DNA提取方法(二)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專(zhuān)心-專(zhuān)注-專(zhuān)業(yè)專(zhuān)心-專(zhuān)注-專(zhuān)業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專(zhuān)心-專(zhuān)注-專(zhuān)業(yè)1、真核細(xì)胞DNA的制備一般真核細(xì)胞基因組DNA 有107-9bp，可以從新鮮組織、培養(yǎng)細(xì)胞或低溫保存的組織細(xì)胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細(xì)胞，隨后用酚抽提而實(shí)現(xiàn)的。這一方法獲得的DNA不僅經(jīng)酶切后可用于Southern分析，還可用于PCR的模板、文庫(kù)構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)。根據(jù)材料來(lái)源不同，采取不同的材料處理方法，而后的DNA提取方法大體類(lèi)似，但都應(yīng)考慮以下兩個(gè)原則：1、防止和抑制DNase對(duì)DNA的降解。2、盡量減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪切破

2、壞。試劑準(zhǔn)備：1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。3、裂解緩沖液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。4、20%SDS5、2mg/ml 蛋白酶K6、Tris飽和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚氯仿=11）、氯仿7、無(wú)水乙醇、75%乙醇試驗(yàn)步驟：材料處理：1、新鮮或冰凍組織處理：1)取組織塊0.3-0.5cm3剪碎，加TE0.5ml，轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿。2)將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml 離心管中。3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25m

3、l，混勻。4)60 C水浴1-3hr。2、培養(yǎng)細(xì)胞處理：1)將培養(yǎng)細(xì)胞懸浮后，用TBS洗滌一次。2)離心4000g 5min，去除上清液。3)加10倍體積的裂解緩沖液。4)50-55 C水浴1-2hr。DNA提?。?、加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min。2、離心5000g 10min，取上層水相到另一1.5ml 離心管中。3、加等體積飽和酚，混勻，離心5000g 10min，取上層水相到另一管中。4、加等體積酚/氯仿，輕輕混勻，離心5000g 10min，取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重復(fù)此步驟數(shù)次。5、加等體積氯仿，輕輕混勻，離心5000g 10min，取上層

4、水相到另一管中。6、加1/10體積的3M醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積的無(wú)水乙醇，輕輕倒置混勻。7、待絮狀物出現(xiàn)后，離心5000g 5min，棄上清液。8、沉淀用75%乙醇洗滌，離心5000g 3min，棄上清液。9、室溫下?lián)]發(fā)乙醇，待沉淀將近透明后加50-100mlTE溶解過(guò)夜。2、細(xì)菌DNA的提取方法針對(duì)一些不易于提取的細(xì)菌的方法:試驗(yàn)試劑：抽提緩沖液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素） 100mMTris-HCl(pH8.0) 25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl 10MliCl 2MliCl DEPC-water（抑制RNA酶活性） 3MNaAc(

5、pH5.2) 96%乙醇 70%乙醇試驗(yàn)步驟：1、抽提緩沖液65預(yù)熱。2、加菌體到已經(jīng)預(yù)熱的緩沖液（700ul）中混勻，65，10min。3、加酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），振蕩，以12000rpm，離心10min。4、取上清，加氯仿/異戊醇（24：1）振蕩，以12000rpm，離心10min。5、重復(fù)再作一次步驟4。6、加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇），20C下沉淀。7、以2000rpm，離心10min。8、棄上清，以70乙醇條洗沉淀，也可以再用100乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。3、較為常用的細(xì)菌DNA提取方法：實(shí)驗(yàn)步驟：1、將菌株接種于

6、液體LB培養(yǎng)基，37震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2、取1.5ml 培養(yǎng)物12000rpm離心2min。3、沉淀中加入567ul 的TE緩沖液，反復(fù)吹打使之重新懸浮，加入30ul10%SDS和15ul 的蛋白酶K，混勻，于37溫育1h.4、加入100ul5mol/LNaCl 充分混勻，再加入80ulCTAB/NaCl 溶液，混勻后再65溫育10min。5、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來(lái)，沉淀可稍加離心。6、沉淀用1ml 的70%乙醇洗滌后，離心棄乙醇4、真菌DNA提取總結(jié)的兩種方法：第一種方法：試驗(yàn)步驟：1、

7、取真菌菌絲0.5g在液氮中迅速研磨成粉。2、加入4mL提取液，快速振蕩混勻。3、加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1)，渦旋35min（此處是粗提沒(méi)有加酚）。4、以4，1000rpm，離心5min。5、上清再用等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次。以4，10000rpm，離心5min。6、取上清，加入2/3倍體積的-20預(yù)冷的異丙醇或2.5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀混勻靜置約30min。7、用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次再用無(wú)水乙醇漂洗1次吹干，重懸于500ulTE中。8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37下處理1h。9、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:

8、24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次。以4，10000rpm，離心5min。10、取上清，加入1/10倍體積的3MNaAc2.5 倍體積的無(wú)水乙醇-70沉淀30min以上。11、沉淀用75%乙醇漂洗，風(fēng)干溶于200ulTE中，-20保存?zhèn)溆?。DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1SDS， 3MNaAc。第二種方法：試驗(yàn)步驟：1、真菌菌絲0.5-1g在液氮中迅速研磨成粉。2、加入3mL65預(yù)熱的DNA提取緩沖液，快速振蕩混勻65水浴30min期間混勻2-3次。3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。4、等體積的氯仿:異戊醇(24

9、:1)抽提1次（10000rpm，4離心5min）。5、取上清，加入2/3倍體積的-20預(yù)冷異丙醇混勻靜置約30min。6、用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次再用無(wú)水乙醇漂洗1次吹干，重懸于500ulTE中。7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37處理1h。8、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次。以4，10000rpm，離心5min。9、取上清，1/10V3MNaAc2.5V體積的無(wú)水乙醇-70沉淀30min以上。10、沉淀用75%乙醇漂洗，風(fēng)干溶于200ulTE中，-20保存?zhèn)溆谩?、石蠟包埋DNA提取試驗(yàn)方法試驗(yàn)原理

10、：從石蠟包埋組織中提取DNA的基本步驟，是在常規(guī)DNA提取方法的基礎(chǔ)上改良和演變而業(yè)。Goelz 等（1985）最先提出的石蠟包埋組織DNA提取技術(shù)，是用機(jī)械的方法破碎組織，切除多余的石蠟，進(jìn)入含SDS和高濃度蛋白酶K（mg/ml）的提取緩沖液加溫孵育，然后進(jìn)行苯酚和氯仿抽提。所得DNA雖不完整，但可被限制性?xún)?nèi)切酶切割，因而適于點(diǎn)雜交，印跡雜交等多種分了生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。Dubeau 等（1986）在上述方法上作了改進(jìn)。首先通過(guò)組織切片和二甲苯和脫蠟，保證了組織的完全破碎，使細(xì)胞與消化液充分接觸，使DNA釋放和蛋白去除更加完全；其次通過(guò)兩步消化的方法，將不適于做分子雜交的降解的DNA小段去除，僅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，從而提DNA質(zhì)量，適于做Sorthern印跡雜交分析。試驗(yàn)試劑：配方：3mol/lNacl，0.3M檸檬酸三鈉 2H2O，用HCL調(diào)PH值至7。0石蠟消化液：150nmol/lNacL：15mmol/l 檸檬酸鈉，1%SDS，PH7.0。試驗(yàn)步驟：1、取蠟塊切片15-20張（8m），置