分光光度計(jì)測(cè)還原糖含量實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)名稱：班級(jí)：實(shí)驗(yàn)人：實(shí)驗(yàn)時(shí)間：研究背景與目的:掌握還原糖含量測(cè)定的方法之一的3,5-二硝基水楊酸比色法，熟悉722 分光光度計(jì)的主要用途、工作原理及使用流程。書實(shí)驗(yàn)原理：已知在植物體內(nèi)含有一定量的還原糖，利用還原糖的還原性，使其與3,5-二 硝基水楊酸反應(yīng)，生成有吸光性的3-氨基-5硝基水楊酸。在某濃度范圍內(nèi)，該物質(zhì)在 540nm下的光吸收與還原糖含量成正比，通過測(cè)定該物質(zhì)的消光值，查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，便 可得樣品中還原糖含量。儀器與試劑：722光柵分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）電熱恒溫水浴鍋（型號(hào)：雙列八孔 標(biāo)號(hào)：09035天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有 限公司）電磁爐架盤天平具塞刻度試

2、管15ml*9移液器100ul1000ul容量瓶100ml*9燒杯 研缽 漏斗2mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液10mg/ml 3,5-二硝基水楊酸溶液蒸餾水實(shí)驗(yàn)步驟：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取7只15ml具塞刻度試管，編號(hào)，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、 1.0毫升，然后用移液器向各試管加蒸餾水，使最后體積為1.0毫升，搖勻，再各加入 3,5-二硝基水楊酸溶液1毫升，搖勻，在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5分鐘，取出冷卻至室溫， 用蒸餾水稀釋至15毫升混勻，用分光光度計(jì)在540nm下測(cè)定消光值。以消光值為縱坐 標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。植物樣品中還原糖的提取將植物樣品一蘋果稱取1

3、g放入研缽中，加入少量石英砂，磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到100毫升 容量瓶中，用蒸餾水少量多次地清洗研缽，再將洗液轉(zhuǎn)移到容量瓶中，至70-80ml，搖 勻，置于80度恒溫水浴中浸提半小時(shí)，其間搖勻數(shù)次，是還原糖浸出。還原糖含量的測(cè)定.待上述提取液冷卻到室溫，過濾，濾液達(dá)十幾毫升即可，取濾液1毫升放入15ml具塞 刻度試管中，加入1毫升3,5-二硝基水楊酸溶液，搖勻后在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5分鐘， 取出冷卻后稀釋到15毫升。使用722分光光度計(jì)測(cè)定OD540值。（作兩個(gè)重復(fù)組取平 均值）。數(shù)據(jù)整理與計(jì)算:標(biāo)準(zhǔn)曲線1.000 r.0.800度 0.600 吸 0.400 0.2000.0001111110.00

4、00 0.0200 0.0400 0.0600 0.0800 0.1000 0.1200 0.1400濃度mg/ml編號(hào)12345678濃度mg/ml0.00000.01330.04000.06670.09330.12000.13330.0531吸光度0.0000.0630.2540.4560.6580.8390.9410.3540.05250.350從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出樣品的OD540值對(duì)應(yīng)的還原糖量A（mg/ml），然后按下列公式計(jì)算 樣品中還原糖含量。還原糖含量（）=【A*樣品稀釋總體積（ml）/ （樣品重*1000）】 *100%將數(shù)據(jù)代入公式，得（1）還原糖含量=【0.0531*15*1

5、00/（1*1000）】*100%=7.96%（2）還原糖含量=【0.0525*15*100/（1*1000）】*100%=7.88%（3）平均值=（7.96%+7.88%）=7.92%結(jié)果分析：所得兩組數(shù)據(jù)的吸光度值不相同，以至于所得濃度也不相同，其中可能存在的原因是使 用具塞刻度試管稀釋時(shí)存在終點(diǎn)標(biāo)定誤差。然而兩組數(shù)據(jù)取平均值，使誤差減小在允許 范圍內(nèi)。思考題：比色測(cè)定法的原理及特點(diǎn)是什么？原理：光吸收定律即朗伯-比爾定律，由于物質(zhì)對(duì)光有選擇吸收的作用且在一定濃度范 圍內(nèi)，物質(zhì)在某波長(zhǎng)下的光吸收與其濃度成正比，所以利用標(biāo)準(zhǔn)溶液求得標(biāo)準(zhǔn)光吸收曲 線，再根據(jù)所得吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中尋找相對(duì)應(yīng)的

6、點(diǎn)即可知道未知溶液的濃度。光吸收簡(jiǎn)便，快速，靈敏度高，準(zhǔn)確度較高，應(yīng)用廣泛。比色測(cè)定法中為什么要設(shè)空白，設(shè)空白時(shí)要注意什么？消除溶液中其他因素的影響，設(shè)置空白時(shí)要注意只有葡萄糖濃度一個(gè)自變量變化，保證 其他量均相同。試分析一下樣品的稀釋倍數(shù)是如何確定的以及對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)原理中講到，在一定濃度范圍內(nèi)，吸光度與還原糖含量呈正比，由于吸光度要控制在0.2至0.8之間，所以所需濃度便可知，即可通過稀釋溶液實(shí)現(xiàn)。 如果不在范圍內(nèi)，則超出呈正比的范圍，所得濃度就會(huì)不準(zhǔn)確。為什么還原糖與3,5-二硝基水楊酸溶液要先反應(yīng)后稀釋？因?yàn)橄♂屒斑€原糖濃度較高，并且3,5-二硝基水楊酸溶液過量，這樣可以使得還

7、原糖充 分反應(yīng)，如果先稀釋則還原糖濃度較低，反應(yīng)時(shí)間加長(zhǎng)，速率較慢。結(jié)合實(shí)際應(yīng)用，你認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有什么不合理之處？實(shí)驗(yàn)中，容量瓶的使用。參考文獻(xiàn)：揭念芹基礎(chǔ)化學(xué)2000年9月第一版2008年7月第八次印刷孫英分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)2009年3月第一版袁靜明趙強(qiáng)3,5 二硝基水楊酸法測(cè)定葡萄糖方法的改進(jìn)（山西大 學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）1986年01期722分光光度計(jì)的使用說明 HYPERLINK /view/92586d37ee06eff9aef8079b.html /view/92586d37ee06eff9aef8079b.html實(shí)驗(yàn)小結(jié)：這是第一次的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)，與同伴的配合中仍然存在著默契程度不足的問題，相信在 日后的實(shí)驗(yàn)中會(huì)有所改進(jìn)，其次，由