遺傳重組機制

1、第四章 遺傳重組（genetic recombination）重要性：它是產生變異和進化的主要力量之一，其機制研究有助于理解變異產生的原因，是學業(yè)考試的重點之一。關鍵掌握：1、概念、類型以及分子機制；2、基因轉變的概念與機制; 3、轉座子的種類、特點、機制、遺傳學效應及應用。參考：Daniel L. HartlGenetics: Analysis of Genes and Genomes Chapter 6 Molecular biology of DNA replication and recombination1廣義上，任何造成基因型變化的基因交流過程。非同源染色體的自由組合：不涉及DNA

2、分子內的斷裂-復合。狹義上，指涉及DNA分子內斷裂-復合的基因交流過程，有時也叫交換（crossing over）。第一節(jié)、遺傳重組的類型根據(jù)對DNA序列和蛋白質因子的要求分為: 同源重組 位點專一性重組 轉座作用 異常重組21. 同源重組（homologous recombination）需要：1）較大范圍的DNA同源序列；2）非堿基序列特異的重組蛋白質因子（RecA）例：非姐妹染色單體間的交換、細菌的轉化、轉導、結合等。2. 位點專一性重組（site-specific recombination）需要：1）小范圍的特異同源序列；2）位點專一性蛋白質因子。例： 噬菌體DNA通過其attP位點

3、與大腸桿菌DNA的attB位點之間的重組。33. 轉座（transposition）轉座因子從染色體的一個區(qū)段轉移到另一個區(qū)段或者從一個染色體轉移到另一個染色體上。不需要同源序列和RecA， 需要轉座酶，常伴隨著復制，也叫復制重組（replicative recombination）。4. 異常重組（illegitimate recombination）不需要DNA序列同源性、RecA和轉座酶。了解不多（特殊重組）45目前雖然無法對遺傳重組直接進行分子水平分析，但依據(jù)： 對DNA生物化學特性的分析； 對減數(shù)分裂過程中染色體行為和重組發(fā)生的性狀觀察； 對離體重組系統(tǒng)的研究；出現(xiàn)了旨在解釋DNA同

4、源重組的模型。1、 同源重組的模型第二節(jié)、同源重組的機制A、Holliday 模型：美國人R. Holliday 在1964年提出。6（a）減數(shù)分裂前期I，同源的非姐妹染色單體DNA配對；（b）非姐妹染色單體方向相同的兩條單鏈，在核酸內切酶作用下，在相同位置上同時切開，出現(xiàn)斷裂；（c,d ）切開的單鏈交換重接，形成一個交聯(lián)橋；（e, f）交聯(lián)橋移動，在兩個DNA分子上各形成一段異源雙鏈區(qū)；（g ）染色體構型發(fā)生一定變化；7(g, h, i ) 交聯(lián)橋旋轉，形成十字構形（Holliday中間體）；( j ) 十字構形中2條單鏈保持完整，另2條單鏈出現(xiàn)斷裂；( k,l ) DNA修補合成.兩個單體

5、DNA是否出現(xiàn)重組與交聯(lián)橋的斷裂方式有關。但無論重組與否，都新出現(xiàn)有一段異源雙鏈DNA，這是發(fā)生基因轉變的遺傳基礎。故該模型也叫異源或雜合DNA模型。8how to think about this problem.BRANCH MIGRATIONROTATE PERSPECTIVEBREAKSconversion“horizontal breakage”9BRANCH MIGRATIONROTATE PERSPECTIVEBREAKShow to think about this problem.recombination“vertical breakage”10這一模型涉及到兩次斷裂和重接

6、： 前一次斷裂、重接和分支遷移造成了異源雙鏈； 后一次斷裂和重接則決定是否出現(xiàn)重組。如果兩次發(fā)生在相同的兩條鏈上，只造成異源雙鏈，在這段異源雙鏈區(qū)兩側的遺傳學位點將不會發(fā)生重組；如果兩次斷裂重接涉及四條單鏈，則除了有異源雙鏈區(qū)之外，在這段異源雙鏈區(qū)兩側的遺傳學位點還將發(fā)生重組。11B、Meselson-Radding 模型該模型由M. Meselson 和C. Radding在Holliday模型的基礎上修改的，與后者的主要區(qū)別：（1）開始只在單個染色體上造成切割。Holliday模型是在兩個染色體上都造成切割。（2）按照 Meselson-Radding 模型，異源雙鏈區(qū)可以只發(fā)生在兩個染色

7、體的其中之一上，也可以發(fā)生在兩個染色體上，取決于交聯(lián)橋是否遷移。12（a）切割（b）鏈置換（c）鏈侵入（d）嚕噗切除（e）連接（f）分支遷移13C Double-strand break （DSB) model 兩個交聯(lián)橋以同樣方式切割只形成斷口兩側的異源雙鏈區(qū)，沒有重組；兩個交聯(lián)橋以相反的方式切割，則除了有異源雙鏈區(qū)外，也發(fā)生重組。1）非姐妹染色單體的一條雙鏈斷裂；2）從5降解，產生3游離單鏈；3）一3游離單鏈 侵入取代同向完整鏈4）3 單鏈延伸5）被取代的完整鏈與另一游離鏈配對；6）底鏈進行DNA的合成7）缺口結合形成兩個Holliday 中間體14DSB更接近事實的原因：1）Homolo

8、gous recombination is often initiated by double-strand break (DSB) in DNA, not by aligned nicks of Holiday model.（同源重組通常由DSB引發(fā)）2）DSB occurs relatively frequently, but the aligned nicks not.（DSB現(xiàn)象常見）2、Holliday中間體存在的證據(jù)人們在研究大腸桿菌的環(huán)形DNA質粒時發(fā)現(xiàn)了一種8字形重組結構（兩個環(huán)形質粒重組中間體）。15“8”結構經酶切后有4條臂，猶如希臘字母，因此稱作Chi結構。在酵母菌等多種

9、生物中也發(fā)現(xiàn)了類似的結構。Chi結構的發(fā)現(xiàn)直接驗證了重組中Holliday中間體的存在。163. 基因轉變及機理無性繁殖：分生孢子萌發(fā)，菌絲生長形成菌絲體（n）；有性繁殖：不同交配型A和a產生分生孢子散落在不同交配型子實體的受精絲上，進入子實體后融合成2n核（Aa）。2n核行減數(shù)分裂，獲得一個細胞內含有4個單倍體的產物，產物按照一次減數(shù)分裂的結果呈直線順序排列，稱為順序四分子。再經一次有絲分裂，在子囊中產生8個單倍體的子囊孢子，子囊孢子成熟后萌發(fā)長成新的菌絲體。粗糙鏈孢霉（Neurospora crassa）的繁殖方式：17Production of ordered tetrads of Ne

10、urospora.AaAa18Segregation patterns in Neurospora.1920Photomicrograph showing segregation of dark and light ascospores in Neurospora.5:36:24:4基因轉變（gene conversion)正常情況下形成子囊孢子的分離應該是 4:4 ，但有的時候會發(fā)現(xiàn)異常的分離比。這與基因轉變有關：在重組過程中，一個基因變?yōu)樗牡任换虻默F(xiàn)象叫做基因轉變。21基因轉變機理異源雙鏈DNA模型（Holliday模型）可以很好地解釋基因轉換發(fā)生的機理?，F(xiàn)象：基因轉變現(xiàn)象常常和鄰近基

11、因的重組相伴發(fā)生。解釋：可能發(fā)生基因轉變的基因正好位于異源雙連區(qū)。例如 g+ x g雜交中 ，如果兩基因有一對堿基之差（下圖）：22A C A G TT G T C AA C A T TT G T A Ag+g -A C A G TT G T A AT G T C AA C A T T或者異源雙連區(qū)是：23可能的校正方式：GAGCTA(+)(g)有絲分裂+-GA+-校正到+校正到-不校正修正發(fā)生在減數(shù)分裂之后，有絲分裂之前24CTCGAT(+)(g)校正到+校正到-不校正CT有絲分裂+-+-25G/C= +A/T= g兩個雜種分子都未校正一個雜種分子校正為+ 或 g/+兩個雜種分子都校正為+

12、或 g異常的44 兩個雜種分子分別校正為+ 和 g異源源雙鏈區(qū)26基因轉變的實質：重組過程中留下的局部異源雙鏈區(qū)，在細胞內的修復系統(tǒng)（錯配修復）識別下，不同的修復/不修復產生的結果。不同的修復會產生不同的結果。27識別錯配識別對錯： GATC有甲基化的為對錯配酶與未甲基化的GATC和新鏈錯配處結合錯配修復酶切除包括錯配堿基的部分新鏈聚合修補并連接關鍵點：對模板認定正確：完全修復；錯誤，產生突變28第三節(jié)、位點專一性重組噬菌體侵入大腸桿菌細胞后，面臨著裂解生長還是溶源生長的選擇;進入溶源狀態(tài)需要DNA整合進寄主DNA,由溶源狀態(tài)進入裂解生長需要DNA從寄主DNA切除下來;這里的整合和切除都是通過

13、細菌DNA和DNA上位點專一性重組實現(xiàn)的。這些專一性位點叫做附著點（attachment site），簡寫為att。29 噬菌體侵染周期30位點專一性重組過程attBattP整合酶Int切除酶Xis整合宿主因子(IHF)31attB和attP位點處的序列，O序列叫做核心序列，全長15bp，富含AT堿基對，在attB和attP中完全一致。3233第四節(jié)、轉座因子轉座因子理論推翻了經典遺傳學關于基因座位是固定的觀念，是一種革命性的理論人們把麥氏的成就比之為一百年前另一位偉大的遺傳學家孟德爾的成就。1983年,美國遺傳學家BMcClintock因在發(fā)現(xiàn)轉座因子方面的重大貢獻，被授予諾貝爾醫(yī)學獎。34

14、1951年，在冷泉港生物學專題討論會上， McClintock報告了遺傳基因可以改變自身位置，她稱之為“轉座子” 。轉座理論遇寒冬當時占統(tǒng)治地位的理論認為基因以一定的順序在染色體上作線性排列，彼此之間的距離非常穩(wěn)定；常規(guī)的交換和重組只發(fā)生在等位基因之間，并不擾亂這種距離； 除了發(fā)生頻率低的染色體倒位和相互易位等畸變可以改變基因的位置外，人們無法想象基因會從一處跳躍到另一處。35轉座理論被接受上世紀70年代后在生物中發(fā)現(xiàn)了更多可移動的遺傳因子；從而麥氏的理論被人們重新提起并得到了驗證，80年代初麥氏理論為科學界普遍接受。她走在時代前面四十年，同時也為此冷落奮斗了四十年。 轉座因子是可以在染色體內

15、或染色體間(以及細菌染色體與質粒間）改變位置的一段脫氧核糖核酸序列。目前認為“轉座”的命名并不準確。在轉座過程中，轉座因子的一個拷貝常留在原位置上，在新位點上出現(xiàn)的僅是新拷貝。因此，轉座過程實際上是依賴于DNA復制的重組過程。361940初，McClintock發(fā)現(xiàn)這一突變與染色體重組（斷裂、解離）有關。一、麥氏的工作染色體的斷裂、解離(dissociation)有一個特定位點(Ds)；但Ds并不能自行斷裂、解離，受一個激活因子Ac(activator)控制，而Ac即可以正常傳遞，也可以轉移座位。Ds只有在Ac存在時才能移動，McClintock把Ac和Ds稱為控制因子或轉座因子。Emerso

16、n（1914）發(fā)現(xiàn)一種玉米果皮色素遺傳特殊突變體-花斑條紋果皮，這種突變可以發(fā)生多次突變和回復，原因不清。37在單個胚乳細胞中跳來跳去，形成花斑胚乳38轉座因子如果在質粒上，將質粒加熱變性，兩條鏈各自復性，會形成莖環(huán)結構。 二、轉座因子存在的直接證據(jù)39三、轉座因子的分類和結構它是一類最小的轉座因子，除有轉座酶基因外，一般不含其它基因，大小在7681530 bp；它們是細菌基因組或質粒DNA的正常組成部分；一個細菌細胞常帶有少于10個IS序列。（一）、原核生物的轉座因子根據(jù)分子結構與遺傳特性可以分為三類：1插入序列（insertion sequence，IS）40雖然IS大小不同，但有共同特征

17、：在IS兩末端都有一段短的反向重復序列（IR），長度不一。反向重復序列舉例：TGAAAACTTT:TTTCAAAAGT所以，含有IS的質粒經變性后，分別以單鏈復性，在電鏡下出現(xiàn)莖環(huán)結構：莖的部分是（ ），大環(huán)是（ ），小環(huán)是（ ）。4142當IS插入靶DNA后，導致在插入片段兩側出現(xiàn)（靶片段）的重復。432. 轉座子（transposon）含有轉座酶基因外，還帶抗藥或其它基因。轉座子又可以分為兩類：.復合轉座子：IS因子抗菌素抗性片段IS因子 。IS因子可以是反向重復構型或同向重復構型。相同復合式轉座子Tn9的結構44復合轉座子中的IS序列既能單獨轉座，又能帶動整個復合體轉座。與以下兩個因素有

18、關：A、在非選擇壓力下，兩個IS距離越大，IS自身轉座的可能性越大，復合轉座子轉座的頻率越小。B、在選擇壓力下，復合轉座子整體轉座的頻率會明顯增加。45.有些轉座子末端并不是IS，而是反向重復序列，這類叫復雜轉座子（Complex transposon，稱TnA族）。如Tn3系轉座子：長約5 kb，末端有一對38 bp IR序列，不含IS因子序列。有3個基因：一個是編碼對氨芐青霉素抗性的內酰胺酶(-lactamase)基因，TnpA負責轉座, TnpR編碼TnpA的阻遏蛋白。 463.轉座噬菌體Mu噬菌體是E.coli的溫和噬菌體，溶源化后能起轉座子作用。Mu噬菌體也含有與轉座有關的基因和反向

19、重復序列。Mu能夠整合進寄主染色體任何部位（不同于 ），催化一系列染色體的重新排列。轉座的機制主要是復制型轉座，有時也切離轉座。47（二）、真核生物的轉座因子： 1、分類與結構48玉米籽粒色斑的產生、果蠅復眼顏色的變異、啤酒酵母接合的轉換等現(xiàn)象都與轉座因子在染色體上的轉座有關。玉米除Ac-Ds系統(tǒng)外，Spm控制因子也有自主控制因子+非自主控制因子。Ac由4563個核苷酸組成：一個由11個核苷酸組成的末端反向重復區(qū)+兩個與轉座有關的酶基因（一個大基因和一個小基因）。Ds因子的大小差別很大。Ds9很象Ac，只是缺失了194個核苷酸。而一個最小的Ds因子只有Ac長度的1/10，僅僅包括了Ac因子的未

20、端反向重復區(qū)（下圖）49果蠅的轉座因子有Copia、412與297等；轉座子未端序列是轉座酶識別位點（保守性很強）。503、酵母的Ty （Transposon yeast）兩端是340 bp的同向重復，稱為元件。TyA編碼DNA結合蛋白，TyB編碼反轉錄酶、整合酶等。Ty元件是典型的反轉錄轉座子，需要通過RNA 中間體進行轉座。Solo可判斷Ty插入事件：51四、轉座的機理（一）反轉錄轉座進行此種轉位的是反轉錄轉座子，如酵母的Ty1。1、該因子先轉錄為RNA中間體；2、該轉錄本指導一種反轉錄酶的合成，后反轉錄出雙鏈DNA；3、在整合酶的作用下整合到染色體的隨機位點。整個過程同反轉錄病毒早期感染

21、類似。廣泛存在于酵母、果蠅和哺乳動物中52（二）切離轉座在切離轉座中，原始轉座子作為一個可移動的實體直接從染色體的一個位點轉移到另一個位點。如IS序列、玉米的Ds等。特異的轉位酶附著于兩端的反向重復序列，使轉位子切離下來，整合到另一個位置；原來切口被封閉，但往往在該處發(fā)生突變。53（三）復制轉座細菌轉座子的轉座機制研究最為清楚。復制性轉座是一個非同源重組的過程，通過這一重組，轉座子出現(xiàn)在一個新的位置上，可是原來位置上的轉座子并不消失，所移動和轉位的是原轉座子的拷貝。Tn類轉座主要是這種形式。54J.A Shapiro的復制轉座模型（1）切開（2）連接（3）復制（4）重組TnTn位點專一性重組55五、轉座的遺傳效應1、轉座引起插入基因突變或失活；562、轉座產生新的基因；例如：外顯子改組573、轉座導致染色體畸變，增加新的變異 如切離效應：584、轉座造成同源序列的整合