三薄層色譜課件

1、一、平面色譜分類與分離原理二、技術(shù)參數(shù)與基本流程三、薄層色譜四、紙色譜五、薄層電泳學(xué) 習(xí) 內(nèi) 容第七章 平面液相色譜1. 平面液相色譜儀的分類一平面液相色譜分類與分離原理第七章 平面液相色譜 紙色譜法 薄層色譜法 薄層電泳法 2. 平面液相色譜儀的分離原理一平面液相色譜分類與分離原理第七章 平面液相色譜 紙色譜、薄層色譜都屬于以液體為流動相平面色譜分析法。但與其它色譜方法不同的是在分離過程中一般不使用動力源。 紙層析和薄層層析流動相的移動是依靠毛細(xì)作用。 將試樣點(diǎn)在色譜濾紙或?qū)游霭宓囊欢?，并將該端浸在作為流動相的溶劑（常稱之為展開劑）中，隨著溶劑向上的移動，經(jīng)過試樣點(diǎn)時，帶動試樣向上運(yùn)動。2.

2、 平面液相色譜儀的分離原理一平面液相色譜分類與分離原理第七章 平面液相色譜紙色譜的載體： 層析濾紙，組成濾紙的纖維素分子中具有很多親水性的羥基，當(dāng)纖維素上的羥基與水結(jié)合后便形成了液-液分配色譜的固定相。紙色譜的流動相： 即：展開劑 紙色譜動畫移動的動力： 毛細(xì)作用。2. 平面液相色譜儀的分離原理一平面液相色譜分類與分離原理第七章 平面液相色譜薄層色譜的載體： 吸附材料（硅膠、氧化鋁、纖維素等）均勻固化在載板（如：玻璃）上，形成液-固吸附色譜的固定相。薄層色譜的流動相： 即：展開劑 薄層色譜動畫1、2移動的動力： 吸附劑顆粒間隙的毛細(xì)作用。2. 平面液相色譜儀的分離原理一 平面液相色譜分類與分離

3、原理第七章 平面液相色譜薄層電泳的載體： 點(diǎn)有樣品（蛋白質(zhì)、核苷酸、多肽、糖類等）的惰性支持介質(zhì)（紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）。薄層電泳的介質(zhì)： 電解質(zhì)溶液 薄層電泳動畫1、2移動的動力： 外加電場。1. 比移值 Rf二 技術(shù)參數(shù)與基本流程第七章 平面液相色譜 用來表征斑點(diǎn)位置的基本參數(shù)是保留因子，通常稱作比移值，用Rf表示。 Rf = Ls / L。原點(diǎn)SRWLsL。Lr原點(diǎn)參比樣品前沿同一物質(zhì)在不同展開方式中得到的比移值是不相同的。2. 高比移值 hRf二 技術(shù)參數(shù)與基本流程第七章 平面液相色譜hRf = 100 Rf3. 相對比移值 Ris Rf 測量中一個重要的誤差來

4、源是難以確定溶劑前沿的位置，重現(xiàn)性較差，因此，引入相對比移值（R is）。 R is = Rfs / Rfi = Ls / Lr原點(diǎn)SRWLsL。Lr原點(diǎn)參比樣品前沿二 技術(shù)參數(shù)與基本流程第七章 平面液相色譜3. 相對比移值 Ris 比移值應(yīng)該是組分的定性技術(shù)參數(shù)，但事實上影響平面色譜的因素很多，只有在已知對照品隨行（同時展開），并且不止一種展開劑進(jìn)行展開后，被分離組分的比移值與對照品完全一致時，才可作為定性指標(biāo)之一。 R is 相對較為穩(wěn)定，重復(fù)性和可比性均優(yōu)于R f 。4. 平面色譜的基本流程二 技術(shù)參數(shù)與基本流程第七章 平面液相色譜1）基本材料及設(shè)備 濾紙及薄層板：色譜用紙；自制薄層板；

5、預(yù)制板。 涂布器：自制薄層板需要用涂布器將固定相在玻璃板上涂成符合厚度要求的均勻薄層，有手工、半自動、全自動涂布器。 點(diǎn)樣器：普通毛細(xì)管；微量注射器；微量定量毛細(xì)管。 展開室：紙色譜展開室和薄層色譜展開室 顯色器： 薄層掃描儀：定性及定量分析用。4. 平面色譜的基本流程二 技術(shù)參數(shù)與基本流程第七章 平面液相色譜1）基本材料及設(shè)備 4. 平面色譜的基本流程二 技術(shù)參數(shù)與基本流程第七章 平面液相色譜2）紙色譜和薄層色譜操作步驟 薄層色譜動畫二 技術(shù)參數(shù)與基本流程第七章 平面液相色譜a. 層析紙和層析板 特制的色層濾紙是按需要剪裁成的長條形（或筒型）定性濾紙。 層析板是用專門的涂布器把漿狀的吸附劑（

6、硅膠或氧化鋁，200250目）均勻地涂在長條形玻璃板上（厚度0.150.5 mm）。干燥后即可使用。4. 平面色譜的基本流程二 技術(shù)參數(shù)與基本流程第七章 平面液相色譜b. 展開劑 由一種或多種溶劑按一定比例組成。如用紙層析分離氨基酸時，常用的展開劑組成和配比為：正丁醇：乙酸：水 = 4：1：1。4. 平面色譜的基本流程二 技術(shù)參數(shù)與基本流程第七章 平面液相色譜c. 點(diǎn)樣 用微量注射器或玻璃毛細(xì)管吸取一定量試樣點(diǎn)在原點(diǎn)上。試樣點(diǎn)的直徑一般應(yīng)小于5mm?？刹⑴劈c(diǎn)多個試樣同時展開。4. 平面色譜的基本流程二 技術(shù)參數(shù)與基本流程第七章 平面液相色譜d. 展開、顯色、檢測 有些組份在紫外光照射下產(chǎn)生熒光

7、，可在紫外燈下用鉛筆將組份斑點(diǎn)描繪出來。常用的顯色方法有噴灑顯色劑、碘蒸氣熏或氨水熏等。4. 平面色譜的基本流程5. 特點(diǎn)與應(yīng)用二 技術(shù)參數(shù)與基本流程第七章 平面液相色譜特點(diǎn)： 平板色譜簡單、方便、操作費(fèi)用低，可以在一塊層析板上同時展開多個試樣及將多條濾紙同時展開。 采用方形薄層板還可以方便的進(jìn)行二維展開，即按一般方法展開后，改變方向和展開劑再次展開，進(jìn)一步改善分離效果。 試樣一般不需要經(jīng)過預(yù)處理即可分離。5. 特點(diǎn)與應(yīng)用二 技術(shù)參數(shù)與基本流程第七章 平面液相色譜缺點(diǎn)： 重復(fù)性差，分離效率較低，不適用揮發(fā)性試樣分離。定性定量不便。應(yīng)用： 平板色譜法在染料、農(nóng)藥、醫(yī)藥、有機(jī)酸堿類化合物、糖類化合

8、物、氨基酸、蛋白質(zhì)及中草藥中有效成分的分離分析中經(jīng)常被使用。也可以用于無機(jī)離子的分離。還經(jīng)常作為高效液相色譜的一種預(yù)試方法。5. 特點(diǎn)與應(yīng)用二 技術(shù)參數(shù)與基本流程第七章 平面液相色譜應(yīng)用：雜質(zhì)檢查方法：雜質(zhì)對照品法（A）、供試品自身對照法（高低濃度法）（B）、對照物質(zhì)法（C） 樣 對 樣 對 樣 對A B C 1938年俄國人首先實現(xiàn)了在氧化鋁薄層上分離一種天然藥物。 1965年德國化學(xué)家出版了“薄層色譜法”一書，推動了這一技術(shù)的發(fā)展。 因TLC法設(shè)備簡單，分析速度快，分離效率高，結(jié)果直觀，很快被用作定性和半定量的方法。 20世紀(jì)70年代中后期發(fā)展了高效薄層色譜。80年代以后發(fā)展了薄層色譜光密

9、度掃描儀和各步操作的儀器化，并實現(xiàn)了計算機(jī)化。三 薄層色譜第七章 平面液相色譜1. 概念與原理三 薄層色譜第七章 平面液相色譜 將固定相（吸附劑或載體）涂布成一均勻薄層，點(diǎn)樣，（密閉的容器中）展開，斑點(diǎn)顯色，（與對照物質(zhì)）比較進(jìn)行定性和定量分析。 原理：組分在薄層板上多次吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的過程。通過吸附系數(shù)不等實現(xiàn)組分的分離。 2. 載板三 薄層色譜第七章 平面液相色譜 載板是支持吸附劑的材料。 要求：光滑平整耐腐蝕，洗凈后不附水珠，常用玻璃板 預(yù)制板有：鋁和塑料 掃描用：長度為10、15、20cm，寬度5、10、20cm3. 吸附劑 硅膠、改性硅膠為使用最廣泛的薄層材料 氧化鋁

10、有堿性、中性、酸性 硅藻土為化學(xué)中性吸附劑 纖維素、改性纖維素多糖類 聚酰胺為特殊類型有機(jī)薄層材料，對能形成氫鍵物 質(zhì)有特別的選擇性。4. 添加劑和粘合劑三 薄層色譜第七章 平面液相色譜 （1）添加劑： 熒光指示劑：在254nm紫外光下發(fā)藍(lán)色熒光的有鈉熒光素、硫化鎘、陰極綠等。在366nm有熒光的指示劑如彩藍(lán)等。（2）粘合劑： 無機(jī)黏結(jié)劑：煅石膏（硫酸鈣），無機(jī)黏結(jié)劑的優(yōu)點(diǎn)是：耐高溫，耐酸堿，但涂鋪薄板動作要快，否則勻漿易凝固。薄層強(qiáng)度差。 有機(jī)黏結(jié)劑：羧甲基纖維素鈉、淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物等。其特點(diǎn)是薄層強(qiáng)度高、使用方便，但不能用濃硫酸作顯色劑。5. 硅膠板常用符號三 薄層色譜第七章

11、平面液相色譜 G以石膏作粘合劑；H 沒有黏結(jié)劑；P制備用；W水可濕性的；F254，F(xiàn)366熒光指示劑激發(fā)波長；F254s抗酸性熒光指示劑； 40，60平均孔徑；RP反相；RP-8，RP-18C8，C18烷基改性； CHIR手性固定相。 如：GF254：為用石膏作粘合劑，254nm熒光硅膠板。6. 薄層板的制作與活化三 薄層色譜第七章 平面液相色譜 薄層板涂鋪要求：均勻、平整、無氣泡引起的凹坑和龜裂，厚度0.2 -0.3 mm。例：硅膠板（粒度10 40 um） 硅膠G將硅膠置研缽中，加入少量水，研磨均勻，至無結(jié)塊和氣泡，再加入比例量的水(硅膠H水一般為13)，迅速研磨均勻，立即涂鋪（硅膠H水=

12、12；氧化鋁水=11.5 - 2 ）。 硅膠或硅膠G 以CMC為黏合劑。配制0.2 % 0.7 % CMC水溶液，放置過夜，使懸浮的纖維沉降，取上層用來配制吸附劑勻漿。6. 薄層板的制作與活化三 薄層色譜第七章 平面液相色譜 反相薄層板以不同鏈長的正構(gòu)烷烴為固定液, 配制成適當(dāng)濃度的溶液(如：5 % 硅酮油乙醚溶液), 浸漬硅膠板。 薄層板活化涂布后的薄層先在室溫下陰干，在使用前置適當(dāng)溫度烘烤一定時間進(jìn)行活化，然后置干燥器中備用。 不同薄層活化條件略有不同，如： 硅 膠 110 1 h 氧化鋁 110 30 min 薄層板的涂布7. 展開劑（流動相）三 薄層色譜第七章 平面液相色譜（1）對展開

13、劑的要求： 能夠溶解待測組分 能使待測組分與雜質(zhì)分開 使待測組分Rf值在0.20.8 不能與組分及吸附劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng) 展開后斑點(diǎn)圓而集中。（2）展開劑 極性強(qiáng)的溶劑洗脫能力強(qiáng)。常用溶劑的極性強(qiáng)弱順序：水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯二氯甲烷甲苯苯三氯乙烷四氯化碳環(huán)己烷石油醚。7. 展開劑（流動相）三 薄層色譜第七章 平面液相色譜（2）展開劑 在硅膠吸附薄層上，展開時，往往先用單一的低極性溶劑展開，然后再按溶劑洗脫順序依次更換極性較大的溶劑進(jìn)行試驗。若Rf 值太小，則加入一定量極性強(qiáng)的溶劑，如乙醇、丙酮等；如果Rf 值太大，則加入適量極性弱的溶劑（如：環(huán)己烷、石油醚等），以降低極性?？杉尤胍欢?/p>

14、比例的酸或堿，使斑點(diǎn)集中。 當(dāng)用單一溶劑不能分離時，可用兩種以上的多元展開劑，并不斷改變多元展開劑的組成和比例。7. 展開劑（流動相）三 薄層色譜第七章 平面液相色譜（3）選擇展開劑的點(diǎn)滴試驗法 將要被分離的物質(zhì)的溶液間隔地點(diǎn)在薄層板上，待溶劑揮發(fā)干后，用吸滿不同展開劑的毛細(xì)管點(diǎn)到不同樣品點(diǎn)的中心，借毛細(xì)作用，展開劑從圓心向外擴(kuò)展，這樣就出現(xiàn)了不同的圓心色譜，經(jīng)過比較可以找到最合適的展開劑及吸附劑。7. 展開劑（流動相）三 薄層色譜第七章 平面液相色譜（3）選擇展開劑 選擇何種極性的展開劑，必須考慮分離物質(zhì)的極性及吸附劑的活性，也就是說，要考慮被分離物質(zhì)的極性、吸附劑的活性及展開劑的極性這三者

15、之間的關(guān)系。例如：非極性物質(zhì)B，選用吸附劑的活性為級，展開劑應(yīng)為非極性的。8. 點(diǎn)樣三 薄層色譜第七章 平面液相色譜樣品溶液的制備： 純品的溶解（用于對照定性）：將純品直接溶于單一或混合溶劑中，并稀釋至一定濃度即可點(diǎn)樣； 樣品的提取及凈化：對生物樣品（動植物組織、體液等）中某些成分的分離測定時，首先要將樣品中的被測成分定量地提取出來，視含量高低稀釋或濃縮成一定濃度的樣品溶液。 對照純品溶液的濃度與樣品的濃度最好相近。8. 點(diǎn)樣三 薄層色譜第七章 平面液相色譜 要求配制樣品的溶劑高度揮發(fā)性和盡可能非極 性，否則易使斑點(diǎn)擴(kuò)展。 采用多次點(diǎn)加法，第二次點(diǎn)加時應(yīng)待前一次點(diǎn)加的溶劑揮發(fā)后再進(jìn)行。 點(diǎn)樣量

16、應(yīng)適中，過載會引起斑點(diǎn)拖尾，分離度變差，以最小檢測量的幾倍幾十倍為宜。 手工點(diǎn)樣工具：定容玻璃毛細(xì)管（15 ul），微量注射器。 藥典規(guī)定：點(diǎn)樣基線距底邊2.0 cm, 樣點(diǎn)直徑2 - 4 mm, 點(diǎn)間距離約為1.5 - 2.0 cm。9. 展開方式三 薄層色譜第七章 平面液相色譜 多數(shù)采用直線形上行展開，薄層板水平角度以75 為最佳。展開距離一般為10-15 cm。 多次展開：一次展開未達(dá)滿意分離時，可將薄層板干燥后再次用同一種溶劑展開，可重復(fù)多次，直到混合物分離為止。 分步展開：混合物性質(zhì)差別較大時，一種流動相不能有效分離時，可采用不同溶劑依次展開不同距離。 連續(xù)展開：使到達(dá)薄層上緣的溶劑

17、不斷蒸發(fā)，連續(xù)展開以增加展開距離。因無溶劑前沿，需要有個參照物同時展開，以計算相對保留值。9. 展開方式三 薄層色譜第七章 平面液相色譜原點(diǎn)12 二維展開：在兩個垂直的方向上進(jìn)行展開。將樣品點(diǎn)在薄層板的一個角上，展開適當(dāng)距離后，揮干溶劑，再將薄層板以與原展開方向成90 的方向進(jìn)行展開。9. 展開方式三 薄層色譜第七章 平面液相色譜 離心展開：薄層板以適當(dāng)轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)時，流動相以適當(dāng)速率轉(zhuǎn)移到薄層上。該技術(shù)主要用于制備色譜。 鍥尖技術(shù)：圓形離心展開具有分辨率高的優(yōu)點(diǎn)，但需要有一定的儀器裝置。采用鍥尖技術(shù)可以在一般的展開室中進(jìn)行類似展開。 薄層被刮掉部分溶劑前沿10. 顯色定位三 薄層色譜第七章 平面

18、液相色譜 物理方法：可見光下不顯色、但可吸收紫外光，紫外光下顯示熒光斑點(diǎn)或熒光淬滅 化學(xué)方法：加化學(xué)試劑顯色，要求顯色穩(wěn)定、持久、專屬、靈敏、線性良好。常用顯色劑為硫酸、碘、磷鉬酸、三氯化銻；專屬性顯色劑主要有改良碘化鉍鉀、香草醛硫酸 斑點(diǎn)定位方法：碘；揮發(fā)性酸堿：鹽酸、硝酸、濃氨水、二乙胺 如：碘蒸氣法：靈敏、簡便，為通用顯色法。將碘結(jié)晶放在密封的展開缸中，碘的升華，使缸內(nèi)充滿紫色的碘蒸氣。將展開后的板揮干溶劑置碘缸中至薄層色譜上出現(xiàn)棕色斑點(diǎn)。放置時間不宜太長，否則背景吸附劑也吸附碘，使信噪比降低。用針頭將斑點(diǎn)標(biāo)記下來，放在通風(fēng)處使碘揮發(fā)。11. 定性定量三 薄層色譜第七章 平面液相色譜定性

19、： 色譜鑒定利用Rf值化學(xué)鑒定試劑顯色反應(yīng)薄層色譜與UV、GC、HPLC、IR、MS、NMR聯(lián)用定量： 洗脫后定量法UV、HPLC、GC、原位定量法薄層掃描法、目視比較法（如雜質(zhì)限度檢查方法）四 紙色譜第七章 平面液相色譜 紙色譜利用濾紙作為支持體，吸附在濾紙上的少量水分作為固定相，這是1944年開始出現(xiàn)的一種液-液分配色譜。 紙色譜利用濾紙中含約20 %的水分作為固定相，樣品點(diǎn)放在濾紙上，用有機(jī)溶劑展開。紙色譜動畫四 紙色譜第七章 平面液相色譜 比移值的重現(xiàn)對確定物質(zhì)組成有重要意義，若條件選擇合適，可以將比值控制在Rf0.02范圍，因而操作中應(yīng)注意: 1）層析分離時溫度應(yīng)恒定，至少差別較小。

20、 2）層析器應(yīng)密閉，以防組分揮發(fā)。 3）層析器中濾至于層析器要用流動相飽和。 4）最好使用同一批濾紙,以使濾紙常數(shù)一致。1. 獲得重現(xiàn)的比移值應(yīng)注意的事項四 紙色譜第七章 平面液相色譜 紙色譜中，利用物質(zhì)在水相和有機(jī)相中的溶解度不同而彼此分離。如物質(zhì)在水相中溶解度大則展開時不易移動，Rf值小，相反，如物質(zhì)在有機(jī)相中溶解度大，則展開時移動距離大，Rf值大。因此，為了對多種物質(zhì)進(jìn)行分離，必須選擇適當(dāng)?shù)娜軇┳髡归_劑。 一般有機(jī)化合物在有機(jī)溶劑中溶解度皆有一定的差別，所以，可以用水飽和的有機(jī)溶劑對許多有機(jī)化合物進(jìn)行有效的分離；對無機(jī)離子講，大多數(shù)不溶或難溶于有機(jī)溶劑中。因此，在無機(jī)紙色譜分離中，常加某

21、些絡(luò)合劑與無機(jī)離子形成能溶于有機(jī)相中的絡(luò)合物。2. 紙色譜中溶劑的選擇四 紙色譜第七章 平面液相色譜 常用的展開劑：水、甲酰胺、甲醇、乙酸、乙醇、異丙醇、丙酮、正丙醇、叔丁醇、苯酚、正戊醇、正丁醇、乙酸乙脂、乙醚、乙酸正丁脂、氯仿、苯、甲苯、環(huán)己烷、石油醚，以上展開劑的極性由強(qiáng)至弱。2. 紙色譜中溶劑的選擇1. 電泳的概念和分類五 薄層電泳第七章 平面液相色譜 電泳是指帶電荷的粒子在直流電場中，向帶符號相反的電極的移動，是一種電動現(xiàn)象。 蛋白質(zhì)、核酸或其他多電解質(zhì)則由其本身所具有的功能團(tuán)的解離而帶電。蛋白質(zhì)具有正負(fù)兩類解離基，稱為兩性電解質(zhì)。蛋白質(zhì)在酸性介質(zhì)中帶正電，在堿性介質(zhì)中則帶負(fù)電。在某

22、一pH值時，其正負(fù)電荷相等，此時的pH即稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。五 薄層電泳第七章 平面液相色譜1. 電泳的概念和分類按分離的原理區(qū)分區(qū)帶電泳移界電泳等速電泳等電聚焦電泳五 薄層電泳第七章 平面液相色譜1. 電泳的概念和分類按電泳進(jìn)行的介質(zhì)區(qū)分區(qū)帶電泳自由電泳等電聚焦電泳顯微鏡電泳(細(xì)胞電泳)移界電泳柱電泳自由流動幕電泳等速電泳濾紙電泳薄層電泳凝膠電泳免疫電泳高壓電泳電泳動畫1、2、3、4五 薄層電泳第七章 平面液相色譜1. 電泳的概念和分類區(qū)帶電泳：是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個點(diǎn)或一薄層樣品溶液，然后加電場，分子在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)中遷移。不同的離子成分在均一的緩沖液(或稱載體電解質(zhì))系統(tǒng)中

23、分離成獨(dú)立的區(qū)帶，可以用染色等方法顯示出來，如果用光密度計掃描可得出個個互相分離的峰，與洗脫色譜的圖形相似，電泳的區(qū)帶隨時間延長和距離加大而擴(kuò)散嚴(yán)重，影響分辨率。加不同的介質(zhì)可以減少擴(kuò)散，特別是在凝膠中進(jìn)行，它兼具分子篩的作用，分辨率大大提高，是應(yīng)用最廣泛的電泳技術(shù)。五 薄層電泳第七章 平面液相色譜2. 常用電泳分離技術(shù)1）瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖是由瓊脂經(jīng)過反復(fù)洗滌除去含硫酸根的多糖之后制成的，將它加入一定緩沖液中，加熱溶解，冷卻后則成膠，叫瓊脂糖凝膠。 瓊脂糖凝膠電泳法，主要用于分離、鑒定和純化DNA片段。用溴化乙錠(EB)染色，在紫外燈下，凝膠中1ng的DNA即能直接觀察到。 瓊脂糖凝膠電

24、泳對核酸的分離作用主要依賴它們的分子量及分子構(gòu)型。而凝膠的類型及其濃度對被分離核酸的分子大小關(guān)系重大。 五 薄層電泳第七章 平面液相色譜2. 常用電泳分離技術(shù)1）瓊脂糖凝膠電泳 利用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA主要包括制膠、加樣、電泳、染色和檢出五個步驟。 制膠 稱取瓊脂糖粉末，以pH 8.0的乙酸鈉-Tris緩沖液（0.4 mol/L Tris、0.2 mol/L乙酸鈉溶液、0.01 mol/L EDTA，用冰乙酸調(diào)到pH 8.0）配成1 %溶液。瓊脂糖難溶，應(yīng)于沸水浴中煮溶，或于高壓鍋中煮溶。將制膠模具垂直放置，周圍用硅油（或其他密封物質(zhì)）密封，或用夾子夾緊，以免膠液泄漏。溶液從頂部灌注。灌膠

25、完成后從頂部插入梳子，以形成加樣孔。梳子寬度取決于玻璃板的寬度，梳子的厚度和凝膠的厚度取決于隔板的厚度。室溫下放置12小時，待膠柱呈灰白色半透明狀態(tài)則表明已聚合完畢。五 薄層電泳第七章 平面液相色譜2. 常用電泳分離技術(shù)1）瓊脂糖凝膠電泳 加樣 加樣前輕輕將梳子傾斜拔出，防止氣泡陷入，用電極緩沖液淋洗加樣孔，吸出，再加適量電極緩沖液。取0.5g左右的樣品，如為質(zhì)粒DNA或它的EcoRI的酶解液，體積為50L左右，加入1/4體積的溴酚藍(lán)-甘油指示劑混合后，用微量注射器小心地將樣品加成一細(xì)窄帶，否則影響電泳分辨率。如果沒有足夠數(shù)目的樣品，應(yīng)在加樣孔中加樣品緩沖液，不要留有空孔，以防止電泳時鄰近帶的

26、擴(kuò)展。五 薄層電泳第七章 平面液相色譜2. 常用電泳分離技術(shù)1）瓊脂糖凝膠電泳 電泳 按說明書先在電泳槽的下槽中裝入電極緩沖液。將聚合后的凝膠連同模具一起移入電泳槽中，在上槽中注入電極緩沖液，打開冷卻循環(huán)系統(tǒng)，連接電源。一般起始電壓約為7080V，然后不斷升高。起始電流可設(shè)置為2030mA，取決于凝膠厚度、大小和樣品數(shù)。待溴酚藍(lán)前沿到達(dá)電泳槽底部（陽極時），切斷電源，關(guān)掉冷卻系統(tǒng)，取出凝膠，準(zhǔn)備染色。 五 薄層電泳第七章 平面液相色譜2. 常用電泳分離技術(shù)1）瓊脂糖凝膠電泳 染色 用菲啶溴紅染色液浸泡凝膠10分鐘，然后倒出染色液，將凝膠移到磨砂玻璃上。 檢出 將凝膠板置于紫外燈下，約3分鐘后可

27、見到膠板中呈現(xiàn)具有紅色熒光的條帶，該條帶標(biāo)志著DNA所在位置。 瓊脂糖凝膠電泳動畫五 薄層電泳第七章 平面液相色譜2. 常用電泳分離技術(shù)2）醋酸纖維素膜電泳 醋酸纖維素膜電泳是以醋酸纖維素膜為支持介質(zhì)，其電泳原理與紙電泳基本相同。 醋酸纖維素膜電泳的優(yōu)點(diǎn)： 對蛋白質(zhì)樣品的吸附作用極小，幾乎完全消除了“拖尾觀象，染色后背景清晰，分離帶狹窄清楚，提高了定量測定的精確性。醋酸纖維素膜的親水性小，電泳時電流的大部分是由樣品傳導(dǎo)的，分離速度快、電泳時間短。 樣品用量少、靈敏度高。 可分離某些用紙電泳不易分離的蛋白質(zhì)，例如溶菌酶、胰島素、組蛋白等。 電泳圖譜經(jīng)冰醋酸乙醇溶液或其他透明液處理后可使膜質(zhì)透明化

28、，從而有利于光吸收掃描測定和膜的長期保存。 五 薄層電泳第七章 平面液相色譜2. 常用電泳分離技術(shù)3）聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠有一定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它是由丙烯酰胺和N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（簡稱Bis或亞甲基雙丙烯酰胺）聚合交聯(lián)而成的。形成凝膠是種化學(xué)聚合過程，可人為控制聚合成具有一定大小孔徑的凝膠。若形成的孔徑大小接近于所分離樣品分子的平均半徑，在電泳過程中，樣品分子在通過凝膠孔洞時，所受到的阻力就會和樣品分子的大小及形狀密切相關(guān)。這樣，就為凈電荷很相近的物質(zhì)的分離又提供了一種可變的分離因素。通常我們稱這種有利因素為分子篩作用。五 薄層電泳第七章 平面液相色譜2. 常用電泳分離技術(shù)3）

29、聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)： 樣品不易擴(kuò)散；可隨意控制凝膠濃度，按照需要制成不同孔徑的凝膠； 把分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)結(jié)合在同一方法中，能夠達(dá)到更高的分辨能力； 它是由C-C-C結(jié)合的一種酰胺多聚物，側(cè)鏈上具有不活潑的酰胺基，沒有帶電的其他離子基，所以電泳時不產(chǎn)生電滲，化學(xué)上惰性較強(qiáng)； 只要合成用的原料(單體)純凈，制成的多聚物的再現(xiàn)性高，樣品分離的重復(fù)性也較高； 任一濃度范圍內(nèi)透明性好，機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性； 能按照需要把帶有一定電荷的基團(tuán)作為共聚體滲入其中； 需要樣品量少，1100 g已足夠； 需要設(shè)備簡單，時間短； 用途廣泛，對蛋白質(zhì)、核酸等生物高分子可進(jìn)行分離、定性、定量

30、、小量制備、分子量測定等等。五 薄層電泳第七章 平面液相色譜2. 常用電泳分離技術(shù)3）聚丙烯酰胺凝膠電泳 分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系 分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%) 蛋 白 質(zhì) 104 20 - 30 1 - 4104 15 - 20 1-5104 - 1105 10 - 15 1105 5 - 10 5105 2 - 5 核酸(RNA) 104 15 - 20 104105 5 - 10 105 - 2106 2 - 2.6五 薄層電泳第七章 平面液相色譜2. 常用電泳分離技術(shù)4） SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 蛋白質(zhì)混合樣品經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳以后，被分離的各蛋白質(zhì)組分的電泳遷移率互不

31、相同，這種差異主要是由各蛋白質(zhì)組分所帶的靜電荷以及分子大小和形狀等因素造成的。 在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中加入一定量的十二烷基硫酸鈉(SDS)，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小。而其他因素對電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量間時，電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈直線關(guān)系。五 薄層電泳第七章 平面液相色譜2. 常用電泳分離技術(shù)4） SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)做單向電泳，不僅可以根據(jù)分子量大小對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，而且可以根據(jù)電泳遷移率大小測定蛋白質(zhì)的分子量。 SDS是一種陰離子去污劑，它在水溶液中以單體和分子團(tuán)的混合

32、形式存在。這種陰離子去污劑能破壞蛋白質(zhì)分子之間以及與其他物質(zhì)分子之間的非共價鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變原有的構(gòu)象，特別是在有強(qiáng)還原劑(例如巰基乙醇)存在的情況下，由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原劑打開并不易再被氧化，這就保證了蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合從而形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。實驗證明，與蛋白質(zhì)結(jié)合的是SDS單體，單體濃度與SDS總濃度、溫度以及離子強(qiáng)度有關(guān)。五 薄層電泳第七章 平面液相色譜2. 常用電泳分離技術(shù)4） SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 當(dāng)SDS單體濃度大于1mmo1/L時，對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說，平均每克蛋白質(zhì)可結(jié)合1.4g SDS。蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合后，所帶上的SDS負(fù)

33、電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而也就掩蓋或消除了不同種類蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在水溶液中的形狀類似于長橢圓棒，不同的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，其橢圓棒的短軸長度是恒定的，約為18埃，而長軸的長度則與蛋白質(zhì)分子量的大小成正比例地變化。這樣的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在SDS-聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中的電泳遷移率便不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀等因素的影響，而主要取決于橢圓棒的長軸長度即蛋白質(zhì)分子量大小這一因素。SDS動畫五 薄層電泳第七章 平面液相色譜2. 常用電泳分離技術(shù)5）等速電泳 等速電泳（又稱為：置換電泳、離子移動法、恒電泳）是一種不連續(xù)介質(zhì)電泳技術(shù)。 等速電泳在電泳達(dá)成平衡后，各區(qū)帶相隨，分成清晰的界面，以等速移動。按濃度對距離作圖也是臺階狀，但不同于移界電泳，它的區(qū)帶沒有重疊，而是分別保持。 五 薄層電泳第七章 平面液相色譜2. 常用電泳分離技術(shù)6）等電聚焦 帶有電荷的蛋白質(zhì)分子可在電場中泳動，其泳動率隨其所帶電