脊髓背角PKC在炎性疼痛中的作用及其機制(共9頁)

1、脊髓(j su)背角PKC在慢性炎性疼痛(tngtng)中的作用及其機制索占偉基金項目：國家自然科學基金資助項目（No. 30870837；No. 81072626）；教育部“新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”（No. NCET-08-0259）；蘭州大學中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助項目（No. 860330）作者簡介：索占偉（1978-），男，博士，講師，科研方向：慢性疼痛的中樞發(fā)生機制，E- mail: suozhw.*胡曉東（1972-），男，博士，教授，研究方向：慢性疼痛的中樞發(fā)生機制，通訊作者，TelFax: E- mail: hu

2、xxiaodong. 楊嫻 曹靜 劉燕妮 時蕾 李帥 楊鴻斌 胡曉東*（蘭州大學(ln zhu d xu)藥學院分子藥理研究所，蘭州 730000）摘要： 目的 探討蛋白激酶C ( Protein kinase C；PKC ) 的抑制劑和阻斷劑對痛覺超敏的影響及其分子機制。方法 小鼠后趾皮下注射完全弗氏佐劑( Complete Freunds Adjuvant; CFA )建立炎性疼痛模型；鞘內給予PKC抑制劑白屈菜赤堿（Chelerythrine；CHE）或激動劑 Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 前后，測定小鼠縮足閾值；隨后立即分離脊髓背角，免疫印

3、跡法檢測NMDA ( N-methyl-D-aspartate ) 型谷氨酸受體的突觸表達。結果 PKC抑制劑CHE在緩解炎性痛覺超敏的同時，明顯翻轉脊髓DMNA受體NR2B亞基的突觸表達亢進；而正常小鼠鞘內給予PKC激動劑PMA，可模擬CFA的效應，即：誘發(fā)痛覺超敏、并特異性增加NR2B的突觸含量。結論 PKC通過調節(jié)脊髓NMDA受體NR2B的突觸表達，參與炎性疼痛的形成。關鍵詞：蛋白激酶C; Chelerythrine; PMA; 炎性疼痛; NMDA受體脊髓背角是痛覺信息傳遞與調控的第一站。初級傳入纖維通過興奮性谷氨酸能突觸傳遞，將傷害性或非傷害性刺激從外周向中樞輸送。在脊髓背角表達的三

4、種興奮性谷氨酸能受體中，NMDA受體的功能異常升高，被認為在慢性疼痛的形成和維持中發(fā)揮核心作用。而脊髓背角中的NMDA受體主要是由2個功能性NR1亞基和2個調節(jié)性NR2A或2個NR2B亞基所組成的四聚體。進一步的深入研究顯示1：炎性疼痛能夠特異性提高脊髓背角中“包含NR2B亞基的NMDA受體(簡稱NR2BR)”的突觸表達；當特異性阻斷NR2BR后，組織或神經損傷誘發(fā)的痛覺超敏和痛覺過敏會被完全取消2，提示：NR2BR的突觸表達亢進在慢性疼痛中的作用尤為關鍵。而深入探討NR2BR表達的分子調控機制，對揭示慢性疼痛的中樞發(fā)生機制和探尋新的藥物鎮(zhèn)痛靶點都具有重要意義?，F(xiàn)已知，NMDA受體的突觸表達(

5、biod)受一系列蛋白激酶的調控。蛋白激酶C ( Protein kinase C；PKC )是一種重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶(jmi)，在突觸傳遞和突觸可塑性過程中發(fā)揮重要作用。資料顯示：活化的PKC可取消Mg2+對NMDA受體的阻斷(z dun)，增強受體通道的開放 3；此外，PKC也能夠通過磷酸化NR1亞基胞漿C-末端的S-890、S-896等多個絲氨酸位點4，顯著增強NMDA受體的功能。但PKC是否能夠干預NMDA受體的突觸表達、并參與慢性疼痛過程，到目前為止尚不清楚。為探討PKC對NMDA受體突觸功能的調節(jié)作用及其與炎性疼痛的關系，本研究利用PKC抑制劑CHE和激動劑PMA，觀察PKC

6、對炎性痛覺超敏的影響，并通過免疫印跡法檢測PKC對脊髓背角NMDA受體亞基突觸表達的調節(jié)作用，探討其參與痛覺調制的分子機制。1 材料和方法1.1 動物 昆明種成年小鼠（, 2022g），由蘭州大學實驗動物中心提供。1.2 試劑 Chelerythrine（CHE；Sigma）；Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA；Sigma)；完全弗氏佐劑（Complete Freunds Adjuvant, CFA; Sigma）；特異性NR2B、NR2A抗體（Millipore Corporation, Temecula, CA, USA）；辣根過氧化物（HRP）標記二

7、抗（Jackson Immuno Research Laboratories, Baltimore, PA, USA）；-Actin抗體、ECL發(fā)光試劑盒（江蘇碧云天）。1.3 疼痛模型制備及行為學測試 對照組小鼠皮下注射20l生理鹽水，模型組右后趾皮下注射等量CFA。模型制備前后，采用Up-Down法1 測定Von Frey纖維誘發(fā)的縮足閾值（PWT）。1.4 鞘內給藥 采用微量注射法5。動物經苯巴比妥鈉（30mgkg-1）肌注麻醉后，用25l 微量注射器于L5-L6椎間隙經皮穿刺，以進針產生空洞感、動物甩尾作為針頭進入蛛網膜下腔為標志。進針后緩慢注射藥物5l，對照組注射同等體積的生理鹽水。

8、1.5 亞細胞(xbo)結構分離 鞘內給藥20min后，經苯巴比妥鈉麻醉，施行(shxng)錐形板切開術，分離L4-L5節(jié)段脊髓，在4細胞(xbo)裂解緩沖液中進行勻漿1。勻漿液通過梯度離心，提取得到富含突觸后密致（PSD）的亞細胞結構，具體步驟為：1000g離心勻漿液10min，取上清（S1）；S1經10 000g離心，收集富含突觸小體(Crudesyntosomal fractions)的沉淀P2；P2用含0.5%Triton X-100的細胞緩沖液裂解15min后，32 000g離心20min，得到富含突觸PSD的亞細胞結構的沉淀P3。以上操作均在4調節(jié)下進行。P3經重懸浮，煮沸5min

9、后，進行Western Blot免疫印跡檢測。1.6 免疫印跡 用8% SDS電泳分離蛋白，隨后轉移到PVDF膜上；經5%脫脂奶粉封閉30min 后，以相應檢測蛋白的抗體4孵育過夜；印跡膜經洗滌后，用HRP標記的二抗室溫孵育1h,以ECL發(fā)光試劑盒顯像，分子量相同的蛋白應用Strip法重檢測顯影；以Image J 軟件進行圖像分析。1.7 數據統(tǒng)計 結果均以表示；采用Sigma State分析軟件進行組間t檢驗。2 結果2.1 PKC抑制劑CHE對CFA誘發(fā)的痛覺超敏的影響 實驗動物分為5組： 對照組：右后趾皮下注射生理鹽水，24h后鞘內注射5l 生理鹽水； CFA組：右后趾皮下注射CFA，2

10、4h后鞘內注射5l 生理鹽水； 0.05g CHE 給藥組：右后趾皮下注射CFA，24h后鞘內注射5l CHE(0.05g)； 0.1g CHE 給藥組：右后趾皮下注射CFA，24h后鞘內注射5l CHE(0.1g)； 0.2 g CHE 給藥組：右后趾皮下注射CFA，24h后鞘內注射5l CHE(0.2g)。結果顯示：CFA組動物在注射CFA 24h 后，其縮足閾值顯著低于對照組，提示形成痛覺超敏；與CFA組相比，0.1g 與0.2g CHE組動物在給藥10min后，縮足閾值開始升高，20min 到達峰值，且其作用至少持續(xù)30min，而0.1g CHE 給藥組縮足閾值在各時間點均與CFA組無

11、顯著差異，說明CHE可劑量依賴性抑制CFA誘發(fā)的痛覺超敏(Fig 1)。2.2 PKC激動劑PMA對痛覺閾值的影響 實驗動物分為4組：對照組鞘內注射5l 生理鹽水；其它三種劑量的試驗組分別注射0.01g、0. 1g和1g PMA。結果顯示：與對照組相比，0.01g PMA 給藥組動物的縮足閾值無明顯改變，而0.1g PMA 與1g PMA 給藥組動物縮足閾值明顯下降，并在維持40min后，逐漸靠近對照組縮足閾值。說明直接激動PKC可誘發(fā)痛覺超敏(Fig 2)。2.3 PKC抑制劑CHE對脊髓背角NMDA受體表達(biod)的影響 在行為學測試后，立即(lj)分離對照組、CFA組和0.2g CH

12、E組動物的脊髓背角(bi jio)，經亞細胞結構分離得到富含PSD的蛋白樣品，用免疫印跡法檢測NR2BR和NR2AR的突觸表達。結果顯示：與對照組相比，CFA組動物的NR2BR突觸含量顯著升高，而NR2AR的突觸含量無顯著變化，提示CFA可特異性引發(fā)NR2BR的突觸表達亢進；與CFA組相比，CHE組NR2BR突觸含量明顯降低，而NR2AR的突觸含量無明顯改變，提示CHE可特異性逆轉CFA引發(fā)的NR2BR突觸表達亢進，從而緩解炎性疼痛。2.4 PKC激動劑PMA對脊髓背角NMDA受體表達的影響 在行為學測試后，立即分離對照組和1g PMA組動物的脊髓背角，檢測NR2BR和NR2AR的突觸表達。結

13、果顯示：PMA組動物的NR2BR突觸含量顯著高于對照組，而NR2AR的突觸含量與對照組無明顯差異(Fig 3)。提示PMA可能特異性促進NR2BR的突觸表達，從而引發(fā)痛覺超敏。 3.討論PKC是體內分布廣泛的主要絲/蘇氨酸激酶，可改變-氨基丁酸受體(GABA receptor)、甘氨酸受體等多種配體門控性離子通道功能6。文獻報道7，PKC 的活化可增強體外培養(yǎng)海馬神經元突觸NMDA受體功能和其突觸輸送(Synaptic trafficking)，但對其在炎性疼痛中的作用及其機制尚不十分清楚。本研究以CFA慢性疼痛模型證實，鞘內給予PKC抑制劑CHE可顯著緩解慢性炎性疼痛。此結果與CHE抑制福爾

14、馬林誘發(fā)急性炎性疼痛的報道一致8。目前已證實9，激動PKC可通過促進傳入神經元P物質以及降鈣素基因相關肽(CGRP，calcitonin gene related peptide)的釋放而引發(fā)外周致敏，抑制PKC可起到緩解作用。本研究在體的免疫印跡試驗證明，PKC抑制劑CHE在緩解炎性疼痛的同時，能特異性抑制脊髓背角NR2B亞基的突觸表達亢進。提示抑制PKC活性可在外周和脊髓水平同時產生鎮(zhèn)痛效應。為進一步證實PKC在中樞超敏中的作用，本研究涉及了PKC激動劑PMA對正常小鼠痛覺閾值和NMDA突觸表達的影響。結果顯示，鞘內注射PMA可模擬CFA的效應，在誘發(fā)小鼠痛覺超敏的同時，可選擇性引起突觸N

15、R2B亞基的表達亢進。由此可見，PKC可能通過調制脊髓背角NR2BR的突觸表達，在炎性疼痛中發(fā)揮重要作用。NMDA的兩種NR2亞基在體內具有不同的分布特點、發(fā)育(fy)規(guī)律以及生理和藥理特性。NR2B亞基是胚胎期主要的NR2受體單元，主要分布于與疼痛傳導密切相關的前腦和脊髓背角的層和層，但隨機體的發(fā)育(fy)大部分逐漸被NR2A亞基所代替。本研究中，皮下注射CFA以及鞘內注射PMA均能特異性引起脊髓背角突觸NR2B亞基的表達(biod)升高，但并未影響NR2A亞基的表達。此結果與以往的相關報道一致10，也進一步說明了NR2B亞基在炎性疼痛中的主導作用。然而，至目前在NR2B亞基并未發(fā)現(xiàn)直接的絲

16、/蘇氨酸激酶磷酸化位點，推測PKC可能通過其它間接途徑引起NR2B亞基的磷酸化。研究證明，NR2B亞基C末端有Scr家族酪氨酸激酶（SFKs）磷酸化位點NR2B-Y1472，其磷酸化被認為是決定NR2B突觸含量的核心因素11。而Scr是PKC重要的下游信號分子，因此推測PKC可能通過活化Src，進而催化NR2B磷酸化，最終引起突觸表達的升高12-13。另外，PKC在中樞神經系統(tǒng)涵蓋PKC、PKC、PKC、PKC等多種類型的同工酶，且具有不同的功能14。本研究所用的PMA和CHE均屬非特異性PKC調節(jié)劑，因此，究竟何種特異性同工酶在炎性疼痛中起主導作用，尚需進一步研究。參考文獻1 Yang X,

17、 Yang H B, Xie Q J, et al. Peripheral inflammation increased the synaptic expression of NMDA receptors in spinal dorsal hornJ. Pain, 2009, 144: 1629.2 Malmberg A B, Gilbert H, Mccabe R T, et al. Powerful antinociceptive effects of the cone snail venom-derived subtype-selective NMDA re-ceptor antagon

18、ists conantokins G and T J. Pain, 2003, 101: 10916.3 Chen L, Huang L Y. Protein kinase C reduces Mg2+ block of NMDA-receptor channels as a mechanism of modulation J. Nature, 1992, 356: 521523.4 HYPERLINK /pubmed?term=%22Stephenson%20FA%22%5BAuthor%5D Stephenson F A, HYPERLINK /pubmed?term=%22Cousins

19、%20SL%22%5BAuthor%5D Cousins S L, HYPERLINK /pubmed?term=%22Kenny%20AV%22%5BAuthor%5D Kenny A V. Assembly and forward trafficking of NMDA receptors J. HYPERLINK javascript:AL_get(this,%20jour,%20Mol%20Membr%20Biol.); o Molecular membrane biology. Mol Membr Biol, 2008, 25: 31120.5 Hylden J L,Wilcox G

20、 L. Intrathecal morphine in mice: a new techniqueJ. Eur J Pharmacol, 1980, 67: 3136.6 Feng J, Cai X, Zhao J, et al. Serotonin receptors modulate GABAA receptor channels through activation of anchored protein kinase C in prefrontal cortical neurons J. J Neurosci, 2001, 21: 650211.7Lan J Y, Skeberdis

21、V A, Jover T, et al. Protein kinase C modulates NMDA receptor trafficking and gating J. Nature, 2001, 4: 382390.8 Wajima Z, Hua X Y,Yaksh T L. Inhibition of spinal protein kinaseCblocks substance P-mediated hyperalgesia J. Brain Res, 2000, 877: 31421.9 Kandy T V, Husam M, Sarah M S. Protein kinase C

22、 in pain: Involvement of multiple isoforms J. Pharmacological Research, 2007, 55: 57889.10 Ting-Ting Li, Wen-Hua Ren, Xiao-nan Zhang, et al. Down-regulation of NR2B receptors partially contributes to analgesic effects of Gentiopicroside in persistent inflammatory painJ. Neuropharmacology, 2008, 54:

23、1175-1181.11 Guo W, Wei F, Zou S, et al. Group I metabotropic glutamate receptor NMDA receptor coupling and signaling cascade mediate spinal dorsal horn NMDA receptor 2B tyrosine phosphorylation associated with inflammatory hyperalgesia J. J Neurosci, 2004, 24: 916173.12 Lu W Y，Xiong, Z G，Lei S, et

24、al. G-protein-coupled receptors act via protein kinase C and Src to regulate NMDA receptors J. Nat Neurosci, 1999, 2: 331-813 Huang Y, Lu W, Ali, D W，Lei S, et al. CAKbeta/Pyk2 kinase is a signaling link for induction of long-term potentiation in CA1 hippocampus J. Neuron, 2001, 29: 485-96.14 Igwe,

25、O J. Agents that act by different mechanisms modulate the cativity of protein kinase C isozyme in the rat spinal cord during peripheral inflammation J. Neuroscience, 2006, 138: 31328.Involvement of spinal PKC in inflammatory pain and its underlying mechanismsSUO Zhan-wei, YANG Xian, CAO Jing, LI Shu

26、ai, LIU Yan-Ni, SHI Lei, HU Xiao-dong*(Department of Molecular Pharmacology, School of Pharmacy, Lanzhou University, Lanzhou, 730 000, PR China)Abstract: Aim To investigate the role of Protein kinase C (PKC) in inflammatory pain and underlying mechanisms. Methods Complete Freunds Adjuvant(CFA) was i

27、njected into the plantar surface of the hindpaw of mice to induce inflammatory pain. Paw Withdrawal Threshold (PWT) was measured before and after intrathecal administration of PKC blocker Chelerythrine (CHE) or agonist Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Immediately after behavioral test, L4-L5 s

28、pinal dorsal horn was removed for inmmunoblotting analysis of the expression of NMDA receptors. Results PKC inhibitor CHE simultaneously reversed the mechanical allodynia and the increase in the synaptic expression of NMDA receptor NR2B subunit in CFA-induced inflamed mice. Direct activation of PKC

29、by intrathecal application of PKC agonist PMA mimicked the effects of CFA by evoking mechanical allodynia and NR2B synaptic accumulation in spinal dorsal horn. Conclusion PKC were involved in formation of inflammatory pain by regulating synaptic expression of NMDA receptor NR2B subunit. 圖表(tbio)及其說明

30、Fig 1Fig 1 PKC blocker Chelerythrine reversed the mechanical allodynia induced by CFAIntrathecal administration of CHE significantly elevated the Paw Withdrawal Threshold in CFA-injected mice(). The upward and downward arrows indicated the time points when intraplantar CFA and intrathecal CHE were injected, respectively. *P0.05, *P0.01 vs CFA group.（注：建議(jiny)將此圖置于正文(zhngwn)“結果2.1”部分附近）Fig 2.Fig 2 PKC agonist PMA evok