進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑黾?。?duì)兩種層析柱的結(jié)果進(jìn)行比較(圖7和8)

26、。兩種層析柱貝有類似的結(jié)果(表6),極高的純度和相同的產(chǎn)率(97%)?？傮w而言，層析柱放人后純化步驟的層析柱性能仍得到保持。實(shí)驗(yàn)條件層析柱:HiScreenMabSelectSuRe,(0.77x10cm),4.7ml填充MabSelectSuRe介質(zhì)的XK16/20(1.6x10.7cm),21.5ml樣品:319ml或1508ml(75CV),CHO細(xì)胞培養(yǎng)上淸.IgC平衡和25mW璘酸鈉，500mMNaCl,pH7.4清洗緩沖液25刃璘酸鈉，25醋酸鈉，pH7.5更換和清洗2:洗脫:25叢璘酸鈉，25mM醋酸鈉，pH3.5CIP:0.5MR0H流速為130cm/h流速:HiScreenM

27、abSelectSuRe:3.9mlmin(500cmh),停留時(shí)間1.2min煩允MabSelectSxiRe介質(zhì)的XK16/20:16.8ml/min(500cmli)停留時(shí)間1.2nun系統(tǒng):AKTAexplorer100洗脫堆用0.1MNqOH進(jìn)行中和。UNICORN方法平衡:10cv上樣體75CV枳:侖洗6CV緩沖液3CV更換和清洗2:洗脫:直至吸收峰低J-200mAU平衡:10CVCIP:10ml或、46ml(10曲“接觸時(shí)間)平衡:10CV圖7來HiScreenMabSelectSuRe(藍(lán)色)和填充MabSelectSuRe介質(zhì)的XK16/20層析柱(橙色的洗脫峰的紫外吸收曲線

28、(280nm)疊加圖。表6產(chǎn)雖(mg)和產(chǎn)率()濃度產(chǎn)量產(chǎn)率(nig/ml)(mg)(%)HiScreenNIabSelect10.2SI97SuRe(4.7ml)填充MabSelectSuRe介質(zhì)的XK9.23539716/20層析柱(21.5ini)HiScreenCaptoQWW0U4-：J泳道1低分子址標(biāo)準(zhǔn)2初始材料1:2稀釋流穿.HiScreenMabSelectSuRe1:2稀釋流穿.境充MabSelectSuRe介質(zhì)的XK16/20析柱1:2稀釋洗脫.HiScreenMabSelectSuRe.1:30稀釋洗脫.境充MabSelectSuRe介質(zhì)的XK16/20析柱.1:30稀釋

29、圖8.還凍條件下SDS(ExcelGelSDS梯度S-18)考馬斯亮藍(lán)染色。樣品上樣體積根據(jù)洗脫成分的濃度進(jìn)彳亍調(diào)整。(HiScreenMabSelectSuRe洗脫成分的濃度比填充MabSelectSuRe介質(zhì)的XK16/20層析柱的洗脫成分濃度高大約10%)o1.HiScreenCaptoQ的穩(wěn)健性研究本項(xiàng)研究中，兩根HiSxieenCaptoQ層析柱串聯(lián)相接得到20cm的柱床高度，通過十次重復(fù)試驗(yàn)對(duì)其穩(wěn)健性進(jìn)行測(cè)試。使用的樣品為超聲處理過的澄清化的丿、腸桿菌勻漿物。每次試驗(yàn)后用1M的氫氧化鈉溶液進(jìn)行在位清洗。通過比較每五次試驗(yàn)前后的動(dòng)態(tài)吸附容量対柱性能進(jìn)行衡量。與最初結(jié)果和比，所得動(dòng)態(tài)吸

30、附容最變化6%,表明串聯(lián)相接的兩根柱子在反復(fù)加載人腸桿菌勻漿樣晶和采用1M氫氧化鈉清洗;后仍能得到穩(wěn)健和重復(fù)的結(jié)果(圖9和表7)。試驗(yàn)條件層折柱:2xHiScreenCaptoQ,93ml樣品930ml澄淸化的大腸桿菌勻漿物平衡和淸洗50mMTns,pH8.0洗脫:50mMTris,1MNaCLpH&0cip：1MNaOH流速1.5mlmin(190crnh)再生:50mMTris,3MNaCLpH&0潦速:3.5mlinin(450cnrli),停留時(shí)間2.6min系統(tǒng):AKTAexplorer100動(dòng)態(tài)吸附容量(DBC)樣品:4mg/ml牛血淸白蛋門(BSA)平衡和沽洗:50mMTns,p

31、H8.0洗脫:50mMTris,1MNaCLpH&0cip：1MNaOH流速1mlmin(130emh)系統(tǒng):AKTAexplorer10UNICORN方法TOC o 1-5 h z平衡:6CV上樣蚩:10CV清洗:10CV洗脫:5CVcip：5CV(15mm接觸時(shí)間)再生:2CVHiScreenCaptoQHiScreenCaptoQHiScreenCaptoQ圖9將兩根HiScreenCaptoQ層析柱串聯(lián)相接得到20cm的柱床高度。將循環(huán)1,5和10的色譜圖進(jìn)行疊加。循環(huán)1=藍(lán)色，循環(huán)5=綠色，循環(huán)10=橙色，導(dǎo)電性=紅色。表7.循環(huán)5和10前后的動(dòng)態(tài)吸附容雖新柱循環(huán)1到5后循環(huán)6到10

32、后2xHiScreenCaptoQBSA的動(dòng)態(tài)吸差異()附容雖(ing/ml介質(zhì))TOC o 1-5 h z18S-176-6179-52.的HiScreenCaptoQ層析該應(yīng)用說明兩根串聯(lián)相連的HiScreenCaptoQ層析柱（9.3ml,20cm柱床高廈）如何放人至填充CaptoQ的XK16/40層析柱（36mb18cm柱床高度）。樣品為綠色熒光蛋白（GFP）,由人腸桿菌表達(dá)，上樣前經(jīng)超盧和澄清化處理。放人過程中，保持線性流速恒定，樣品體積根據(jù)柱體積等比例增力I。兩種層析柱得到和似的結(jié)果，純化因子人約10倍（表8,圖10和11）。HiScreen層析柱上的產(chǎn)吊偏低，這很可能與系統(tǒng)Z間存

33、在微弱差異有關(guān)。2.的HiScreenCaptoQ層析2.的HiScreenCaptoQ層析意的是兩次試驗(yàn)Y軸值不同。實(shí)驗(yàn)條件UNICORN方法圧析柱：2xHiScreenCaptoQ.(0.77x20cm).平衡：6CV9.3ml上樣:14CV境充CaptoQ的XK16/40(1.6x18cm).梯度洗脫步驟：6CV10%洗脫緩沖液,6CV33%36ml洗脫緩沖液,4CV100%洗脫緩樣骷：大腸桿情衣達(dá)的綠色熒光蛋門（GFP）、沖液分子址大約28000.pl6.2CIP:5CV起始緩沖液:50mMTris.pH8.2再平術(shù):3CV洗脫緩沖液:50mMTris.lMNaCl.pHS.2梯度步舔

34、：步躱1:10%洗脫緩沖液，步驟2:33%沖液.步SB:100%洗脫緩沖液2.的HiScreenCaptoQ層析2.的HiScreenCaptoQ層析表8具有20cm床高的兩種不同層析柱規(guī)格的比較層析柱樣品體積（ml）洗脫成分（ml）濃縮因子產(chǎn)率（）純化因子2.的HiScreenCaptoQ層析2.的HiScreenCaptoQ層析HiScreenCaptoQ,9.3ml13456填充CaptoQ的XK16/40,36ml5012132.4889.7239510.5品冋MmJDM3JDXW圖IL還原條件下SDS（ExcelgelSDS梯度S18）考馬斯亮藍(lán)染色。1低分子就標(biāo)準(zhǔn)2初始材料覽充Ca

35、ptoQ的XK16/40出析柱1:10稀釋3流穿塡允CaptoQ的XK16/40出析柱1:10稀釋4洗脫成分步驟1覽充CaptoQ的XK16/40出析柱1:30稀釋5洗脫成分步驟2覽充CaptoQ的XK16/40出析柱1:30稀釋67洗脫成分步驟3低分子竝標(biāo)準(zhǔn)覽充CaptoQ的XK16/40出析柱1:30稀釋8初始材料2XHiScreenCaptoQ層析柱1:10稀釋9流穿2XHiScreenCaptoQ層析柱1:10稀釋10洗脫成分步驟12XHiScreenCaptoQ層析柱1:30稀釋11洗脫成分步驟22XHiScreenCaptoQ層析柱1:30稀釋1213洗脫成分步驟3低分子就標(biāo)準(zhǔn)2X

36、HiScreenCaptoQ層析柱1:30稀釋泳道HiScreenHIC層析柱不同HIC介質(zhì)的選擇性篩選在以卜的篩選實(shí)驗(yàn)中，由不同疏水特性的影響，HiScreenHIC層析柱家族的選擇性效果如下所示（圖12）。模型蛋白混合物通過和同方法和緩沖液進(jìn)行分離，并采用10倍柱體積（CV）的鹽濃度線性遞減的洗脫液對(duì)結(jié)合蛋白進(jìn)行洗脫?；|(zhì)，配體以及配體取代程度會(huì)影響介質(zhì)最終的疏水性，從而影響整個(gè)介質(zhì)的選擇性。HIC介質(zhì)的吸附容起隨配體密度的増加而増加，直到某一水平。同時(shí)，相互作用強(qiáng)度隨之增加，以及更多強(qiáng)作用的成分產(chǎn)生。其他影響HIC吸附，分辨率，選擇性以及回收率的參數(shù)包括：基質(zhì)類型樣品性質(zhì)流速鹽類型和濃度

37、溫度添加劑配體，鹽類型和濃度等的選擇往往需要經(jīng)驗(yàn)，并且每次分離必須通過篩選實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確立。I、面結(jié)杲更加肯定當(dāng)采用HIC介質(zhì)進(jìn)行純化時(shí)經(jīng)驗(yàn)試驗(yàn)是非常必要的。實(shí)驗(yàn)條件圧析柱:HiScreenButylEF.4.7ml.HiScreenButyl-SFF,4.7ml,HiScreenOctylFF,4.7HiScreenPhenylFF(highsub).4.7ml,HiScreenPhenylFF(lowsub),4.7ml細(xì)胞色索C.垓橢孩旃A.A乳球蛋口和a糜蛋門胡原的混介物。用起始緩沖液溶骼濃度為6mg蛋Mml（比例為1:1:1:1）起始和淸洗緩沖液:0.1MNa:HPO4,1.7M(NHSOtpH7.0流速:HiScreenButyl-SFF,HiScreenPhenylFF(highsub),HiScreenPhenylFF(lowsub):2.3mlnun(300cm/li),HiScreenButylFF.HiScreenOctylFF:1.2mlmin(150cmh)線性梯度:10個(gè)柱體枳的0-100%洗脫緩沖液AKTAexplorer100圖12不同HiScreen