生物化學(xué)酶的本質(zhì)和組成課件

1、1Biochemistrychapter2 enzyme2第二章 酶 第一節(jié) 酶的基本特性 第二節(jié) 酶的命名與分類(lèi) 第三節(jié) 酶的催化機(jī)理 第四節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 第五節(jié) 酶活性的調(diào)控3Enzyme is biocatalyst酶是活細(xì)胞產(chǎn)生的一類(lèi)具有催化功能的生物分子，所以又稱(chēng)為生物催化劑(biocatalysts） 絕大多數(shù)的酶都是蛋白質(zhì)。酶催化的生物化學(xué)反應(yīng)，稱(chēng)為酶促反應(yīng)（Enzymatic reaction）。在酶的催化下發(fā)生化學(xué)變化的物質(zhì)，稱(chēng)為底物（substrate）。第一節(jié) 酶的基本特性4一、酶的本質(zhì)和組成1926年,James Summer由刀豆制出脲酶結(jié)晶確立酶是蛋白質(zhì)的觀念，

2、其具有蛋白質(zhì)的一切性質(zhì)。19811982年，Thomas R.Cech實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有催化活性的天然RNARibozyme。L19 RNA和核糖核酸酶P的RNA組分具有酶活性是兩個(gè)最著名的例子。抗體酶（abzymes）：1986年，Richard Lerrur和Peter Schaltz運(yùn)用單克隆抗體技術(shù)制備了具有酶活性的抗體（catalytic antibody）。酶的不同形式單體酶(monomeric enzyme)：僅具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的酶.寡聚酶(oligomeric enzyme)：由多個(gè)相同或不同亞基以非共價(jià)鍵連接組成的酶。多酶體系(multienzyme system)：由幾種不同功能的酶彼

3、此聚合形成的多酶復(fù)合物。多功能酶(multifunctional enzyme)或串聯(lián)酶(tandem enzyme)：一些多酶體系在進(jìn)化過(guò)程中由于基因的融合，多種不同催化功能存在于一條多肽鏈中，這類(lèi)酶稱(chēng)為多功能酶。酶的分子組成蛋白質(zhì)部分：酶蛋白(apoenzyme)輔助因子(cofactor) 金屬離子小分子有機(jī)化合物全酶(holoenzyme)結(jié)合酶 (conjugated enzyme)單純酶 (simple enzyme)7*各部分在催化反應(yīng)中的作用酶蛋白決定反應(yīng)的特異性輔助因子決定反應(yīng)的種類(lèi)與性質(zhì)金屬酶(metalloenzyme)金屬離子與酶結(jié)合緊密，提取過(guò)程中不易丟失。 金屬激活

4、酶(metal-activated enzyme) 金屬離子為酶的活性所必需，但與酶的結(jié)合不甚緊密。 8金屬離子的作用穩(wěn)定酶的構(gòu)象； 參與催化反應(yīng)，傳遞電子；在酶與底物間起橋梁作用；中和陰離子，降低反應(yīng)中的靜電斥力等。小分子有機(jī)化合物的作用在反應(yīng)中起運(yùn)載體的作用，傳遞電子、質(zhì)子或其它基團(tuán)。9輔助因子分類(lèi)（按其與酶蛋白結(jié)合的緊密程度） 輔酶 (coenzyme):與酶蛋白結(jié)合疏松，可用透析或超濾的方法除去。 輔基 (prosthetic group):與酶蛋白結(jié)合緊密，不能用透析或超濾的方法除去。10二、酶的催化特點(diǎn)(characteristic)酶是生物催化劑，與無(wú)機(jī)催化劑相比，二者有共性；但

5、酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，又在生物體內(nèi)作用，因此酶的作用又有特性。11酶和一般催化劑的共性1.用量少而催化效率高；2.它能夠改變化學(xué)反應(yīng)的速度，但是不能改變化學(xué)反應(yīng)平衡。3.只能催化熱力學(xué)允許的反應(yīng)，在反應(yīng)前后不發(fā)生改變。12酶催化作用特性高效性專(zhuān)一性13酶的催化作用可使反應(yīng)速度提高106 -1012倍。 例如：過(guò)氧化氫分解 2H2O2 2H2O + O2 用Fe+ 催化，效率為610-4 mol/mol.S，而用過(guò)氧化氫酶催化，效率為6106 mol/mol.S。用-淀粉酶催化淀粉水解，1克結(jié)晶酶在65C條件下可催化2噸淀粉水解。1高效性14酶的高效性與活化能和過(guò)渡態(tài)有關(guān)。152專(zhuān)一性 酶的專(zhuān)一

6、性 Specificity又稱(chēng)為特異性，是指酶在催化生化反應(yīng)時(shí)對(duì)底物的選擇性。根據(jù)專(zhuān)一性的不同又可分為： （1）立體化學(xué)專(zhuān)一性 立體異構(gòu) 幾何異構(gòu)（2）非立體化學(xué)專(zhuān)一性 鍵專(zhuān)一性 基團(tuán)專(zhuān)一性 絕對(duì)專(zhuān)一性16立體化學(xué)專(zhuān)一性酶的一個(gè)重要特性是能專(zhuān)一性地與手性底物結(jié)合并催化這類(lèi)底物發(fā)生反應(yīng)。例如，淀粉酶只能選擇性地水解D葡萄糖形成的1，4糖苷鍵。光學(xué)專(zhuān)一性 Optical Specificity17幾何專(zhuān)一性有些酶只能選擇性催化某種幾何異構(gòu)體底物的反應(yīng)，而對(duì)另一種構(gòu)型則無(wú)催化作用。如延胡索酸水合酶只能催化延胡索酸水合生成蘋(píng)果酸，對(duì)馬來(lái)酸則不起作用。18絕對(duì)專(zhuān)一性 有些酶對(duì)底物的要求非常嚴(yán)格，只作用于

7、一個(gè)特定的底物。這種專(zhuān)一性稱(chēng)為絕對(duì)專(zhuān)一性（Absolute specificity)。19有些酶的作用對(duì)象不是一種底物，而是一類(lèi)化合物或一類(lèi)化學(xué)鍵。這種專(zhuān)一性稱(chēng)為相對(duì)專(zhuān)一性(Relative Specificity)。包括族(group)專(zhuān)一性和鍵(Bond)專(zhuān)一性族(group)專(zhuān)一性。如-葡萄糖苷酶，催化由-葡萄糖所構(gòu)成的糖苷水解，但對(duì)于糖苷的另一端沒(méi)有嚴(yán)格要求。鍵(Bond)專(zhuān)一性。如酯酶催化酯的水解，對(duì)于酯兩端的基團(tuán)沒(méi)有嚴(yán)格的要求。鍵和基團(tuán)專(zhuān)一性20酶作用專(zhuān)一性的機(jī)制 酶分子活性中心部位，一般都含有多個(gè)具有催化活性的手性中心，這些手性中心對(duì)底物分子構(gòu)型取向起著誘導(dǎo)和定向的作用，使反應(yīng)可

8、以按單一方向進(jìn)行。“三點(diǎn)結(jié)合”的催化理論。認(rèn)為酶與底物的結(jié)合處至少有三個(gè)點(diǎn)，而且只有一種情況是完全結(jié)合的形式。只有這種情況下，不對(duì)稱(chēng)催化作用才能實(shí)現(xiàn)。21鎖 鑰 學(xué) 說(shuō)22鎖鑰學(xué)說(shuō)：認(rèn)為整個(gè)酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結(jié)合如同一把鑰匙對(duì)一把鎖一樣。23誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)24 當(dāng)?shù)孜锱c酶接近時(shí)，底物分子可以誘導(dǎo)酶活性中心的構(gòu)象發(fā)生改變，使之成為能與底物分子密切結(jié)合的構(gòu)象。25誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)該學(xué)說(shuō)認(rèn)為酶表面并沒(méi)有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀。26三、酶的活力測(cè)定(定量) 酶的活力:又稱(chēng)為酶活性，一般把酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱(chēng)為酶活力

9、，酶的活力大小可用在一定條件下它所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的速度來(lái)表示,即可用單位時(shí)間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來(lái)表示. 一般采用高底物濃度S100Km(零級(jí)反應(yīng))測(cè)定初速度來(lái)定量酶濃度.27 酶活力單位:最適條件下,單位時(shí)間內(nèi),酶催化底物的減少量或產(chǎn)物的生成量. 1個(gè)U（1U）:特定條件下,1分鐘內(nèi)生成1微摩爾產(chǎn)物的酶量(或轉(zhuǎn)化1微摩爾底物的酶量). Kat:最適條件下,每秒鐘可使1摩爾底物轉(zhuǎn)化的酶量. 即1Kat=6107IU 28酶的轉(zhuǎn)換數(shù)（turnover number）單位時(shí)間，每個(gè)催化中心所轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)。通常指每秒鐘每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換底物的微摩爾數(shù)，在數(shù)值上，KcatK3酶

10、的比活力酶純度的量度每毫克酶蛋白所具有的酶活力，或單位質(zhì)量、單位體積的酶活力單位：U/g U/mL29酶活力測(cè)定方法分光光度法（如mtt）熒光法同位素標(biāo)記法電化學(xué)方法層析法旋光法顯色方法（淀粉酶活性的測(cè)定）30目的：研究酶的理化性質(zhì)。 包括結(jié)構(gòu)與功能、生物學(xué)作用。 作為生化試劑及用作藥物的酶要求純度高四、酶的分離和純化31根據(jù)酶在體內(nèi)作用部位胞外酶-易分離胞內(nèi)酶-須破碎cell分離提純的原則選擇酶含量豐富的材料目前多采用微生物發(fā)酵的方法來(lái)獲取大量的酶制劑避免蛋白質(zhì)變性：避免強(qiáng)酸、強(qiáng)堿，低溫，每一步驟，都要測(cè)定酶的總活力和比活力32a選材：動(dòng)物、植物 ：含酶量高，易分離細(xì)胞內(nèi)酶分離提純的步驟選材

11、-破碎細(xì)胞-抽提-純化-保存33b破碎細(xì)胞 動(dòng)物 細(xì)菌 植物 研磨 超聲波 纖維素酶勻漿 溶菌酶 搗碎機(jī) 化學(xué)溶劑 (甲苯) 提取液c抽提抽提條件的選取應(yīng)根據(jù)酶的溶解度和穩(wěn)定性等。 （用稀鹽、稀酸、稀堿溶液抽提）鹽：一般用等滲鹽溶液，如0.05mol/L 的PBS， 0.15mol/L的NaCl等；T：一般在0 4；pH在其穩(wěn)定范圍內(nèi)且遠(yuǎn)離其等電點(diǎn)。34操作要求： A. 盡量減少酶活性的損失 B. 低溫 05 攝氏度 有機(jī)溶劑：-15 -20攝氏度 C. 抽提液加入EDTA（絡(luò)合金屬） D. 抽提液加入巰基乙醇（防止-SH氧化失活） E. 不能過(guò)度攪拌，以免產(chǎn)生大量泡沫，使酶變性 F. 測(cè)定酶

12、的比活力 35d. 純化: 小分子能自然去除,大分子中核酸用魚(yú)精蛋白或MnCl2沉淀去除,粘多糖用醋酸鉛去除。 而主要工作則是去除雜蛋白。 純化方法與蛋白質(zhì)基本相同,此外常用選擇性變性法如選擇性熱變性法(某些酶耐熱).36純化方法選擇性變性法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀方法吸附分離方法幾種方法配合使用37 提純的目的:含量+純度工藝的選擇應(yīng)權(quán)衡含量與純度,根據(jù)酶的應(yīng)用目的和經(jīng)濟(jì)效益取得一個(gè)平衡點(diǎn).每一步都要測(cè)定酶的純度(比活力)并計(jì)算純化倍數(shù)和產(chǎn)率以決定該步驟的效益和取舍.酶的比活力(純度)=活力單位數(shù)/毫克蛋白純化倍數(shù)=每次比活力/第一次比活力產(chǎn)率=(每次總活力/第一次總活力) 100%3

13、8e保存 將酶制品濃縮，結(jié)晶，以便保存（-20）注意：酶易失活，不可烘干?？捎玫姆椒ǎ海?） 保存濃縮的酶液：（2） 濃縮液加入等體積甘油 -20長(zhǎng)期保存39（一）習(xí)慣命名方法 （1）根據(jù)作用底物來(lái)命名，如淀粉酶、蛋白酶等。（2）根據(jù)所催化的反應(yīng)的類(lèi)型命名，如脫氫酶、 轉(zhuǎn)移酶等。（3）兩個(gè)原則結(jié)合起來(lái)命名，如丙酮酸脫羧酶等。（4）根據(jù)酶的來(lái)源或其它特點(diǎn)來(lái)命名，如胃蛋白 酶、胰蛋白酶等。酶的命名(nominate)第二節(jié) 酶的命名和分類(lèi)40（二）國(guó)際系統(tǒng)命名法 系統(tǒng)名稱(chēng)包括底物名稱(chēng)、構(gòu)型、反應(yīng)性質(zhì)，最后加一個(gè)酶字。 例如： 習(xí)慣名稱(chēng):谷丙轉(zhuǎn)氨酶 系統(tǒng)名稱(chēng):丙氨酸：-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng):

14、 谷氨酸 + 丙酮酸 -酮戊二酸 + 丙氨酸41酶的編碼每個(gè)酶都有一個(gè)有四個(gè)數(shù)字組成的編碼乳酸脫氫酶E.C 1. 1. 1. 27第1大類(lèi)，氧化還原酶第1亞類(lèi)，氧化基團(tuán)CHOH第1亞亞類(lèi)，H受體為NAD+該酶在亞亞類(lèi)中的流水編號(hào)按照國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)的規(guī)定命名42（一）根據(jù)酶的化學(xué)組成可將酶分為：?jiǎn)渭兊鞍酌割?lèi)：只含有蛋白質(zhì)成分；結(jié)合蛋白酶類(lèi)（全酶）：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（輔助因子）。二、酶的分類(lèi)43（二）根據(jù)酶蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可將酶分為單體酶：只含一條多肽鏈。以一個(gè)獨(dú)立的三級(jí)結(jié)構(gòu)為完整生物功能分子的最高結(jié)構(gòu)形式的酶。寡聚酶：含多條多肽鏈亞基。以一個(gè)獨(dú)立的四級(jí)結(jié)構(gòu)為完整生物功能分子的最高結(jié)

15、構(gòu)形式的酶。多酶復(fù)合體：由多種酶彼此鑲嵌成一個(gè)功能完整的具有特定結(jié)構(gòu)的復(fù)合體, 它們相互配合依次進(jìn)行，催化連續(xù)的 一系列相關(guān)反應(yīng)。44 根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類(lèi)型，按照國(guó)際系統(tǒng)分類(lèi)方法，將酶分為六大類(lèi)：45氧化-還原酶,催化氧化-還原反應(yīng)。主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。1 氧化-還原酶46 轉(zhuǎn)移酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個(gè)底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)底物的分子上。例如， 谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。2 轉(zhuǎn)移酶CH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH

16、2CH3CCOOHO47水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng)：3 水解酶484 裂合酶 裂合酶催化從底物分子中移去一個(gè)基團(tuán)或原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如， 延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。49異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過(guò)程。例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。常見(jiàn)的有消旋和變旋、醛酮異構(gòu)、順?lè)串悩?gòu)和變位酶類(lèi)。5 異構(gòu)酶50合成酶，又稱(chēng)為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 鍵的形成反應(yīng)。這類(lèi)反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。A

17、+ B + ATP + H-O-H = AB + ADP +Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)。丙酮酸 + CO2 草酰乙酸6 合成酶 51第三節(jié) 酶的催化機(jī)理52 酶的分子結(jié)構(gòu)是功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，不僅與一級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且與高級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。 酶活性中心 結(jié)合中心：酶與底物結(jié)合的部位， 決定酶的專(zhuān)一性催化中心：催化底物發(fā)生反應(yīng)的部位， 決定酶的催化效率、反應(yīng)性質(zhì)。酶的結(jié)構(gòu)與功能 活性部位：酶分子中直接與底物結(jié)合，并催化底物發(fā)生反應(yīng)的部位。酶活性中心包括兩個(gè)部位。53酶的活性中心酶的活性中心54主要包括：親核性基團(tuán)：絲氨酸的羥基，半胱氨酸的巰基 和組氨酸的咪唑基。酸堿性基團(tuán)：門(mén)冬氨酸和谷氨酸的羧基，賴(lài)

18、氨酸的氨基，酪氨酸的酚羥基，組氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巰基等。 必需基團(tuán)：在酶分子中和酶的催化活性直接有關(guān)的基團(tuán)，活性中心內(nèi)外都有。必需基團(tuán)：55底 物 活性中心以外的必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán) 活性中心 56酶作用的專(zhuān)一性主要取決于酶活性中心的結(jié)構(gòu)特異性。酶的活性中心與酶作用的專(zhuān)一性57如胰蛋白酶催化堿性氨基酸(Lys和Arg)的羧基所形成的肽鍵水解，胰凝乳蛋白酶則催化芳香族氨基酸(Phe.Tyr.和Trp.)的羧基所形成的肽鍵水解。X線衍射顯示胰蛋白酶分子的活性中心線絲氨酸殘基附近有一凹隙，其中有帶陰電荷的天冬氨酸側(cè)鏈(為結(jié)合基團(tuán))，故易與底物蛋白質(zhì)中帶陽(yáng)電荷的堿性氨基酸側(cè)鏈形成鹽鍵而結(jié)合咸

19、中間產(chǎn)物；而胰凝乳蛋白酶凹陷中則有非極性氨基酸側(cè)鏈，可供芳香族側(cè)鏈或其他大的非極性脂肪族側(cè)鏈伸入。通過(guò)疏水作用而結(jié)合，故這兩種蛋白酶有不同的底物專(zhuān)一性。58空間結(jié)構(gòu)與催化活性酶的活性不僅與一級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，并且與其空間結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，在酶活性的表現(xiàn)上，有時(shí)空間結(jié)構(gòu)比一級(jí)結(jié)構(gòu)更為重要。因?yàn)榛钚灾行男杞柚谝欢ǖ目臻g結(jié)構(gòu)才得以維持。有時(shí)只要酶活性中心各基團(tuán)的空間位置得以維持就能保持全酶的活性，而一級(jí)結(jié)構(gòu)的輕微改變并不影響酶活性。5960在酶促反應(yīng)中，底物分子結(jié)合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效濃度大大增加，有利于提高反應(yīng)速度；另一方面，由于活性中心的立體結(jié)構(gòu)和相關(guān)基團(tuán)的誘導(dǎo)和定向作用，使底物

20、分子中參與反應(yīng)的基團(tuán)相互接近，并被嚴(yán)格定向定位，使酶促反應(yīng)具有高效率和專(zhuān)一性特點(diǎn)。1.鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)二、 影響酶催化效率的有關(guān)因素 61 鄰 近 定 向 效 應(yīng)622.底物的形變與誘導(dǎo)契合 酶與底物結(jié)合后，使底物的某些敏感鍵發(fā)生“變形”(distortion)，從而使底物分子接近于過(guò)渡態(tài)，降低了反應(yīng)的活化能，同時(shí)，由于底物的誘導(dǎo)，酶分子的構(gòu)象也會(huì)發(fā)生變化，并對(duì)底物產(chǎn)生張力作用(strain)使底物扭曲，促進(jìn)ES進(jìn)入過(guò)渡狀態(tài)。633.共價(jià)催化 催化劑通過(guò)與底物形成反應(yīng)活性很高的共價(jià)過(guò)渡產(chǎn)物，使反應(yīng)活化能降低，從而提高反應(yīng)速度的過(guò)程，稱(chēng)為共價(jià)催化。酶中參與共價(jià)催化的基團(tuán)主要包括 His 的咪唑

21、基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羥基等。某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價(jià)催化作用。 644.酸堿催化酸-堿催化可分為狹義的酸-堿催化和廣義的酸-堿催化。酶參與的酸-堿催化反應(yīng)一般都是廣義的酸堿催化方式。廣義酸堿催化是指通過(guò)質(zhì)子酸提供部分質(zhì)子,或是通過(guò)質(zhì)子堿接受部分質(zhì)子的作用，達(dá)到降低反應(yīng)活化能的過(guò)程。655.活性部位微環(huán)境 疏水環(huán)境或酸堿性等。66Section 4 Kinetics of Enzyme-Catalyzed Reaction 第四節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)67影響酶促反應(yīng)的幾個(gè)因素底物濃度pH溫度酶濃度激活劑抑制劑S PE68酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)主要研究酶催

22、化的反應(yīng)速度以及影響反應(yīng)速度的各種因素。在探討各種因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響時(shí)，通常測(cè)定其初始速度來(lái)代表酶促反應(yīng)速度，即底物轉(zhuǎn)化量5%時(shí)的反應(yīng)速度。 69一、底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響（一）底物對(duì)酶促反應(yīng)的飽和現(xiàn)象70 反應(yīng)級(jí)數(shù)71（二）米氏方程式的推導(dǎo)： Michaelis & Menten 于1913年推導(dǎo)出了上述矩形雙曲線的數(shù)學(xué)表達(dá)式，即著名的米氏方程。 Vmax S Km S 72設(shè)： 反應(yīng)速度為初始速度，故略去第二步中的逆過(guò)程： E與S迅速生成ES復(fù)合物，并達(dá)到平衡（穩(wěn)態(tài)）； E + S k+1k-1k+2ESE + Pk-1 +k+2k+1Km =73（三）Km和Vmax的意義： 1.

23、 當(dāng)= Vmax2時(shí)，Km=S。因此，Km等于酶促反應(yīng)速度達(dá)最大值一半時(shí)的底物濃度。Vmax 2VmaxS Km + S =74 2. Km可以反映酶與底物親和力的大小。Km越小，酶與底物的親和力越大。E + S k+1k-1k+2ESE + Pk-1 +k+2k+1Km =75 3. 可用于判斷反應(yīng)級(jí)數(shù)：當(dāng)S100Km時(shí)，=Vmax，反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)；當(dāng)0.01KmS100Km時(shí)，為混合級(jí)反應(yīng)。764. Km是酶的特征性常數(shù)：在一定條件下，某種酶的Km值是恒定的，因而可以通過(guò)測(cè)定不同酶（特別是一組同工酶）的Km值，來(lái)判斷是否為不同的酶。5. Km可用來(lái)判斷酶的最適底物：當(dāng)酶有幾種不同的底物存在

24、時(shí)，通過(guò)測(cè)定酶在不同底物存在時(shí)的Km值，Km值最小者，即為該酶的最適底物。77（四）Km和Vmax的測(cè)定： 1. Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法： 782. Hanes作圖法： 79二、溫度對(duì)反應(yīng)速度的影響一般來(lái)說(shuō)，酶促反應(yīng)速度隨溫度的增高而加快。但當(dāng)溫度增加達(dá)到某一點(diǎn)后，由于酶蛋白的熱變性作用，反應(yīng)速度迅速下降，直到完全失活。酶促反應(yīng)速度隨溫度升高而達(dá)到一最大值時(shí)的溫度就稱(chēng)為酶的最適溫度(optimum tempe-rature)。 80酶的最適溫度與實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)，因而它不是酶的特征性常數(shù)。低溫時(shí)由于活化分子數(shù)目減少，反應(yīng)速度降低，但溫度升高后，酶活性又可恢復(fù)。81三、pH對(duì)反應(yīng)

25、速度的影響觀察pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響，通常為一“鐘形”曲線，即pH過(guò)高或過(guò)低均可導(dǎo)致酶催化活性的下降。酶催化活性最高時(shí)溶液的pH值就稱(chēng)為酶的最適pH(optimum pH)。82pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響83人體內(nèi)大多數(shù)酶的最適pH在6.58.0之間。酶的最適pH不是酶的特征性常數(shù)。pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響，其原因主要是由于pH的改變導(dǎo)致了酶的催化基團(tuán)以及底物分子的解離狀態(tài)改變或者導(dǎo)致了酶蛋白的變性。 84四、酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中底物的濃度足夠大時(shí)，酶促反應(yīng)速度與酶濃度成正比，即=kE。0E85六、激活劑對(duì)反應(yīng)速度的影響能夠促使酶促反應(yīng)速度加快的物質(zhì)稱(chēng)為酶的激活劑（activat

26、or）。酶的激活劑大多數(shù)是無(wú)機(jī)離子，如K+、Mg2+、Mn2+、Cl-等。凡能除去抑制劑的物質(zhì)也可以稱(chēng)為激活劑，如EDTA能除去金屬雜質(zhì)。激活劑的作用是相對(duì)的。 86五、抑制劑對(duì)反應(yīng)速度的影響凡是能降低酶促反應(yīng)速度，但不引起酶分子變性失活的物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為酶的抑制劑(inhibitor)。抑制劑具有選擇性，而變性（如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿）沒(méi)有選擇性。按照抑制劑的抑制作用，可將其分為不可逆抑制作用(irreversible inhibition) 和可逆抑制作用(reversible inhibition)兩大類(lèi)。 87抑制劑與酶分子的必需基團(tuán)共價(jià)結(jié)合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等簡(jiǎn)單方法使酶活性恢復(fù)的抑制

27、作用就是不可逆抑制作用。（一）不可逆抑制作用：88酶的不可逆抑制作用分為：專(zhuān)一性抑制(如有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制)；非專(zhuān)一性抑制(如重金屬離子、有機(jī)砷化合物等對(duì)巰基酶的抑制)。89酶的不可逆抑制作用有機(jī)磷化合物膽堿酯酶失活的酶酸路易士氣巰基酶失活的酶酸90（二）可逆抑制作用：抑制劑以非共價(jià)鍵與酶分子可逆性結(jié)合造成酶活性的抑制，且可采用透析等簡(jiǎn)單方法去除抑制劑而使酶活性完全恢復(fù)的抑制作用就是可逆抑制作用。 91可逆抑制作用包括競(jìng)爭(zhēng)性、反競(jìng)爭(zhēng)性、和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制幾種類(lèi)型。 921. 競(jìng)爭(zhēng)性抑制（competitive inhibition)：抑制劑與底物競(jìng)爭(zhēng)與酶的同一活性中心結(jié)合，從而干擾了酶與底

28、物的結(jié)合，使酶的催化活性降低，稱(chēng)為競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。 93競(jìng)爭(zhēng)性抑制的作用模式圖EESIESEIE P+94+IEIk+3酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)模式k-3k+2E + SE + PESk+1k-195競(jìng)爭(zhēng)性抑制的速度方程與圖形特征VmaxKmKmSVmax/2KmVmS = ( 1 + I Ki）+ S96競(jìng)爭(zhēng)性抑制的雙倒數(shù)圖形特征97 競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑往往是酶的底物類(lèi)似物或反應(yīng)產(chǎn)物； 抑制劑與酶的結(jié)合部位與底物與酶的結(jié)合部位相同； 抑制劑濃度越大，則抑制作用越大；但增加底物濃度可使抑制程度減??； 動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km值增大，Vm值不變。 競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特點(diǎn)：98琥珀酸脫氫酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制 競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑有：丙二

29、酸、草酰乙酸等99磺胺類(lèi)藥物對(duì)二氫葉酸合成酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制 對(duì)氨基苯甲酸對(duì)氨基苯磺酰胺100 葉酸分子中含有對(duì)氨基苯甲酸(PABA)。葉酸是合成核酸和蛋白質(zhì)的必需物質(zhì)，也是緬菌生長(zhǎng)繁殖的必要條件之一。許多細(xì)菌需利用PABA來(lái)合成自身所需的葉酸，后者再還原為FH4。磺胺類(lèi)藥物的分子結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)性質(zhì)與PABA相似，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制葉酸合成酶的作用，而阻止葉酸的合成。對(duì)氨基苯甲酸101 甲氧芐氨嘧啶(TMP)能強(qiáng)烈抑制細(xì)菌二氫葉酸還原酶的活性，阻止FH4的生成。所以TMP與磺胺藥合用時(shí)，可增強(qiáng)抗菌作用并減少藥物用量，故稱(chēng)TMP為磺胺藥增效劑。 人體不能合成葉酸，需從外界食物供給；TMP對(duì)人的二氫葉酸還原酶

30、的抑制作用較弱。磺胺藥對(duì)人體FH4的生成影響不大，即毒性較小。1022. 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制（noncompetitive inhibition）：抑制劑既可以與游離酶結(jié)合，也可以與ES復(fù)合物結(jié)合，使酶的催化活性降低，稱(chēng)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。 k-3k+3+IESIk+2E + PESE + Sk+1k-1k-3k+3+IEI+ Sk+1k-1反應(yīng)模式103非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的作用模式圖+ S S+ S S+ESIEIEESEP104非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的速度方程與圖形特征VmSv= (Km + S)( 1 + I Ki）105非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的雙倒數(shù)圖形特征106 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)不一定與底物的分子結(jié)構(gòu)類(lèi)似； 底

31、物和抑制劑分別獨(dú)立地與酶的不同部位相結(jié)合； 抑制劑對(duì)酶與底物的結(jié)合無(wú)影響，故底物濃度的改變對(duì)抑制程度無(wú)影響； 動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km值不變，Vm值降低。 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特點(diǎn)：1073反競(jìng)爭(zhēng)性抑制（uncompetitive inhibition)：抑制劑不能與游離酶結(jié)合，但可與ES復(fù)合物結(jié)合并阻止產(chǎn)物生成，使酶的催化活性降低，稱(chēng)酶的反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。k-3k+3+IESIk+2E + SE + PESk+1k-1反應(yīng)模式108反競(jìng)爭(zhēng)性抑制的作用模式圖+ESESESIEP109反競(jìng)爭(zhēng)性抑制的速度方程與圖形特征VmSv = Km 1 + I Ki1 + I Ki+ S110反競(jìng)爭(zhēng)性抑制的雙倒數(shù)圖形特征111

32、 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)不一定與底物的分子結(jié)構(gòu)類(lèi)似； 抑制劑與底物可同時(shí)與酶的不同部位結(jié)合； 必須有底物存在，抑制劑才能對(duì)酶產(chǎn)生抑制作用；抑制程度隨底物濃度的增加而增加； 動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km減小，Vm降低。反競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特點(diǎn)：112（三）過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物與自殺底物 某種類(lèi)似于一個(gè)酶促反應(yīng)中底物的過(guò)渡態(tài)的物質(zhì)是酶的有效抑制劑，這種物質(zhì)稱(chēng)為過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物。113吡咯-2-羧酸酯具有與脯氨酸過(guò)渡態(tài)相似的三角形結(jié)構(gòu)，是脯氨酸外消旋酶的底物過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物，是脯氨酸外消旋酶的有效抑制劑。 脯氨酸外消旋酶114酶的自殺底物酶的自殺底物是一類(lèi)酶的天然底物的衍生物或類(lèi)似物。在它們的結(jié)構(gòu)中含有一種化學(xué)活性基團(tuán)，當(dāng)酶把它們

33、作為底物來(lái)結(jié)合時(shí)，其潛在的化學(xué)基團(tuán)能被解開(kāi)或激活，并與酶的活性部位發(fā)生共價(jià)結(jié)合，使結(jié)合物停留在某種狀態(tài)，從而不能分解成產(chǎn)物，酶因而致“死”，此過(guò)程稱(chēng)為酶的自殺，這類(lèi)底物稱(chēng)為自殺底物(suicide substrate)。115自殺底物的應(yīng)用自殺底物與天然底物一樣對(duì)人體無(wú)毒或毒性較少，因此有重要藥用價(jià)值。116第五節(jié) 酶活性的調(diào)控一、反饋調(diào)節(jié)117二、變構(gòu)酶(別構(gòu)酶,屬寡聚酶) （結(jié)構(gòu)）除活性中心外,還有別構(gòu)中心(結(jié)合調(diào)節(jié)物或稱(chēng)效應(yīng)劑) 別構(gòu)效應(yīng):調(diào)節(jié)物與別構(gòu)中心結(jié)合引起酶蛋白構(gòu)象變化,使酶活性中心對(duì)底物的結(jié)合和催化作用受影響(改變酶活性),從而改變酶促反應(yīng)速度. 別構(gòu)激活/別構(gòu)抑制 別構(gòu)效應(yīng)劑

34、: 別構(gòu)激活劑:通常為底物或底物類(lèi)似物 別構(gòu)抑制劑:通常為產(chǎn)物118同種效應(yīng)：一分子的配體結(jié)合在蛋白質(zhì)一個(gè)部位影響另一分子同樣配體在另一部位的結(jié)合。異種效應(yīng)是一分子的配體在一個(gè)部位的結(jié)合會(huì)影響另一分子的不同配體在另一部位的結(jié)合。119* 協(xié)同效應(yīng)(cooperativity) 一個(gè)寡聚蛋白質(zhì)的一個(gè)亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個(gè)亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱(chēng)為協(xié)同效應(yīng)。 如果是促進(jìn)作用則稱(chēng)為正協(xié)同效應(yīng) (positive cooperativity)如果是抑制作用則稱(chēng)為負(fù)協(xié)同效應(yīng) (negative cooperativity)120變構(gòu)酶的初速度底物濃度的關(guān)系不符合典型的米氏公式。對(duì)

35、于變構(gòu)酶來(lái)說(shuō)，酶反應(yīng)速度對(duì)底物濃度的變化極為敏感。當(dāng)?shù)孜餄舛劝l(fā)生較小變化時(shí)，變構(gòu)酶可以極大程度地控制著反應(yīng)速度。變構(gòu)酶可以靈敏地調(diào)節(jié)酶反應(yīng)速度。121關(guān)于別構(gòu)效應(yīng)劑的敘述，下列哪項(xiàng)是正確的A.與酶的結(jié)合并不取決于它的濃度B.與調(diào)節(jié)部位的結(jié)合是非共價(jià)的C.能改變底物的結(jié)合常數(shù)，但不改變反應(yīng)速度D.可起第二信使的作用E.總是激活酶的活性122三、共價(jià)調(diào)節(jié)酶 調(diào)節(jié)劑通過(guò)共價(jià)鍵與酶分子結(jié)合,以增減酶分子上的基團(tuán)來(lái)改變酶的活性(高/低,有/無(wú)). 常見(jiàn)類(lèi)型磷酸化與脫磷酸化（最常見(jiàn)）乙?；兔撘阴；谆兔摷谆佘栈兔撓佘栈疭H與SS互變123在各種關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)中，最常見(jiàn)的共價(jià)修飾方式是A.甲基化B

36、.糖基化C.磷酸化D.乙?；疎.去甲基化124 酶的磷酸化與脫磷酸化 -OHThrSerTyr酶蛋白H2OPi磷蛋白磷酸酶 ATPADP蛋白激酶ThrSerTyr-O-PO32-酶蛋白125四、酶原與酶原的激活酶原 (zymogen)有些酶在細(xì)胞內(nèi)合成或初分泌時(shí)只是酶的無(wú)活性前體，此前體物質(zhì)稱(chēng)為酶原。酶原的激活在一定條件下，酶原向有活性酶轉(zhuǎn)化的過(guò)程。126 酶原激活的機(jī)理酶 原分子構(gòu)象發(fā)生改變形成或暴露出酶的活性中心 一個(gè)或幾個(gè)特定的肽鍵斷裂，水解掉一個(gè)或幾個(gè)短肽在特定條件下127胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽腸激酶活性中心胰蛋白酶原的激活示意圖128 酶原激活的生理意義避免細(xì)胞產(chǎn)生的酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自身

37、消化，并使酶在特定的部位和環(huán)境中發(fā)揮作用，保證體內(nèi)代謝正常進(jìn)行。有的酶原可以視為酶的儲(chǔ)存形式。在需要時(shí)，酶原適時(shí)地轉(zhuǎn)變成有活性的酶，發(fā)揮其催化作用。129五、酶合成和降解的調(diào)節(jié)130補(bǔ)充：核酸酶和抗體酶核酶（Ribozyme）抗體酶(abzymes)131核酶的發(fā)現(xiàn)Altman發(fā)現(xiàn)RNase-P的蛋白部分不具催化功能，而RNA部分在有足夠濃度Mg2+離子存在下，能起核酸水解酶的作用。Cech發(fā)現(xiàn)RNA原生動(dòng)物四膜蟲(chóng)的Pre-rRNA是一種具有自催化性能的核酶。證明了核酸既是信息分子，又是功能分子。132核酶的催化性質(zhì)RNA作用于RNA核酸酶催化的反應(yīng)主要包括:水解反應(yīng)(RNA限制性?xún)?nèi)切酶活性)，連接反應(yīng)(聚合酶活性)和轉(zhuǎn)核苷酰反應(yīng)等。最近核酸酶的其他作用底物也已被發(fā)現(xiàn)，如多糖、DNA以及氨基酸酯等。133核酶的藥用前景用核酶藥物治療疾病的原理 選擇性地裂解癌細(xì)胞和病