色譜定性定量分析方法課件

1、China Pharmaceutical University 色譜定性定量分析方法12022/7/20色譜分析方法驗(yàn)證色譜定量分析方法聯(lián)用技術(shù)定性方法色譜定性分析方法22022/7/20一、色譜定性分析方法 保留時(shí)間 tr相對(duì)保留時(shí)間 RRT，t/tr相對(duì)保留值 , (t-t0)/(tr -t0）保留指數(shù) I 32022/7/20 色 譜 高分離能力，但鑒別結(jié)構(gòu)的能力較弱。 光 譜 能提供豐富的結(jié)構(gòu)信息，但是對(duì)分析物純度較高。二、色譜-光譜聯(lián)用技術(shù)定性廣泛用于藥物中的雜質(zhì)、體內(nèi)外代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定42022/7/20氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用多用于分離易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、極性小的化合物GC-MS：采用E

2、I離子源。EI：獲得分子離子峰及豐富的分子結(jié)構(gòu)信息；52022/7/20分離對(duì)象較廣LC-MS：采用API 離子源;一級(jí)質(zhì)譜獲得分子量信息；高裂解電壓（CID）或二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）獲得分子結(jié)構(gòu)信息。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用62022/7/20例：鹽酸乙哌立松片主要降解產(chǎn)物的定性鑒別 72022/7/20鑒定要點(diǎn)：1、利用LC-UV選擇最佳LC分離條件，并確定主峰與降解產(chǎn)物的峰位；供試品溶液的LC-UV圖 82022/7/202、選擇合適的離子源，利用LC-MS獲得雜質(zhì)的準(zhǔn)分子離子峰。 LC-ESI-MS的 總離子流色譜圖 LC-APCI-MS的 總離子流色譜圖 92022/7/203. 獲得降解

3、產(chǎn)物準(zhǔn)分子離子峰的裂解信息。方式一：在APCI條件下采用較高的CID電壓或二級(jí)質(zhì)譜裂解m/z 175.3，獲得碎片信息；方式二：在GC-MS(EI)質(zhì)譜獲得分子離子峰及其裂解途徑；102022/7/204、利用原藥的質(zhì)譜裂解途徑確定降解產(chǎn)物的可能結(jié)構(gòu)；雜質(zhì)YJ的結(jié)構(gòu)112022/7/20APCIEI122022/7/20聯(lián)用技術(shù)定性鑒定規(guī)律1、分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)，確定色譜分離模式；2、以常用檢測(cè)器（GC:FID/LC:UV）為手段，優(yōu)化色譜分離條件，確定待鑒定組份峰位；132022/7/203、根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)，選用合適的光譜技術(shù)鑒定；4、依據(jù)光譜信息進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定： 根據(jù)質(zhì)譜提供的分子量和分子碎片信息

4、，結(jié)合原藥的光譜信息初步推斷未知物結(jié)構(gòu)；142022/7/20三、色譜定量分析方法1、色譜信號(hào)的測(cè)量: 色譜峰峰高與峰面積反映檢測(cè)器對(duì)樣品的響應(yīng)值，定量分析中峰面積更為常用；2、定量分析的方法 面積歸一化法；外標(biāo)法；內(nèi)標(biāo)法；標(biāo)準(zhǔn)曲線法 152022/7/20三、不同檢測(cè)器的色譜信號(hào)與物質(zhì)濃度關(guān)系 FID、ECD、UV檢測(cè)器的響應(yīng)（峰面積）與樣品的濃度呈線性關(guān)系； ELSD響應(yīng)的自然對(duì)數(shù)與樣品的濃度或質(zhì)量呈線性關(guān)系； 質(zhì)譜（MS-ESI）檢測(cè)器高濃度時(shí)的響應(yīng)與樣品的質(zhì)量可能呈二次或更復(fù)雜的方式。162022/7/20四、色譜分析方法驗(yàn)證 目的： 證明所采用的色譜分析方法適合于相應(yīng)的檢驗(yàn)要求，判斷

5、能否用于藥品分析。 效能指標(biāo)：評(píng)價(jià)分析方法的尺度效能指標(biāo)包括: 精密度、準(zhǔn)確度、專(zhuān)屬性、檢測(cè)限、定量限、線性與范圍、耐用性、穩(wěn)定性、系統(tǒng)適用性等172022/7/20 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證 藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則 藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則 緩釋、控釋制劑指導(dǎo)原則不同分析測(cè)定方法的要求182022/7/20 專(zhuān)屬性（specificity）: 意義：指有其他成分可能存在情況下，采用的方法能準(zhǔn)確測(cè)定出被測(cè)物的特性。 內(nèi)容： 藥物制劑含量測(cè)定時(shí)的專(zhuān)屬性考察內(nèi)容：A、雜質(zhì)中間體與主成份的分離情況；B、破壞性試驗(yàn)產(chǎn)生的降解產(chǎn)物與主成份的分離情況：酸、堿、熱、氧化、光破壞C、輔料

6、是否干擾測(cè)定。192022/7/20準(zhǔn)確度（accuracy）： 意義：測(cè)量值與真實(shí)值接近的程度。 藥物制劑的含量測(cè)定以回收率表示。 內(nèi)容：即通過(guò)在空白基質(zhì)中加入已知量不同濃度的對(duì)照品，比較測(cè)定值和加入值確定。 一般在期望濃度的80%、100%、120%三個(gè)水平量，各測(cè)定三次，回收率均值在98-102%。 202022/7/20線性范圍（linearity range）： 意義： 待測(cè)物濃度與響應(yīng)值成線性關(guān)系的濃度范圍； 內(nèi)容：用不同濃度對(duì)照品溶液分析測(cè)定（至少5種），以峰面積與濃度進(jìn)行線性回歸。 制劑分析時(shí)方法要求r不小于0.999；生物樣品分析要求r不小于0.99，與準(zhǔn)確度的要求有關(guān)系。

7、注意：與定量方法中標(biāo)準(zhǔn)曲線法的異同。212022/7/20精密度（precision）：意義：同一樣品多次測(cè)量值之間相互接近的程度。內(nèi)容：重復(fù)性: 同一實(shí)驗(yàn)室,同一人多次測(cè)定的精密度中間精密度: 同一實(shí)驗(yàn)室，不同人，不同儀器測(cè)定的精密度 重現(xiàn)性: 不同實(shí)驗(yàn)室，不同人測(cè)定的精密度 制劑分析時(shí)精密度RSD應(yīng)不小于2%。222022/7/20檢測(cè)限和定量限（LOD and LOQ）：意義： LOD是能檢測(cè)到的最低量，S:N=3:1。 LOQ是能定量測(cè)定的最低量，S:N=10:1。內(nèi)容： 生物樣品分析時(shí)定量下限即為標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度點(diǎn)，定量上限即位標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)。232022/7/20穩(wěn)定性（stability）：意義： 考察分析樣品與試劑在一定時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定性。內(nèi)容： 根據(jù)樣品與試劑測(cè)定時(shí)實(shí)際可能所處的環(huán)境進(jìn)行考察。 242022/7/20耐用性（ robustness ）：意義： 考察測(cè)定條件發(fā)生小變動(dòng)時(shí)測(cè)定結(jié)果的變化。內(nèi)容： 流動(dòng)相的組成